Determination of high - resolution SDS - gradient electrophoresis for the identification of low molecular weight proteins profiles in urine

Przewlekła choroba nerek obecnie stanowi globalny problem zdrowotny, gdyż dotyka około 500 milionów osób na świecie i systematycznie wzrasta. Zasadniczym problemem są trudności w wykryciu wczesnego stadium choroby, ponieważ zwykle przebiega bezobjawowo. Istnieje konieczność poszukiwania wczesnych markerów choroby oraz powiązania określonych białek występujących w moczu z uszkodzeniami konkretnych struktur nerkowych. Przewlekła choroba nerek to zaburzenie związane z utrzymującymi się powyżej 3 miesięcy nieprawidłowościami budowy bądź czynności nerek. W badaniach laboratoryjnych stwierdza się występowanie GFR ˂60 ml/min/1,73mm2 oraz albuminurię, czyli wydalanie z moczem albumin w ilości ≥30mg/d. Dochodzi także do dysfunkcji cewek nerkowych i białkomoczu innego niż albuminuria. W pracy dokonano identyfikacji białek drobnocząsteczkowych w moczu u pacjentów z białkomoczem cewkowym, korzystając z metody nefelometrycznej, wysokorozdzielczej SDS-elektroforezy gradientowej oraz techniki Western blot. Nefelometrycznie oznaczono stężenie β2-mikroglobuliny w moczu. Wykorzystując rozdziały elektroforetyczne na gradientowych żelach poliakrylamidowych uzyskano profile białkowe moczy i dokonano analizy densytometrycznej w programie DensyGraf®. Uzyskane dane pozwoliły na obliczenie mas cząsteczkowych białek i ich identyfikację. Następnie wykonano Western blot, stosując specyficzne przeciwciała przeciwko cystatynie C i β2-mikroglobulinie, potwierdzając identyfikację cystatyny C. Nie udało się potwierdzić β2-mikroglobuliny ze względu na brak stabilności w warunkach przeprowadzania blottingu. Powyższe badania pozwoliły zaobserwować różnice w stosunkach stężeń poszczególnych białek u pacjentów, co wynika z uszkodzenia różnych obszarów struktur nerkowych. Konsekwencją są różnice w stopniu zaawansowania przewlekłej choroby nerek i rokowaniach. Obiecujące wyniki mogą przynieść badania na szerszą skalę, uwzględniające analizę histopatologiczną. Być może takie postępowanie w przyszłości umożliwi wcześniejsze wykrycie i leczenie przewlekłej choroby nerek.

Currently chronic kidney disease pose a global health problem because it affects around 500 million people in the world and continuously increases. The main problem is the difficulty in detecting the early stage of the disease because it usually goes asymptomatically. There is a necessity of looking for early markers of the disease and link specific urinary proteins to damages of specific kidney structures. Chronic kidney disease is a disorder associated with persistent construction defects or renal function over 3 months. Laboratory tests indicate GFR <60ml/min/1,73m2 and albuminuria that is urinary excretion of albumin in the amount ≥30mg/d. There are also tubular dysfunctions and proteinuria other than albuminuria.In master’s thesis made the identification of low molecular weight urinary proteins in patients with tubular proteinuria using nephelometric method, high-resolution SDS-electrophoresis and Western blot technique. Nephelometrically determined the concentration of β2-microglobulin in urine. Using electrophoretic separations on gradient polyacrylamide gels the urinary protein profiles were given and densitometric analysis was carried out in the DensyGraf® program. The obtained data allowed to calculate the molecular masses of proteins and their identification. Then the Western blot was performed using specific anti-cystatin C and anti- β2-microglobulin antibodies, confirming the identification of cystatin C. β2-microglobulin could not be confirmed due to instability in the blotting conditions.The above studies have allowed to observe differences in the concentration ratios of individual proteins in patients which results from damage to various areas of kidney structures. The consequences are differences in the severity of chronic kidney disease and prognosis. Promising results require further research on a larger scale including histopathological analysis. Perhaps such a course in the future will enable early detection and treatment of chronic kidney disease.