Charakterystyka mikrośrodowiska guzów trzustki poddanych terapii Gemcytabiną i/lub Tarloxotinibem

Opisywane badania miały na celu sprawdzenie skuteczność łączonej terapii przeciwnowotworowej, skierowanej przeciwko PDAC. Chemoterapeutyk Gemcytabina był testowany jako monoterapeutyk, bądź w terapii łączonej z aktywowanym hipoksją pro-lekiem Tarloksotinib, przeciwko mysim guzom trzustki Panc02. Guzy te rosły ortotopowo (po podaniu dotrzustkowym) u mysz typu dzikiego (WT), a także u myszy z brakiem aktywności transkrypcyjnej białka Nrf2 (tKO); badania zostały częściowo opisane w pracy magisterskiej Pani Kingi Stopy, WBBB UJ, 2019: przed podaniem dotrzustkowym, komórki Panc02 poddano transdukcji wektorami lentiwirusowymi tak, aby produkowały lucyferazę oraz białko zielonej fluorescencji, co umożliwiało nieinwazyjne monitorowanie wzrostu guzów za pomocą pomiaru luminescencji. Guzy poddano monoterapii Gemcytabiną (30 mg/kg) bądź w połączeniu z Tarloksotinibem (50 mg/kg), natomiast guzy kontrolne otrzymały placebo.W badaniach opisanych w niniejszej pracy magisterskiej, stosowałam barwienie trichrom według Massona oraz barwienie immunohistochemiczne i analizę ekspresji białek metodą Western blot, w celu dokonania w guzach oceny obecności włókien kolagenu (barwienie trichrom) oraz aktyny mięśni gładkich (ang. alpha smooth muscle actin, -SMA; pozostałe oznaczenia). Użyłam również barwienia hematoksylina/eozyna, aby wykryć zarówno komórkowe (fibroblasty oraz ich prekursory fibrocyty), jak i nie-komórkowe komponenty guza. Uzyskane wyniki wskazują, że połączenie w protokole terapeutycznym Gemcytabiny z Tarloksotinibem zwiększyło zawartość włókien kolagenu w guzach, głównie w części brzeżnej. Ponadto, guzy poddane terapii łączonej, charakteryzowała zwiększona zawartość fibroblastów oraz fibrocytów, w porównaniu do guzów, które poddano monoterapii, lub które otrzymały placebo. Guzy leczone terapią łączoną charakteryzowała też zwiększona hialinizacja (zmiana wsteczna w obrębie tkanki o charakterze innym niż immunologiczny, polegająca na powstawaniu kwasochłonnych depozytów odwodnionych białek) oraz rosnąca dezorganizacja struktury włókien stromy (wzrost organizacji włóknistej struktury guza, np. regularne i równoległe ułożenie włókien kolagenowych, rośnie wraz ze wzrostem złośliwości nowotworu). Guzy rosnące u myszy tKO, które poddano terapii łączonej: Gemcytabina-Tarloksotinib, charakteryzował statystycznie istotny wzrost dezorganizacji włókien stromy, w porównaniu do guzów leczonych wyłącznie Gemcytabiną, bądź takich, których gospodarze otrzymali placebo. Analiza immunohistochemiczna wykazała wzrost ekspresji -SMA w guzach poddanych terapii (monoterapii Gemcytabiną oraz terapii łączonej) w porównaniu do kontroli. Uzyskane wyniki mogą sugerować korzystny wpływ Tarloksotinibu na skuteczność terapii skierowanej przeciwko PDAC.Wykazanie, że mikrośrodowisko PDAC zawiera liczne elementy komórkowe (fibrocyty, fibroblasty) oraz nie-komórkowe (kolageny, hialinę), otwiera potencjalne możliwości terapeutyczne przeciwko guzowi. Z tego względu, poszukiwanie nowych celów terapeutycznych, które poprawią skuteczność terapii Gemcytabiną m.in poprzez stymulację tworzenia fizycznych barier dla wzrostu guza (włókna kolagenowe w częściach brzeżnych guza; depozyty hialiny; „rusztowanie” guza złożone z komórek -SMA-pozytywnych), wydaje się zasadne i cenne naukowo. W świetle opisywanych badań, włączenie pro-leku Tarloksotinibu do standardowej terapii przeciw PDAC z użyciem Gemcytabiny, wydaje się być właściwym podejściem terapeutycznym.Podsumowując, mikrośrodowisko guza może być modulowane przez liczne czynniki komórkowe i nie-komórkowe, które powinny być brane pod uwagę przy projektowaniu nowych, specyficznych terapii przeciwnowotworowych.

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is one of the deadliest malignancies with a 5-year a survival rate lower than 8% owing to its strong resistance to the therapy. Studies show that therapeutic strategies against PDAC should not only target cancer cells, but also the tumor microenvironment: cells of the non-cancerous origin that inhabit the tumor as well as the acellular stromal components. In case of PDAC, tumor microenvironment, which can account for almost 80% of the tumor mass, is distinctive and cannot be easily compared of those of other cancers, with its fibrous, immunosuppressive and hypoxic characteristics.The aim of this study was to test a modulated therapeutic protocol against pancreatic cancer. In order to increase the efficacy of the chemotherapeutic intervention against PDAC: monotherapy with Gemcitabine, and its combination with a hypoxia-inducible pro-drug Tarloxotinib were tested here in two orthotopic mouse models of PDAC. This therapeutic approach was tested in: the wild type (WT) and the whole body Nrf2 transcriptional knockout (tKO) mice (see also: Kinga Stopa, M.Sc. - Thesis, FBBB, 2019). Panc02 cells (transduced with the lentiviral vectors which contained the sequences that encode: luciferase and the green fluorescent protein) were injected into the pancreata of WT or tKO mice. The tumor growth was monitored by the noninvasive luminescence measurements. The mice were treated with Gemcitabine (30 mg/kg) alone, or in a combination with Tarloxotinib (50 mg/kg); the control animals received placebo. In this study, I used Masson’s trichrome staining and immunohistochemistry along with Western blot to investigate the presence of collagen fibers and -SMA in the pancreatic tumor tissues, respectively. I also used Hematoxylin & Eosin staining in order to observe the cellular or non-cellular components of the tumor microenvironment: fibrocytes, fibroblasts and fibers as well as to characterize desmoplastic reaction in these tumors. The obtained results indicate that after the application of Gemcitabine and Tarloxotinib, while the precursor fibrocytes; immature fibers and -SMA expression increase, the amount of mature fibers decreases and the organization of the fibers becomes less orderly. This may suggest that Tarloxotinib increases the efficacy of Gemcitabine against PDAC, as compared to the monotherapy. Considering that the tumor microenvironment has many cellular (fibrocytes, fibroblasts) or non-cellular (collagen) components, it could be a therapeutic target against PDAC. Therefore, targeting hypoxia and using the Nrf2 inhibitors or activators (depending on the context of the disease) could aid the standard tumor therapy with Gemcitabine enhancing the therapeutic effects. To conclude, the tumor microenvironment may be modulated by variety of cellular/acellular components. By taking these possible contributors of the tumor growth into account, we may design better, more specific anticancer therapies in the future.