Rola 25-hydroksycholesterolu w odpowiedzi przeciwwirusowej danio pręgowanego (Danio rerio).

25-hydroksycholesterol (25HC) należy do rodziny pochodnych cholesterolu zwanych oksysterolami. Jego synteza jest aktywowana przez reaktywne formy tlenu (ROS) lub jest katalizowana przez 25-hydroksylazę cholesterolu (CH25H). 25HC wykazuje działanie przeciwwirusowe zarówno przeciw wirusom otoczkowym jak i bezotoczkowym. W niniejszej pracy badano wpływ 25HC na replikację wirusa Tilapia lake virus (TiLV) w larwach danio pręgowanego (Danio rerio). TiLV jest wirusem otoczkowym, którego genom stanowi jednoniciowy RNA o ujemnej polaryzacji. Wirus ten powoduje wysoką śmiertelność w akwakulturze tilapii nilowej (Oreochromis niloticus) na całym świecie. Larwy danio pręgowanego w wieku 2 dni po zapłodnieniu zastymulowano 25HC na 2 godziny przed zakażeniem TiLV. Zarówno stymulację 25HC, jak i infekcję TiLV przeprowadzono poprzez mikroiniekcję do osierdzia larw danio pręgowanego. Analiza poziomu wirusa wykazała, że 25HC hamował replikację TiLV w larwach danio pręgowanego zarówno 24 godz. jak i 48 godz. po zakażeniu (hpi). Poziom wirusa był wyższy 48 hpi w porównaniu do 24 hpi. Otrzymane wyniki pokazują, że 25HC ma właściwości przeciwwirusowe. Aby zbadać wpływ wyłączenia genu ch25hb na odpowiedź przeciwwirusową ryb, prowadzone są prace nad wyprowadzeniem mutantów ch25hb-/- danio pręgowanego przy użyciu metody CRISPR/Cas9. Druga część pracy zawiera wyniki genotypowania larw danio pręgowanego z pokolenia F1 uzyskanego poprzez krzyżowanie samic F0 (które otrzymano z zapłodnionych komórek danio poddanych iniekcji gRNA i Cas9 w celu wygenerowania mutacji w badanym genie) z samcami typu dzikiego (WT). Wyniki tego badania pozwoliły wybrać samice, które przekazywały mutację w genie ch25hb do następnego pokolenia. Samice te zostaną wykorzystane w kolejnych etapach badań prowadzących do wyprowadzenia mutantów ch25hb-/- danio pręgowanego.

25-hydroxycholesterol (25HC) is a member of the family of cholesterol oxidation derivatives named oxysterols. Its synthesis is either activated by reactive oxygen species (ROS) or is catalysed by cholesterol 25-hydroxylase (CH25H). 25HC is known to exert antiviral effects both against enveloped and non-enveloped viruses. In this study, we have tested the impact of 25HC on the replication of Tilapia lake virus (TiLV) in zebrafish (Danio rerio) larvae.TiLV is an enveloped negative-sense single-stranded RNA virus, which causes high mortality rates in Nile tilapia (Oreochromis niloticus) aquaculture around the world. Zebrafish larvae at 2 days post fertilization (dpf) were stimulated with 25HC 2 hours prior to TiLV infection. Both 25HC stimulation and TiLV infection were performed by microinjection into pericardium of zebrafish larvae. Viral load analysis revealed that 25HC inhibited TiLV replication in zebrafish larvae at both 24 h and 48 h post infection (hpi). Viral load was higher at 48 hpi as compared to 24 hpi. Our results demonstrate that 25HC is a potent antiviral agent. To study the effect of knocking out the ch25hb gene on the antiviral response in fish, a mutant zebrafish line ch25hb-/- is being developed by using CRISPR/Cas9 method. The second part of this thesis contains results of the genotyping of zebrafish larvae from F1 generation obtained by crossing F0 females (that have grown from fertilised eggs injected with gRNA and Cas9 in order to generate mutation in gene of interest) with wild type (WT) males. The results of this study allowed to select the females that transferred mutation into the next generation. These females will be used in the next step of developing ch25hb-/- zebrafish mutants.