Characterization of human malignant melanoma-derived ectosomes

Dostęp do publikacji jest możliwy w Archiwum UJ

Czerniak złośliwy jest agresywnym nowotworem charakteryzującym się szybkim tempem wzrostu i wczesnym pojawianiem się przerzutów. Międzykomórkowy transfer bioaktywnych cząsteczek zachodzący za pośrednictwem mikropęcherzyków błonowych (EVs) jest jednym z czynników sprzyjających progresji nowotworu. Ektosomy, będące jedną z subpopulacji EVs, mogą przenosić kwasy nukleinowe, lipidy oraz białka. Zatem badania dotyczące identyfikacji składników cargo ektosomów uwalnianych przez komórki czerniaka oraz wpływu wywieranego przez nie na komórki docelowe mogą przyczynić się do lepszego poznania molekularnych mechanizmów progresji czerniaka. Celem niniejszej pracy było wykonanie pierwszej proteomicznej i glikomicznej analizy białkowego cargo ektosomów uwalnianych przez cztery linie komórkowe czerniaka skóry (wyprowadzone ze zmian pierwotnych: WM115 i WM793, oraz metastatycznych: WM266-4 i WM1205Lu) oraz linię komórkową czerniaka gałki ocznej (Mel202). Ektosomy wyizolowano z kondycjonowanych pożywek metodą wirowania różnicowego. Następnie, stosując chromatografię cieczową sprzężoną z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS), zidentyfikowano w poszczególnych próbkach od 936 do 1055 białek. Ektosomy były nośnikami wspólnego zbioru białek, głównie błonowych i cytoplazmatycznych, co wynika z mechanizmu ich biogenezy, a także białek charakterystycznych (różnicujących) dla poszczególnych linii komórkowych czerniaka. Wśród zidentyfikowanych białek obecne były te 0 udokumentowanej roli w inwazji i migracji komórek nowotworowych, angiogenezie oraz tworzeniu niszy premetastatycznej, jak również białka antyapoptotyczne, modulujące odpowiedź immunologiczną czy odpowiedzialne za oporność wielolekową. W testach funkcjonalnych (test żywotności Alamar Blue 1 test gojenia ran) obecność ektosomów stymulowała proliferację i promowała migrację docelowych komórek, a efekt ten zależny był od dawki białek ektosomalnych. Stosując lektynoblotting wykazano wzbogacenie ektosomów w A -glikany posiadające przedzielające cząsteczki GlcNAc, reszty fukozy oraz a2,6-wiązane kwasy sialowe, a preferencyjna inkorporacja tych struktur wskazuje na ich rolę podczas sortowania białek do ektosomów. Na powierzchni ektosomów stwierdzono wysoką ekspresję ß1,6-rozga^zionych A-glikanów typu kompleksowego, przedzielającej GlcNAc, a także a2,6-wiązanych kwasów sialowych. Niemniej jednak procent ektosomów wykazujących powierzchniową ekspresję wybranych epitopów cukrowych był niższy niż w przypadku uwalniających je komórek czerniaka. Uzyskane wyniki dostarczyły wstępnych informacji na temat roli wybranych białek i struktur cukrowych w biologii ektosomów (biogenezie, sortowaniu białek oraz interakcjach z komórkami docelowymi) oraz funkcjonalnego wpływu ektosomów na komórki nowotworowe. W ektosomalnym cargo zidentyfikowano również potencjalne markery czerniaka, a możliwość ich wykorzystania w praktyce klinicznej powinna stać przedmiotem przyszłych badań.

Malignant melanoma is an aggressive type of cancer characterized by rapid growth and early metastasis. Intercellular transfer of bioactive molecules by extracellular vesicles (EVs) is one of the factors affecting tumor progression. Ectosomes are subpopulation of EVs and facilitate the transfer of numerous proteins, lipids and nucleic acids. Therefore, studies on ectosomes released by melanoma cells and on their effect exerted on recipient cells are important to better understand the mechanisms of melanoma progression. The aim o f this study was the first proteomic and glycomic analysis o f ectosomes released by four cutaneous melanoma cell lines (derived from primary lesions: WM115 and WM793, and metastatic sites: WM266-4 and WM1205Lu) and uveal melanoma cells (Mel202). Ectosomes were isolated from conditioned media by differential centrifugation. Then, using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC-MS / MS), from 936 to 1055 proteins were identified in individual ectosome samples. Ectosomes were carriers of a common set of proteins (mainly membrane and cytoplasmic, what reflects the mechanism of their biogenesis within the cell membrane) as well as differentiating proteins for given melanoma cell lines. Multiple cancer-related proteins were also identified in ectosomes, including those involved in the invasion and migration o f cancer cells, angiogenesis, premetastatic niche formation, escape from apoptosis, modulation o f the immune response and multidrug resistance. In functional tests (Alamar Blue cell viability assay and wound healing assay) ectosomes stimulated cell proliferation and migration, and the observed effect was dependent on the dose of ectosomal proteins. Lectinblotting revealed the enrichment o f ectosomes in N-glycans having the bisecting GlcNAc molecules, fucose residues and a 2 ,6 -bound sialic acids, and the preferential incorporation of these structures indicates their importance in the process o f protein sorting into ectosomes. On the other hand, cytometric analysis revealed high expression of complex type ß1,6-branched N-glycans, bisecting GlcNAc, as well as a2,6-bound sialic acid on the surface of ectosomes. In addition, the percentages of ectosomes positively stained for given glycoepitopes were lower in comparison to referential staining of melanoma cells. The obtained results provided basic information concerning the role o f particular proteins and glycan structures in ectosome biology (biogenesis, protein sorting and interactions with target cells), and the functional effects exerted by melanoma-derived ectosomes. Potential m elanoma markers have also been identified in the ectosomal cargo, and the possibility o f their use in clinical practice should be the subject o f future research.