Qualitative and quantitative characteristic of neutrophil extracellular traps produced under the influence of biological factors

Neutrofile stanowią najliczniejszą pulę białych krwinek w organizmie człowieka oraz pierwszą linię obrony przed patogenami. Jednym z mechanizmów stosowanych przez te komórki jest aktywne wyrzucanie sieci zdekondensowanej chromatyny zasocjowanej z białkami o właściwościach bójczych, zwanych neutrofilowymi pułapkami zewnątrzkomórkowymi (ang. Neutrophil Extracellular Traps, NETs).Przeprowadzona optymalizacja metody identyfikacji jakościowej i ilościowej wybranych składników NETs jest niezbędna do szerszych badań nad tymi strukturami. Efektywną produkcję NETs przez neutrofile zapewnia stymulacja estrami forbolu (PMA), natomiast pozyskanie izolowanych fragmentów możliwe jest dzięki wykorzystaniu enzymu restrykcyjnego, jakim jest MNaza. W oznaczeniach ilości DNA w NETs wykorzystano fluorescencyjny znacznik Sytox Green, natomiast do oznaczenia całkowitej ilości białka skorzystano z zestawu MicroBCA protein assay kit. Detekcja wybranych białkowych składników NETs, takich jak: azurocydyna, elastaza, histon 3, kalprotektyna, laktoferyna oraz mieloperoksydaza możliwa była dzięki specyficznym przeciwciałom skierowanym przeciwko tym białkom. Aktywność enzymatyczna elastazy i mieloperoksadazy została oznaczona absorpcjometrycznie z wykorzystaniem substratów, odpowiednio MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA i gwajakolu.W NETs pochodzących od różnych dawców można zaobserwować indywidualne różnice w całkowitej ilości białka oraz DNA, nie są one jednak skorelowane z płcią ani wiekiem.Niektóre czynniki drożdżowe pochodzenia Candida albicans, jak glukany oraz białka ściany komórkowej (CWP) uruchamiają produkcję NETs przez neutrofile. Skład NETs różni się w zależności od wywołującego je czynnika; NETs produkowane pod wpływem CWP charakteryzują się niższym stężeniem białka i DNA, a także bardzo niską aktywnością mieloperoksydazy, co może być spowodowane oddziaływaniem CWP z tym enzymem. NETs produkowane przez neutrofile stymulowane glukanami nie odbiegają składem od stymulowanych PMA.W perspektywie szerszych badań nad NETs w kontekście infekcji drożdżowych, konieczne było stworzenie modelu izolowanych NETs, unieruchomionych na stałym podłożu. Wykorzystanie w tym celu techniki cross-linking jest punktem wyjścia dla dalszych rozważań, metoda ta jednak wciąż wymaga dopracowania.

Neutrophils are the most abundant white blood cells in human organism and the first line of defense against pathogens. One of the mechanisms used by these cells is active releasing fibers of chromatin associated with antimicrobial proteins, called Neutrophil Extracellular Traps (NETs).Optimization of qualitative and quantitative identification of NETs contents, that is essential to further research of these structures, was carried out. NETs are effectively produced by neutrophils stimulated with phorbol ester (PMA) and isolated fragments can be obtained by using restriction enzyme MNase. The amount of DNA was quantified by using fluorescent dye Sytox Green and MicroBCA protein assay kit was used to measure total protein amount. Identification of some protein compounds of NETs, like azurocidin, elastase, histone 3, calprotectin, lactoferrin and myeloperoxidase was done owing to specific antibodies against these proteins. Enzymatic activity of elastase and myeloperoxidase was quantified absorptiometrically with using substrates: MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA and guaiacol, respectively.There are individual differences in total protein amount and DNA amount in NETs among donors and there is no correlation with either age or gender of donors.Some yeast factors isolated from Candida albicans, like glucans and cell wall proteins (CWP) stimulate neutrophils to produce NETs. Composition of NETs differs depending on stimulating factor; there is lower concentration of total protein and DNA amount, as well as very low myeloperoxidase activity in NETs produced after stimulation by CWP, that may be a result of interaction between CWP and this enzyme. NETs produced by neutrophils stimulated with PMA and glucans do not differ significantly.In perspective of further research of NETs in contexts of yeast infections, it was essential to construct a model of isolated NETs immobilized on solid surface. Using cross-linking technique is a starting point to further analysis, but this method must still be improved.