Studies on the nuclear subproteome of human astrocytes derived from NT2 cell line in the facet of the antipsychotic drugs mechanism of action

Ludzkie astrocyty wywodzące się z pluripotencjalnej linii komórkowej NT2 są uznawane za użyteczny model w badaniach neurobiologicznych nad fizjologią komórek układu nerwowego oraz podłożem molekularnym chorób neurodegeneracyjnych. Celem poniższej pracy było poznanie molekularnego mechanizmu działania leków przeciwpsychotycznych (klozapina i risperidon), a w szczególności wpływu tych leków na proteom białek jądrowych astrocytów. Komórki NT2 poddano różnicowaniu do astrocytów przez 28-dniową hodowlę z kwasem retinowym (RA), a następnie utrzymywano komórki w hodowli przez 6 tygodni w celu uzyskania dojrzałych astrocytów. W kolejnym etapie przeprowadzono 72-godzinną stymulację lekami przeciwpsychotycznymi, a następnie wyizolowano jądra komórkowe. Procedura frakcjonowania jąder miała na celu ograniczenie efektu maskowania białek niskokopijnych (takich jak białka regulatorowe) przez te, które występują w komórce w dużej ilości (np. białka strukturalne, enzymy metabolizmy podstawowego). Wykonana została również optymalizacja protokołu przygotowania próbki do pomiarów LC-MS/MS. W tym celu wykorzystano niezróżnicowane komórki NT2, z których wyizolowano białka jądrowe i poddano je oczyszczaniu oraz trawieniu dwiema metodami: FASP oraz S-Trap. Jak wykazano, metody te różnią się między sobą przede wszystkim efektywnością wzbogacania próbek w białka różnych przedziałów jądra. Związane jest to z odmiennością odczynników stosowanych do denaturacji białek i elucji pociętych peptydów. Wykazano, że metoda FASP pozwala zidentyfikować więcej białek jądrowych w tym czynników transkrypcyjnych, które są szczególnie istotne w badaniach molekularnych mechanizmów działania leków. Metoda S-Trap okazuje się być z kolei przydatna przy pozyskiwaniu białek porów i błon jądrowych. Próbki białek jądrowych wyizolowanych z astrocytów, po stymulacji lekami przeciwpsychotycznymi, przygotowano właśnie metodą FASP, jednak wyników nie udało uzyskać się do czasu obrony.

NT2 human pluripotent cells are increasingly recognized as a useful model in neurobiological research on the physiology of nervous system cells and the molecular background of neurodegenerative diseases. The purpose of this work was to describe the molecular mechanisms of action of antipsychotic drugs (clozapine and risperidone) and the effect of these two drugs on the nuclear proteome of astrocytes. For this reason, NT2 cells were differentiated into astrocytes by a 28-day culturing with retinoic acid (RA) followed by for 6 weeks maturation period. After this stage, a 72-hour stimulation with antipsychotic drugs was performed and cell nuclei were isolated. The cell organelle fractionation procedure is aimed to overcome the masking effect of low-copy proteins (such as regulatory proteins) by those found in large amounts in the cell (e.g., structural proteins, basic metabolism enzymes). Optimization was also performed to select the appropriate method for preparing astrocyte nuclear protein samples after drug stimulation for LC-/MS/MS measurements. For this purpose, nuclear proteins were isolated from undifferentiated NT2 cells and subsequently subjected to purification and digestion procedure using two methods: FASP and S-Trap. As it was shown in this work, the methods differ primarily in the efficiency of sample enrichment of nuclear proteins associated with specific nuclear compartments. This is due to the chemical diversity of reagents used for protein denaturation and elution of peptides obtained during digestion. It was also shown that the FASP method allows to identify more nuclear proteins, including transcription factors which are particularly important in the study of molecular mechanisms of drug action. The S-Trap method, in turn, may be particularly useful in obtaining pore proteins and nuclear membrane proteins. Ultimately, samples of nuclear proteins isolated from astrocytes, after stimulation with antipsychotic drugs, were prepared using the FASP method. However, the results could not be obtained until the master’s thesis defense.