Development and use of microbiological tests in search of other active against multidrug resistant clinical strains of the genus Staphylococcus

W ramach niniejszej pracy przeprowadzono badania, które miały na celu opracowanie spektrofotometrycznych testów mikrobiologicznych do analizy nowych związków, przeciwbakteryjnych oraz potencjalnych inhibitorów pomp wyrzutu. Podmiotem badań były bakterie z rodzaju Staphylococcus, a dokładniej szczepy kliniczne i referencyjne gatunków S. aureus oraz S. epidermis. W pierwszym etapie badań oceniono wartości minimalnego stężenia hamującego (MIC) wyselekcjonowanych do badań związków. W przeprowadzonych testach MIC związki selenoorganiczne PA-1, PA-6 oraz Ebselen, potwierdziły silne właściwości bakteriobójcze wobec wybranych do badań bakterii z rodzaju Staphylococcus, dlatego w kolejnym etapie zwalidowano i wykonano badania wymienionych związków przy użyciu odczynnika Ellmana. Test ten pozwala na oszacowanie zdolności związków do modyfikacji grup sulfhydrylowych białek, celem określenia potencjalnego mechanizmu działania przeciwbakteryjnego. Potwierdzono, że badane związki selenoorganiczne wykazują silną aktywność modyfikującą grupy sulfhydrylowe, porównywalną lub silniejszą od związku referencyjnego H2O2. W kolejnym etapie wykonano fluorescencyjny test ROS (ang. reactive oxygen species – reaktywne formy tlenu) na szczepach gronkowca złocistego, który określa mechanizm działania przeciwbakteryjnego związku poprzez badanie jego zdolności do wywoływania stresu oksydacyjnego u bakterii. Finalnie przeprowadzono walidację akumulacji bromku etydyny, która umożliwia, dzięki zastosowaniu pomiaru fluorescencji na płytkach wielodołkowych, przesiewowe poszukiwanie nowych potencjalnych inhibitorów pomp wyrzutu. Na początku określono warunki, w których test powinno się wykonać dla wymiernych i istotnych wyników, w tym – oznaczono wartość OD600 czas trwania testu oraz optymalne stężenie bromku etydyny. W kolejnym etapie przeprowadzono testy potencjalnych inhibitorów: kwasu karnozowego oraz związków AK-13 i PI7a. W przypadku ostatniego wymienionego związku otrzymano obiecujące wyniki potwierdzające zdolność do inhibicji pomp aktywnego wyrzutu antybiotyków.

This study has conducted research to develop spectrophotometric microbiological tests for analyzes of new antibacterial compounds or potential efflux pumps inhibitors. The research subjects were Staphylococcus bacteria, more specifically the clinical and reference strains of S. aureus and S. epidermis. In the first stage of the study, minimum inhibitory concentrations (MIC) of selected to this work compounds were determined. PA-1, PA-6 and Ebselen - organoselenium compounds demonstrated strong bactericidal properties in the tests, therefore the subsequent tests and validation of these compounds were carried out using the Ellman reagent. This test allows us to estimate the ability of the compounds to modify sulfhydryl groups of proteins to determine the potential mechanism of antibacterial activity. It has been confirmed that the tested organoselenium compounds exhibited strong sulfhydryl modifying activity, comparable or stronger than the reference H2O2 compound.In the next step, a fluorescent ROS test was performed using Staphylococcus aureus stains, This test determine the mechanism of antimicrobial compounds activity by examining its ability to induce oxidative stress in bacteria. Finally, ethidium bromide accumulation validation was performed, which enables, through the use of fluorescence measurement on multi-plate plates, screening for new potential efflux pumps inhibitors. At first, the conditions under which the test should be performer were determined, including - OD600 value, time and the optimal concentration of ethidium bromide. Next, the potential inhibitors: carnosine acid, compounds AK-13 and PI7a were tested. For compound PI7a, promising results have been obtained, confirming its ability to inhibit drug efflux pump activity pumps.