Regulation of Regnase-3 protein in glioblastoma cell line U251-MG in response to the bacteria Porphyromonas gingivalis

Białko Regnase-3, które jest kodowane przez gen ZC3H12C, należy do rodziny białek Regnase, również znanych jako MCPIP/ZC3H12. Cechą charakterystyczną tego białka jest posiadanie domeny PIN, która nadaje mu aktywność rybonukleazy i możliwość degradacji transkryptów, między innymi transkryptów cytokin prozapalnych. Wcześniejsze badania wykazały, że Reg-3 zmniejsza stan zapalny komórek śródbłonka naczyń krwionośnych i zmienia poziom TNF, IL-8 i IL-6 poprzez regulację czasu półtrwania transkryptów. Od niedawna, Porphyromonas gingivalis jest uważany za ważny czynnik ryzyka rozwoju choroby Alzheimera (AD). Zakażenie P. gingivalis powoduje pojawianie się charakterystycznych dla AD objawów, takich jak upośledzenie funkcji poznawczych, zaburzenie pamięci, ograniczenie uczenia się i akumulacja β-amyloidu. Badania na szczurach wykazały wzrost poziomów IL-6, IL-1 i TNF w hipokampie w odpowiedzi na infekcje.Celem pracy było zbadanie wpływu białka Regnase-3 na stan zapalny w komórkach astrocytomy U251-MG w wyniku infekcji Porphyromonas gingivalis poprzez określenie zmian poziomu transkryptów cytokin prozapalnych IL-6, IL-8, IL-18 i TNF. Aby to osiągnąć przygotowano konstrukt genetyczny zawierający sekwencję kodującą białko Regnase-3, połączone z metką Clover, pod kontrolą indukowanego doksycykliną promotora. Wyprowadzono 3 linie komórkowe, pozwalające na indukowalną nadekspresje Reg-3. Zmierzono poziomy transkryptów cytokin prozapalnych po inkubacji z Porphyromonas gingivalis i w warunkach kontrolnych w liniach komórkowych typu dzikiego i w liniach z wyciszeniem ekspresji genu Zc3h12c. Dodatkowo sprawdzono poziom receptorów TLR2 i TLR 4, które są kluczowe dla interakcji między komórką a LPS i fimbriami Porphyromonas gingivalis, w komórkach U251-MG, SH-SY5Y i KMWT1 przy użyciu metody Western Blot.Wykazano, że zmniejszenie poziomu ekspresji białka Regnase-3 powoduje obniżenie poziomów transkryptów IL-6 i IL-8, co jest sprzeczne z dotychczas opublikowanymi danymi. Dalsze plany polegają na sprawdzeniu, czy otrzymane wyniki są specyficzne dla linii komórkowej U251-MG oraz czy mogą być powtórzone dla innych linii pochodzenia nerwowego. Przeprowadzone badania są istotne dla lepszego zrozumienia procesów zachodzących podczas rozwoju choroby Alzheimera i mogą być przydatne w badaniach nad uzyskiwaniem nowych leków do prowadzenia terapii chorób neurodegeneracyjnych.

Regnase-3 is encoded by the ZC3H12C gene, and belongs to the Regnase family of proteins, also known as MCPIP/ZC3H12. A characteristic feature of this protein is a PIN domain, which gives it ribonuclease activity and the ability to degrade transcripts, including transcripts of pro-inflammatory cytokines. Previous studies have shown that Reg-3 reduces inflammation in vascular endothelial cells and alters TNF, IL-8 and IL-6 levels by regulating the half-life of their transcripts. Recently, Porphyromonas gingivalis has been recognized as an important risk factor for Alzheimer's disease (AD). P. gingivalis infection causes the appearance of AD-specific symptoms such as cognitive impairment, memory loss, reduced learning, and β-amyloid accumulation. Studies in rats have shown increased levels of IL-6, IL-1 and TNF in the hippocampus in response to infection.The aim of this study was to investigate the effect of Regnase-3 on inflammation in U251-MG astrocytoma cells following Porphyromonas gingivalis infection by determining changes in transcript levels of the pro-inflammatory cytokines IL-6, IL-8, IL-18 and TNF. To achieve this, a genetic construct containing the sequence encoding the Regnase-3 fused to the Clover tag was prepared under the control of a doxycycline-induced promoter. Three cell lines with inducible overexpression of Reg-3 were established. The levels of pro-inflammatory cytokine transcripts were measured after incubation with Porphyromonas gingivalis and under control conditions in wild-type cell lines and cell lines with silenced Zc3h12c expression.In addition, the levels of TLR2 and TLR 4 receptors, which are crucial for cell-bacteria interactions with LPS and Porphyromonas gingivalis fimbriae, were checked in U251-MG, SH-SY5Y and KMWT1 cell lines using Western Blot.It was shown that the reduction of Regnase-3 protein expression levels results in reduced levels of IL-6 and IL-8 transcripts, which is contrary to previously published data. Further plans are to see if the results obtained are specific to U251-MG cell line and if these experiments can be repeated for other neuronal cell lines.The conducted research is important for a better understanding of the processes occurring during the development of Alzheimer's disease and may be useful in studies on obtaining new drugs for the treatment of neurodegenerative diseases.