Identifying folding intermediates in single domain proteins.

Fałdowanie białek jako zagadnienie biochemii i biofizyki strukturalnej można uznać za dojrzałą dziedzinę, nie mniej jednak, wiele zagadnień nie zostało do tej pory dostatecznie wyjaśnionych i wciąż istnieją pewne wątpliwości, a dotyczą one zwłaszcza zjawisk zachodzących bezpośrednio przed oraz po stanie przejściowym (ang. transition state). Głównym celem niniejszej pracy było wyjaśnienie, czy w procesie fałdowania małych globularnych białek istnieją jakiekolwiek stabilne i ustrukturalnione stany pośrednie, a zwłaszcza, czy znajdują się one przed stanem przejściowym. W warunkach natywnych, cząsteczki białek podlegają ciągłemu zwijaniu i rozwijaniu, przechodząc pełną drogę od w pełni zwiniętego, do całkowicie rozwiniętego białka z uwzględnieniem stanu przejściowego oraz stanów pośrednich w tym procesie. Większość cząsteczek znajduje się w natywnym stanie konformacyjnym, ale niewielka ich frakcja zajmuje wszystkie pozostałe możliwe stany o wyższej energii. Dokonując pomiarów wymiany proton-deuter (ang. hydrogen exchange, HX lub hydrogen-deuterium exchange) w zależności od stężenia denaturanta (np. mocznika lub chlorku guanidyny) możemy stwierdzić, że niektóre z protonów grup amidowych zaangażowanych w tworzenie wiązań wodorowych mogą zostać wymienione jedynie podczas gdy łańcuch polipeptydowy białka ulega całkowitemu (globalnemu) rozwinięciu, a inne wymieniają się już gdy ulega on jedynie częściowemu (subglobalnemu) otwarciu. Ta druga grupa dostarcza nam informacji o częściowo zwiniętych stanach pośrednich, niestety jeśli są one mało stabilne, użycie czynnika denaturującego może spowodować, że nie będzie możliwe ich zaobserwowanie podczas eksperymentu. Z tego powodu, postanowiono przeprowadzić eksperymenty HX w obecności stabilizującego osmolitu, jakim jest tlenek trimetyloaminy (TMAO). Przeprowadzone eksperymenty nie wykazały obecności żadnego stanu pośredniego w procesie fałdowania ubikwityny, a jeśli takowe stany istnieją, muszą być niestabilne, lub niewykrywalne z powodu dominujących lokalnych i subglobalnych fluktuacji, zaś sam tlenek trimetyloaminy wykazuje preferencje to stabilizowania cząsteczki białka właśnie na tych dwóch poziomach. Drugim celem pracy było stwierdzenie, czy podczas rozwijania małych białek, takich jak domena src SH3 występują stany pośrednie określane mianem topniejącej globuli (ang. molten globule). Zwykle są one opisywane jako nienatywne stany konformacyjne, zbliżone swoim charakterem do stanu rozwiniętego, jednak posiadające dynamiczne i uwolnione łańcuchy boczne, czym różną się od stanu natywnego. Z tego względu powinny być one łatwo wykrywalne metodami jądrowego rezonansu magnetycznego. Eksperymenty denaturacji termicznej przeprowadzone na tym białku przy pomocy jedno oraz dwu-wymiarowej spektroskopii NMR nie wykazały obecności stanów pośrednich, które można by było zakwalifikować jako topniejące globule.

Protein folding can be considered to be a mature field. However many disagreements still remain in various topics, and they need further exploration. In these studies, we attempt to delineate folding pathways of small proteins focusing on two questions. Are native-like partially structured intermediates present before the rate limiting step? Is final folding event a transition from a wet or dry molten globule to the native state? Under native conditions, protein molecules are constantly unfolding and refolding, cycling from the fully folded or native state through partially unfolded states to the fully unfolded state. The majority of molecules reside in their native state, but small fraction occupies all possible higher energy states. By measuring hydrogen exchange (HX) as a function of denaturant (e.g. urea), one can identify which amide hydrogens are involved in backbone hydrogen bonds that exchange only upon complete or global unfolding, while others exchange via smaller scale sub-global openings. This second class provides information on the partially folded states that we are interested in characterizing. Unfortunately, the use of denaturant can mask weakly stably intermediates, thereby defeating the purpose of the HX measurements. Hence, we measured HX and folding behavior of ubiquitin in presence of stabilizing cosolvent, TMAO. The results of HX experiments on ubiquitin suggest that any pretransition intermediate is either unstable or hidden by local unfolding events, and TMAO promotes protein stability on local and subglobal events. Another class of intermediates, known as the molten globules, are proposed to occur early in the unfolding process of proteins, such as src SH3 and B domain of staphylococcal protein A, MNEI and alpha-lactalbumin. Because molten globules are commonly described to have substantial secondary structure, but with dynamic or solvated side chains, it should be possible to detect them via NMR techniques. We have perform thermal melting experiments using both one-dimensional NMR and HSQC NMR techniques. Thermal melt experiments performed on src SH3 do not provide any significant evidences for existence of the molten globule intermediate during unfolding.