Characterisation of the role of methyltransferase METTL16 in HIV-1 replication

Skojarzona terapia antyretrowirusowa (cART) skutecznie hamuje replikację wirusa HIV 1, jednak nie eliminuje latentnych rezerwuarów, prowadzących do nawrotu wiremii po przerwaniu leczenia. Terapia „shock-and-kill” ma na celu eradykację latentnych rezerwuarów, w której zastosowanie małocząsteczkowych związków odwracających latencję (LRAs), reaktywują latentnego wirusa, umożliwiając rozpoznanie i eliminacje zreaktywowanych komórek przez efektorowe komórki gospodarza. „Shock-and-kill” jest jednak nieskuteczna m.in przez brak LRAs celujących w potranskrypcyjne procesy utrzymujące HIV-1 w latencji. Epitranskrypcyjne modyfikacje RNA regulują różne potranskrypcyjne etapy ekspresji genów, w tym splicing, stabilność RNA i eksport nukleocytoplazmatyczny. Dominującą formą modyfikacji RNA jest modyfikacja N6-metyloadenozyny (m6A), która jest odwracalną modyfikacją deponowaną przez kompleks metylotransferaz METTL3/14 (z ang. „writers”) i usuwaną przez demetylazy ALKBH5 lub FTO (z ang. „erasers”). Zidentyfikowano również kilka białek rozpoznających m6A jak YTHDF1/2/3, YTHDC1/2/3, IGFP2BP (z ang. „readers”), które decydują o losie m6A metylowanego RNA. Inna metylotransferaza o nazwie METTL16, która jest mniej scharakteryzowana, również dodaje metylację m6A na RNA. Modyfikacja m6A na HIV-1 RNA pozytywnie reguluje replikację wirusa, jednak rola METTL16 w tym procesie pozostaje nadal nieznana. Celem niniejszej pracy magisterskiej było zbadanie roli białka METTL16 w regulacji ekspresji genów wirusa HIV-1 z wykorzystaniem technik biotechnologicznych, takich jak produkcja i charakterystyka wektorów lentiwirusowych CRISPR/Cas9 celujących w mettl16, a także HCR RNA-FISH, immunofluorescencja i technika znakowania wirusowego RNA sekwencją MS2. W niniejszej pracy magisterskiej po raz pierwszy pokazano, że METTL16 negatywnie reguluje replikację i reaktywację z latencji wirusa HIV-1. Ponadto ukazano, że METTL16 kolokalizuje z HIV-1 RNA zarówno w jądrze komórkowym, jak i w cytoplazmie natomiast nie potwierdzono bezpośredniego wiązania do HIV-1 RNA. Biorąc pod uwagę złożoną naturę latencji HIV-1, ważne jest, aby dalsze badania skoncentrowały się na dokładnym zrozumieniu mechanizmów działania METTL16. Ostatecznie, te badania mogą prowadzić do opracowania bardziej skutecznych strategii terapeutycznych w leczeniu HIV-1.

Combined antiretroviral therapy (cART) effectively suppresses HIV-1 replication but does not eliminate latent reservoirs, leading to viral rebound after treatment interruption. The "shock-and-kill" therapy aims to eradicate latent reservoirs by using small-molecule latency-reversing agents (LRAs) to reactivate the latent virus, enabling the recognition and elimination of reactivated cells by host effector cells. However, "shock-and-kill" is ineffective partly due to the lack of LRAs targeting post-transcriptional processes that maintain HIV-1 latency.Epitranscriptional RNA modifications regulate various post-transcriptional stages of gene expression, including splicing, RNA stability, and nucleocytoplasmic export. The predominant form of RNA modification is N6-methyladenosine (m6A) modification, which is a reversible modification deposited by the METTL3/14 methyltransferase complex ("writers") and removed by the ALKBH5 or FTO demethylases ("erasers"). Several proteins that recognise m6A, such as YTHDF1/2/3, YTHDC1/2/3, IGFP2BP ("readers"), have also been identified and determine the fate of m6A-methylated RNA. Another methyltransferase, METTL16, which is less characterised, also adds m6A methylation to RNA. The m6A modification on HIV-1 RNA positively regulates viral replication; however, the role of METTL16 in this process remains unknown.The aim of this master's thesis was to investigate the role of METTL16 in the regulation of HIV-1 gene expression using biotechnological techniques such as the production and characterisation of CRISPR/Cas9 lentiviral vectors targeting METTL16, as well as HCR RNA-FISH, immunofluorescence, and viral RNA labelling with the MS2 sequence. In this master's thesis, it was shown for the first time that METTL16 negatively regulates the replication and reactivation of HIV-1 from latency. Furthermore, it was demonstrated that METTL16 co-localizes with HIV-1 RNA both in the cell nucleus and cytoplasm, although direct binding to HIV-1 RNA was not confirmed. Given the complex nature of HIV-1 latency, further research must focus on a thorough understanding of the mechanisms of METTL16 action. Ultimately, these studies may lead to the development of more effective therapeutic strategies for the treatment of HIV-1.