Development of a method for the separation of short-chain fatty acids by capillary electrophoresis with contactless conductivity technique

Nieswoiste zapalenia jelit (IBD, ang. inflammatory bowel disease) to grupa chorób charakteryzująca się nawracającymi epizodami zapalenia przewodu pokarmowego spowodowanymi nieprawidłową odpowiedzią immunologiczną organizmu na mikrobiotę jelitową. Do chorób z tej grupy zaliczane są choroba Leśniowskiego-Crohna i wrzodziejące zapalenia jelita grubego. Dostępne metody diagnostyki obejmują testy endoskopowe oraz badania morfologiczne. Wyniki badań są jednak często niejednoznaczne, dlatego też poszukiwane są inne sposoby diagnostyki. Potencjalnymi markerami chorób IBD mogą być krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe (SCFAs, ang. short chain fatty acids) . Jest to grupa kwasów karboksylowych, zbudowanych z 1-6 węgli, rozmieszczonych w alifatycznym łańcuchu. Do grupy tej zalicza się kwas mrówkowy (C1), kwas octowy (C2), kwas propionowy (C3), kwas masłowy (C4), kwas izomasłowy (C4), kwas walerianowy (C5) oraz kwas izowalerianowy (C5). Celem badania było opracowanie metody rozdzielania krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych techniką elektroforezy kapilarnej z konduktometrią bezkontaktową (CE-C4D). Układ pomiarowy składał się ze zminiaturyzowanego urządzenia do elektroforezy kapilarnej połączonego z detektorem C4D. Działanie detektora opiera się na pomiarze różnic przewodnictwa buforu separacyjnego oraz rozdzielonych analitów. Poszczególne etapy badań obejmowały wybór optymalnego buforu separacyjnego oraz modyfikatora przepływu elektroosmotycznego. Krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe występują w roztworze w postaci anionów, dlatego też konieczne jest odwrócenie przepływu elektroosmotycznego. Opracowana metoda analityczna została wstępnie zwalidowana oraz sprawdzona pod kątem oznaczania kwasów w próbkach biologicznych. Ostatecznie jako optymalny skład buforu wybrano mieszaninę: MES/His 10 mM pH=5,75 + 1% β-cyklodekstryny, a najlepszym sposobem modyfikacji przepływu elektroosmotycznego było pokrywanie wnętrza kapilary 1% roztworem polibrenu. Opracowana metoda CE-C4D pozwoliła na rozdzielenie i oznaczenie dziewięciu kwasów organicznych, w tym SCFAs – kwasu mrówkowego, kwasu octowego, kwasu mlekowego, kwasu propionowego, kwasu masłowego, kwasu izomasłowego, kwasu walerianowego i kwasu izowalerianowego. Granica oznaczalności dla badanych analitów mieściła się w zakresie 0,75 – 3,00 μg/ml. Opracowana metoda jest liniowa w zakresie LOD – 75 μg/ml i z sukcesem została zastosowana do oznaczenia analitów w próbkach kału, a uzyskane wyniki były zbliżone do tych uzyskanych referencyjną metodą CE-UV. Podsumowując, opracowana metoda CE-C4D ma potencjał w analizie próbek kału pochodzących od pacjentów z chorobami IBD, celem wyznaczenia markerów tych chorób.

Inflammatory bowel disease (IBD) is a group of diseases characterized by repetitive episodes of gastrointestinal inflammation caused by an inappropriate immune response to the intestinal microbiota. Diseases in this group include Crohn's disease and ulcerative colitis. Available diagnostic methods include endoscopic tests and morphological studies. However, test results are often inconclusive, so other diagnostic techniques are sought.. Short-chain fatty acids (SCFAs) may be potential markers of IBD. This is a group of carboxylic acids, built from 1-6 carbons, arranged in an aliphatic chain. This group includes formic acid (C1), acetic acid (C2), propionic acid (C3), butyric acid (C4), isobutyric acid (C4), valeric acid (C5) and isovaleric acid (C5).The aim of the study was to develop a method for separating short-chain fatty acids by capillary electrophoresis with contactless conductivity (CE-C4D) technique. The measurement system consisted of a miniaturized capillary electrophoresis device connected to a C4D detector. The detector's operation is based on measuring differences in conductivity of the separation buffer and the separated analytes. The various stages of the study included the selection of the optimal separation buffer and electroosmotic flow modifier. Short-chain fatty acids are present in solution as anions, so it is necessary to reverse the electroosmotic flow. The analytical method developed was initially validated and tested for the determination of acids in biological samples.Finally, a mixture of MES/His 10 mM pH=5.75 + 1% β-cyclodextrin was chosen as the optimal buffer composition, and the best way to modify the electroosmotic flow was to coat the inside of the capillary with 1% polybrene solution. The developed CE-C4D method allowed the separation and determination of nine organic acids, including SCFAs - formic acid, acetic acid, lactic acid, propionic acid, butyric acid, isobutyric acid, valeric acid and isovaleric acid. The limit of quantification is in the range of 0.75 - 3.00 μg/ml. The developed method is linear in the LOD - 75 μg/ml range and was successfully applied to the determination of analytes in fecal samples, and the results obtained were similar to those obtained by the reference CE-UV method.In conclusion, the developed CE-C4D method has potential in the analysis of fecal samples from IBD patients for the determination of IBD markers.