Production of MCPIP2 protein-specific antibodies

Białko MCPIP2 jest najsłabiej poznanym członkiem rodziny MCPIP. Zaobserwowano, że MCPIP2 ulega czasowej inaktywacji wskutek działania czynników prozapalnych. Obserwacje te wykonane były na komórkach z nadekspresją MCPIP2 i wymagają potwierdzenia na białku endogennym. Wobec braku komercyjnie dostępnych przeciwciał rozpoznających białko MCPIP2, kluczowe jest uzyskanie przeciwciał specyficznych względem tego białka, czego próbę podjęto w niniejszej pracy.Do uzyskania przeciwciał wykorzystano technikę hybrydoma. Rozpoczęto od produkcji antygenu niezbędnego do immunizacji myszy. W tym celu stworzono konstrukt pozwalający na ekspresję antygenu (białka rekombinowanego określanego dalej jako M2Ag) złożonego z krótkich fragmentów białka MCPIP2 i łączników glicynowo‑serynowych, w bakteryjnym systemie ekspresyjnym. Po uzyskaniu konstruktu wprowadzono go do bakterii E. coli szczepu BL21(DE3) i wykonano wstępne testy ekspresji. Po potwierdzeniu produkcji białka zoptymalizowano warunki hodowli bakterii tak, aby ekspresja białka była jak najwyższa. Pomimo optymalizacji i prób zmiany warunków lizy białko M2Ag obecne było w przeważającej ilości we frakcji nierozpuszczalnej – tzw. ciałkach inkluzyjnych. Spowodowało to konieczność rozpuszczania ciałek inkluzyjnych i wymusiło przeprowadzenie procedur oczyszczania w warunkach denaturujących. Dzięki obecności dwóch różnych metek na obu końcach białka możliwe było oczyszczanie z wykorzystaniem dwuetapowej chromatografii powinowactwa. We wstępnym oczyszczaniu wykorzystano metkę histydynową (10xHis), a następnie białko doczyszczono wykorzystując metkę Twin-Strep-tag. Tak uzyskane preparaty charakteryzowały się wysokim stopniem czystości i po dializie oraz zagęszczeniu zostały użyte do immunizacji 4 myszy.Obecność przeciwciał rozpoznających M2Ag w surowicach immunizowanych myszy potwierdzono testami ELISA. Po wyborze jednej z myszy przeprowadzono fuzję splenocytów z komórkami szpiczaka, a pożywki znad hodowli powstałych komórek hybrydoma testowano na obecność przeciwciał specyficznych względem antygenu. Wstępne wyniki wskazują na powodzenie tej procedury. Ponadto, surowica wybranej myszy rozpoznaje nie tylko antygen, ale również białko MCPIP2, co potwierdzono metodą Western Blot wykonaną na lizatach z ludzkiej linii komórkowej z nadekspresją białka MCPIP2.

The MCPIP2 protein is the most obscure member of the MCPIP family. It has been observed that MCPIP2 is temporarily inactivated by pro-inflammatory factors. This was observed in cells overexpressing MCPIP2 and it needs to be confirmed on the endogenous protein. In the absence of commercially available antibodies recognising the MCPIP2 protein, it is crucial to obtain MCPIP2-specific antibodies, which was attempted in this study.The hybridoma technique was used to obtain the antibodies. I began with the production of an antigen indispensable for the immunization of mice. For this purpose, a construct was created to express the antigen (recombinant protein hereafter referred to as M2Ag), consisting of short fragments of the MCPIP2 protein and glycine-serine linkers, in a bacterial expression system. Once the construct was obtained, it was introduced into E. coli bacteria strain BL21(DE3) and preliminary expression assays were performed. Once protein production was confirmed, the bacterial culture conditions were optimised so that protein expression would be the highest attainable. Despite optimisation and attempts to change the lysis conditions, the M2Ag protein was predominantly present in the insoluble fraction - the so-called inclusion bodies. This resulted in the need to dissolve the inclusion bodies and necessitated performing the purification procedures under denaturing conditions. Owing to the presence of two different tags at both ends of the protein, using purification by two-step affinity chromatography was possible. The histidine tag (10xHis) was used in the initial purification, and subsequently the protein was purified using the Twin-Strep-tag. The preparations thus obtained were of high purity and after dialysis and concentration were used to immunize 4 mice.The presence of antibodies recognising M2Ag in the sera of immunized mice was confirmed by ELISA. After selection of one of the mice, fusion of splenocytes with myeloma cells was performed and the culture media of the resulting hybridoma cells were tested for antigen-specific antibodies. The preliminary results indicate the success of this procedure. Furthermore, the serum from the selected mouse recognises not only the antigen but also the MCPIP2 protein, as confirmed by Western Blot analysis performed on lysates from a human cell line overexpressing the MCPIP2 protein.