Production, purification and refolding of PorT and PG1058, protein components of type IX secretion system from Porphyromonas gingivalis

Porphyromonas gingivalis jest Gram-ujemną pałeczką zaangażowaną w patogenezę paradontozy, chronicznej choroby tkanek przyzębia o podłożu immunologicznym. Wśród czynników wirulencji P. gingivalis kluczową rolę w rozwoju choroby pełnią endopeptydazy cysteinowe zwane gingipainami. Transport tych enzymów sekrecyjnych przez zewnętrzną błonę komórkową odbywa się z udziałem systemu sekrecji typu IX (T9SS). Dotychczas udało się zidentyfikować kilkanaście białkowych komponentów kompleksu T9SS, jednak dokładny mechanizm jego działania nie został ustalony. Przedmiotem prezentowanej pracy były dwa białka niezbędne do prawidłowego funkcjonowania systemu T9SS: PorT, integralne białko błony zewnętrznej o strukturze β-baryłki, oraz PG1058, prognozowana lipoproteina związana z błoną zewnętrzną. Oba białka produkowano w bakteryjnym systemie ekspresyjnym i oczyszczano metodami chromatograficznymi. PorT, uzyskiwane w postaci ciałek inkluzyjnych, oczyszczano w warunkach denaturujących, a następnie przeprowadzano do konformacji natywnej w procedurze refoldingu. Optymalne warunki do refoldingu wybrano przy pomocy zestawu iFOLD. Skuteczność procedury weryfikowana była metodą sączenia molekularnego. Opracowany sposób postępowania pozwala na uzyskanie prawidłowo sfałdowanego białka, jednak wymaga optymalizacji ze względu na niską wydajność. PG1058 oczyszczano z frakcji rozpuszczalnej w dwustopniowej procedurze obejmującej chromatografię powinowactwa oraz chromatografię jonowymienną lub sączenie molekularne. Żadna z wypróbowanych kombinacji metod nie umożliwiła uzyskania białka o wysokiej czystości. Koekspresja badanych białek pozwoliła na obserwację pozytywnego wpływu PG1058 na wzrost rozpuszczalności PorT. Obserwowana zmiana w profilu ekspresji PorT pozwala postulować występowanie oddziaływania pomiędzy badanymi białkami w cytoplazmie Escherichia coli.

Porphyromonas gingivalis is a gram-negative rod-shaped bacterium involved in pathogenesis of periodontitis, a chronic inflammatory disease of periodontal tissues. Gingipains, cysteine endopeptidases and major virulence factors secreted by P. gingivalis are of vital importance in the progress of the disease. Translocation of the gingipains through the outer membrane is performed by a novel type of secretion system, T9SS. A number of proteins were identified as T9SS components, yet the exact function of most of them is still unknown. The object of presented work were two proteins from T9SS: outer membrane β-barrel protein PorT and predicted outer membrane-associated lipoprotein PG1058. Both proteins were produced in bacterial expression system and purified by a variety of chromatography techniques. PorT was expressed as inclusion bodies and purified in unfolded state. Later, a refolding procedure was performed to regain native state. Refolding conditions were chosen on the basis of an iFOLD kit experiment. Gel filtration was employed to monitor the efficacy of the procedure. The designed protocol resulted in obtaining properly folded PorT, yet it requires further optimization due to low efficiency. PG1058 was purified in a two-step procedure including immobilized metal affinity chromatography followed by gel filtration or ion exchange chromatography. None of utilized combinations of methods resulted in obtaining protein of high purity. Coexpression experiment enabled the observation of PG1058 influence on PorT solubility. Detected shift in PorT expression profile may indicate to an interaction taking place between examined proteins in the cytoplasm of Escherichia coli.