Silencing of the expression of GARP protein in the human immortalized lymphatic endothelial cell line, using lentiviral vectors encoding GARP shRNA.

GARP to białko transbłonowe typu I, które wiąże na powierzchni komórki nieaktywną formę TGFβ, LAP-TGF-β i pośredniczy w aktywacji tego czynnika wzrostu. Wyniki wielu badań pokazują, iż białko to może być potencjalnym celem nowych terapii antynowotworowych. Tematem bieżącej pracy było wyciszenie ekspresji białka GARP w linii komórkowej ludzkiego śródbłonka naczyń limfatycznych - hiLEC. Tak zmodyfikowana linia ma posłużyć do badania roli białka GARP w regulacji odpowiedzi układu odpornościowego przez komórki śródbłonka naczyń limfatycznych. Do wyciszenia ekspresji białka GARP wykorzystano wektory lentiwirusowe, kodujące specyficzne dla GARP shRNA. Sprawdzenia poziomu wyciszenia dokonano na dwóch poziomach, białka oraz mRNA. Procent komórek wykazujących ekspresje białka GARP wyznaczono techniką cytometrii przepływowej, natomiast zmianę ilości specyficznego transkryptu analizowano przy pomocy reakcji real-time PCR. Otrzymano dwie linie komórkowe, w których ekspresja białka GARP na powierzchni jest znacząco obniżona. Ponadto, za pomocą techniki PCR wykazano, że linie te nie są zakażone mykoplazmą.

GARP is a transmembrane protein involved in the binding of the latent form of TGFβ, LAP-TGF-β to the cell surface. It might be used as a potential target for new anti-cancer therapies. The goal of the current work was to silence the expression of GARP protein on the surface of human lymphatic endothelial cell line (hiLEC). This modified cell line, will be used to study the role of GARP in the regulation of the immune response by lymphatic endothelium. To silence the expression, we used lentiviral vectors encoding GARP-specific shRNA. Efficiency of the silencing was checked on two levels, protein and mRNA. The percentage of cells with GARP expression on their surface was evaluated by flow cytometry, whereas the change in the amount of a specific transcript was verified by the real time PCR. Two sublines of hiLECs with significantly decreased GARP expression was obtained. Moreover, using PCR test we confirmed that the obtained cell sublines were not contaminated with mycoplasma.