Genome editing of rhabdomyosarcoma cells with the CRISPR/Cas9 system

Edytowanie genomu stało się intensywnie badaną dziedziną nauki. Zdolność do precyzyjnego namierzenia sekwencji i trawienia w jej obrębie to głównie cechy obecnie używanych systemów, które mogą znaleźć zastosowanie w badaniu funkcji genów, etiologii chorób czy terapii genowych. System CRISPR/Cas9 (ang. clustered regularly interspaced short palindromic repeats) składa się z dwóch głównych elementów. RNA odpowiadającego za specyficzność i endonukleazy Cas9. W wyniku działania tego narzędzia powstają pęknięcia obu nici DNA, które w komórkach ssaczych mogą być naprawione poprzez: niehomologiczne łączenie końców (ang. non-homologous end joining - NHEJ) i rekombinację homologiczną (ang. homology directed repair – HDR). NHEJ generuje więcej błędów i często skutkuje w insercjach lub delecjach, co może doprowadzić nawet do wyciszenia ekspresji genu. Celem badań było wykorzystanie systemu CRISPR/Cas9 w celu inaktywacji genu SNAI1 w komórkach mięsaka prążkowanokomórkowego (RMS). SNAI1 jest represorem transkrypcji zaangażowanym w przejście epitalialno-mezenchymalne. Jest to proces istotny w rozwoju zarodkowym i progresji nowotworu. RMS jest często występującym u dzieci nowotworem tkanek miękkich. Typ pęcherzykowy nowotworu jest bardziej agresywny i wykazuje zwiększony poziom ekspresji SNAI1. Dlatego celem badań była modyfikacja genetyczna komórek RH30 – typu pęcherzykowego mięsaka prążkowanokomórkowego. Miała ona prowadzić do inaktywacji SNAI1. Przeprowadzono transfekcję komórek RH30, wykorzystując system CRISPR/Cas9 celujący w eksony 1 i 2 genu SNAI1. Wykonano izolację klonów z pojedynczych komórek. Przebadano 50 klonów, poprzez PCR na genomowym DNA w celu detekcji delecji w obrębie genu SNAI1. Poziom białka został zweryfikowany przy pomocy techniki Western blot. Udało się uzyskać jeden heteroalleliczny klon z obniżonym poziomem SNAI1 i zmienionym fenotypem w stosunku do komórek dzikich. Wyprowadzona linia komórkowa wykazuje wyższe tempo proliferacji od komórek typu dzikiego. Jest zdolna do wytworzenia guzów u myszy o podobnej morfologii i tempie wzrostu do guzów od RH30 WT (ang. wild type).

Genetic modifications are very intense developing field of science. Precise targeting and digestion of a sequence of interest are principal features of custom-nucleases which may find application in studying genes function, diseases ethology and gene therapy. CRISPR/Cas9 system consists of two major elements. RNA is responsible for specificity and digestion of the target is being performed by the Cas9 endonuclease. As a result of the enzyme activity we get double strand breaks (DSB), which could be repaired by non-homologous end joining (NHEJ) and homology directed repair (HDR). NHEJ is considered as more error prone and usually result in deletion or insertions. Therefore it might lead to knockout of targeted gene.The aim of our studies was to use CRISPR/Cas9 system to inactivate SNAI1 gene in rhabdomyosarcoma cells. SNAI1 is a repressor of transcription, which is engaged in epithelial-mesenchymal transition, an important process in human development and a deciding step in cancer progression. Rhabdomyosarcoma is a very common soft tissue tumour mostly occurring in children. Two forms of this cancer are known: embryonic and alveolar. The second one is usually more aggressive and displays an increased expression of SNAI1. Therefore the aim of the study was a genetic modification of RH30 alveolar rhabdomyosarcoma cell line. SNAI1 knockout cell line was a desired outcome.Firstly, we generated CRISPR/Cas9 nucleases targeting SNAI1 gene. Next, RH30 cells were transfected with the nucleases targeting SNAI1 gene in exon 1 and exon 2 and, subsequently, single cell clones were isolated. Fifty cell clones were screened. Deletion of SNAI1 gene fragment was evaluated by PCR using genomic DNA. SNAI1 protein expression level was verified by Western blotting. Only one SNAI1 heteroallelic clone with decreased protein level of SNAI1 was detected. The cells from this clone were elongated compared to control cells. Obtained cell line has a higher proliferation potential than wild type cells. It also forms tumours in mice displaying similar morphology and growth rate as RH30 WT.