A novel inhibitor of subtilases from human pathogen Tannerella forsythia

Proteoliza to proces hydrolizy wiązania peptydowego. Jest to proces nieodwracalny, w związku z czym istnieje potrzeba ścisłej kontroli aktywności enzymów proteolitycznych. Jednym z ważniejszych sposobów osiągnięcia tego celu jest wytwarzanie białkowych inhibitorów proteaz. Inhibitory powszechnie występują u eukariontów, natomiast u prokariontów jest ich znacznie mniej, a zwłaszcza u bakterii patogennych. Jednym z wyjątków jest Tannerella forsythia, jeden z kluczowych czynników wywołujących paradontozę. T. forsythia produkuje sześć proteaz o niepowtarzalnej, wielodomenowej strukturze nazwanych proteazami KLIKK. Każda z proteaz jest poprzedzona w genomie otwartą ramką odczytu, kodującą małą lipoproteinę. Podobny układ genów występuje u Staphylococcus aureus, gdzie dwie proteazy, stafopainy tworzą jeden operon z ich specyficznymi inhibitorami białkowymi, stafostatynami.Wobec tego głównym celem pracy było sprawdzenie czy lipoproteina poprzedzająca mirolazę, flipina C jest inhibitorem tej proteazy KLIKK.W tym celu otrzymano rekombinowaną flipinę C i sprawdzono czy hamuje ona mirolazę oraz inne proteazy serynowe. Oddziaływanie flipiny C zhamowanymi proteazami zostało scharakteryzowane poprzez wyznaczenie stechiometrii inhibicji (SI), mechanizmu inhibicji oraz stałej inhibicji (Ki). Otrzymana flipina C była specyficznym inhibitorem subtylaz, ponieważ hamowała tylko mirolazę i subtylizynę Carlsberg, a nie hamowała proteaz z innych rodzin. Flipina C wydajnie hamowała mirolazę z SI wynoszącą 1,4 i Ki równą 9 nM. W przypadku subtylizyny Carlsberg wartości te były znacznie wyższe: SI wynosiło 6,2 a Ki82 nM. Flipina C była odwracalnym i kompetycyjnym inhibitorem obu proteaz.Otrzymane wyniki wykazały, że flipina C jest nowym, białkowym inhibitorem subtylaz.

Proteolysis is a process of hydrolysis of the peptide bonds. It is an irreversible process and therefore there is a need for tight control of proteases activity. One of the most important ways to achieve it is production of proteinaceous inhibitors. Inhibitors are common in eukaryotes, but in prokaryotes they occur very rarely, especially in pathogenic bacteria. However, the exception to this rule is Tannerella forsythia, one of key stone etiological factors of periodontitis. The bacterium produces six proteolytic enzymes sharing a unique multidomain structure named KLIKK proteases. Each enzyme is preceded in the genome by an open reading frame encoding small lipoproteins. A similar arrangement of genes was described for Staphylococcus aureus, where two proteases, staphopains co-expressed with their specific inhibitors, staphostatins. Thus the main aim of this thesis was to check if a lipoprotein preceding mirolase, flipin C is an inhibitor of this KLIKK protease.To achieve it flipin C was obtained as a recombinant protein and it was checked if the lipoprotein could inhibit mirolase and other serine proteases. Then interaction of flipin C with target proteases was analysed by determination of the stoichiometry of inhibition (SI), mechanism of inhibition and inhibition constant (Ki). Obtained flipin C was a specific inhibitor of subtilases, because it inhibited only mirolase and subtilisin Carlsberg, but not other serine proteases from different families. Flipin C effectively inhibited mirolase with SI of 1.4 and Ki equal to 9 nM. For subtilisin these parameters were significantly higher: SI was 6.2 and Ki 82 nM. Flipin C was a reversible and competitive inhibitor of both subtilases.Obtained results showed that flipin C is a novel proteinaceous inhibitor of subtilases.