Use of PCR technique to identify the transcriptional unit of the PG0022 gene and the effect of its deletion on the level of transcription of genes associated with the Type IX Secretion System in Porphyromonas gingivalis

Paradontoza jest chorobą tkanek przyzębia, która nieleczona prowadzi do rozchwiania i utraty uzębienia, a także do powikłań ogólnoustrojowych. Porphyromonas gingivalis to gatunek bakterii beztlenowych, o czarnej pigmentacji, ściśle związanych z rozwojem paradontozy. P. gingivalis jest patogenem poddziąsłowej płytki nazębnej, gdzie jego proliferacja inicjuje rozwój i przyczynia się do postępowania choroby. Bakterie P. gingivalis produkują wiele czynników wirulencji, które ułatwiają kolonizację tkanek gospodarza. Jednym z takich czynników są gingipainy, proteazy powodujące, m.in infiltrację neutrofili prowadząc do przewlekłego krwawienia dziąseł. Czynniki wirulencji są aktywne po przedostaniu się na powierzchnię komórek bakteryjnych, co umożliwia IX System Sekrecji (T9SS). W skład T9SS wchodzi wiele białek, biorących udział w transporcie gingipain i innych białek o charakterze patogennym. Jednym z najważniejszych elementów składowych tegoż systemu jest białko zewnętrznej błony bakteryjnej – PorU. Jest ono odpowiedzialne za hydrolizę domeny CTD od wydzielanych białek, dzięki czemu mogą one spełniać swoje funkcje docelowe. W pierwszym etapie niniejszej pracy zanalizowano wpływ delecji genu kodującego białko PorU na poziom ekspresji mRNA trzech grup transkryptów: niektórych elementów składowych T9SS, jego substratów oraz białek związanych z przekazem sygnału. W tym celu posłużono się metodą pół-ilościową, precyzyjnie analizującą poziom transkryptów w próbie - Real-Time PCR. Na podstawie uzyskanych wyników udało się dowieść, iż delecja genu kodującego białko PorU istotnie wpływa na poziom ekspresji mRNA elementów składowych i regulatorowych T9SS, natomiast nie ma znaczącego wpływu na poziom transkryptów gingipain, głównych czynników wirulencji P. gingivalis. Drugi etap badań obejmował próbę identyfikacji jednostki transkrypcyjnej genu porU (PG0022), w skład której potencjalnie mogą wchodzić geny porU, lptO (PG0023) oraz PG0024. W tym celu wykorzystano jedno z podstawowych narzędzi biologii molekularnej – technikę opartą na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). W niniejszej pracy udało się wykazać, że wyżej wymienione geny tworzą wspólny transkrypt, zatem są częścią jednej jednostki transkrypcyjnej. Podsumowując, uzyskane w niniejszej pracy wyniki mogą stanowić podstawę do prowadzenia dalszych badań w tym kierunku.

Paradontosis is an inflammatory disease of periodontal tissues, which when untreated leads to decay of tooth supporting tissues and tooth loss as well as to systemic complications. Porphyromonas gingivalis is an anaerobic, black-pigmented bacterium closely related to development of periodontitis. It is one of the pathogens present in a subgingival dental plaque and it has a majore influence on the initiation and progression of periodontal disease.P. gingivalis produce many virulence factors that facilitate colonization of host tissues. One of them are proteases - gingipains, causing among others infiltration of neutrophils leading to chronic gums bleeding. Virulence factors are active after exposition on the surface of bacterial cells, due to the Type IX of Secretion System (T9SS). This system consist of many proteins that allow the transport of gingipain and other pathogenic proteins to the cell surface. One of the most important components of this secretion system is the outer membrane-associated protein - PorU. It is responsible for the clevage of the CTD domain from secreted proteins so that they can fulfill their target functions. In the first stage of presented work, the effect of deletion of the gene encoding the PorU protein on the mRNA expression level of the other components of the T9SS, its cargo proteins and its regulatory proteins was analyzed. For this purpose, a semi-quantitative method was used to precisely analyze the level of transcripts in the sample - Real-Time PCR. Based on the obtained results, it was found that the deletion of the gene encoding the PorU protein have significant influence on the expression level of the T9SS components and regulators, but does not significantly affect the level of gingipain transcripts, the major virulence factors of P. gingivalis. The second stage of the studies aimed to identificate the potential transcriptional unit of the porU gene (PG0022). For this purpose, one of the basic tools of molecular biology - a technique based on polymerase chain reaction (PCR) was used. In presented work, it has been shown that porU, lptO (PG0023) and PG0024 genes form a single transcript and are therefore part of one transcription unit. In conclusion, the results obtained in this study may provide the basis for further researches in this field.