Use of fluorescent heme sensors to interrogate sequestration of heme by G-quadruplexes in human embryonic kidney cells

G-kwadrupleksy są specyficznymi strukturami kwasów nukleinowych, tworzącymi się w miejscach bogatych w guaninę. Obecność tych struktur w miejscach rozpoczęcia replikacji, na jednoniciowym DNA powstałym w czasie replikacji czy też w sekwencjach promotorowych, wskazują na ich udział m. in. w regulacji replikacji oraz ekspresji genów. G-kwadrupleksy stabilizowane są przez jednowartościowy jon metalu oraz mogą wiązać się z różnymi drobnocząsteczkowymi ligandami, takimi jak hem. Hem stanowi kofaktor wielu enzymów, jednakże w stanie wolnym promuje powstawanie reaktywnych form tlenu, przez co jest toksyczny dla komórki. G-kwadrupleksy obecne na DNA mogą wiązać hem, dzięki czemu najprawdopodobniej chronią genom komórki przed jego szkodliwym działaniem. Niemniej wiązanie hemu przez G-kwadrupleksy pokazano do tej pory w komórkach tylko pośrednio, przez pomiar ekspresji genów zaangażowanych w metabolizm wspomnianej cząsteczki. W niniejszej pracy podjęto próbę bezpośredniej wizualizacji zdolności do buforowania hemu przez G-kwadrupleksy w linii ludzkich embrionalnych komórek nerki 293 (HEK-293). W tym celu komórki transfekowano oligonukleotydami zdolnymi przyjmować formę G-kwadrupleksów a następnie podawano egzogenny hem i badano jego poziom. Ponieważ stosowane dotychczas metody ilościowe nie pozwalają na łatwe i dokładne oznaczenie poziomu wolnego hemu w komórce, stąd w prezentowanej pracy wykorzystano opracowane niedawno fluorescencyjne sensory wolnego hemu działające w oparciu o zasadę transferu energii rezonansu fluorescencji.Analiza uzyskanych wyników wykazała wyraźny wzrost poziomu wolnego hemu w cytoplazmie komórek stymulowanych 20 µM heminą. W przypadku stymulacji heminą o niższych stężeniach nie wykazano zmian fluorescencji sensorów hemu, co prawdopodobnie jest spowodowane aktywnością oksygenaz hemowych, które odpowiadają za degradację hemu. Wykorzystana technika nie umożliwiła jednak wykazania wiązania wolnego hemu przez G-kwadrupleksy. Może to być związane ze zbyt małą czułością metody lub małym powinowactwem hemu do sztucznie wprowadzonych do komórki G-kwadrupleksów.

G-quadruplexes are specific nucleic acid structures formed by guanine-rich sequences. The presence of these structures at the origin of replication, on single-stranded DNA formed during replication or in promoter sequences, indicate their role in the regulation of replication and gene expression. G-quadruplexes are stabilized by a monovalent metal ion and may bind several small molecules, such as heme. Heme is a cofactor of many enzymes, however free heme promotes the formation of reactive oxygen species and is therefore toxic to the cell. G-quadruplexes present on the DNA are able to bind heme, so they are most likely to protect the cell genome from its harmful effects. The sequestration of heme by G-quadruplexes in living cells was shown only by the analysis of the expression of genes involved in heme metabolism, however. The aim of this study was to visualize direct binding of heme by G-quadruplexes in a human embryonic kidney 293 (HEK-293). Cells were transfected with oligonucleotides that form G-quadruplexes, next the exogenous heme was administered and its level was examined. Since the traditional quantitative methods do not allow for an easy and accurate examination of free heme in a cell, the recently developed fluorescent heme sensors were used in this study.The analysis showed an increase in the level of free heme in the cytoplasm of cells stimulated with 20 µM hemin. When cells were stimulated with lower doses of hemin, no changes in the fluorescence of the heme sensors were shown. This is probably the effect of the activity of heme oxygenases, which are responsible for heme degradation. Unfortunately, the technique used in this study did not show the ability of binding a free heme by G-quadruplexes. The lack of the effect may be due to too low sensitivity of the method or low affinity of heme to introduced G-quadruplexes.