Circadian gene expression of antimicrobial peptides in the nervous system of Drosophila melanogaster

Bezkręgowce do obrony przed patogenami posiadają jedynie wrodzony układ immunologiczny, który błędnie uznawany jest za mniej efektywny niż układ immunologiczny nabyty. Obecne w hemolimfie bezkręgowców białka antydrobnoustrojowe (ang. antimicrobial peptides, AMP) zaskakująco świetnie radzą sobie z wieloma rodzajami patogenów i są do pewnego stopnia specyficzne. AMP występują u niemal wszystkich grup organizmów wliczając w to nawet bakterie. Mechanizm działania AMP opiera się na permabilizacji błony komórkowej patogenu co skutkuje wyciekiem komórkowym i śmiercią patogenu. Ciało tłuszczowe Drosophila melanogaster jest odpowiedzialne za produkcje białek antydrobnoustrojowych w odpowiedzi na rozpoznanie patogenów przez receptory rozpoznające wzorce (ang. pattern recognition receptors, PRR). U D. melanogaster występuje 7 klas AMP: attacyny, drosomycyny, metchnikowiny, dipterycyny, cekropiny, drosocyny i defensyny. Attacyny to najmniejsze z AMP i powstają w odpowiedzi na infekcję bakteriami Gram-ujemnymi. Badania nad białkami antydrobnoutrojowymi są w dziejszych czasach szczególnie ważne ze względu na rosnący problem antybiotykooporności. Układ immunologiczny D. melanogaster podobnie jak wiele innych procesów biochemicznych jest kontrolowany przez zegar biologiczny. Największa aktywność układu immunologicznego jest obserwowana w ciągu nocy. Dlatego, aby uniknąć błędnych wniosków badania nad białkami antydrobnoustrojowymi u D. melanogaster powinny być prowadzone z uwzględnieniem cyklu dobowego. W celu zbadania dobowej ekspresji białek antybakteryjnych w układzie nerwowym Drosophila melanogaster w odpowiedzi na uszkodzenie siatkówki wykonano analizę ekspresji wybranych genów AMP w główkach D. melanogaster metodą qRT-PCR u szczepu dzikiego Canton S (CS), szczepu z wyciszeniem attacyny A we wszystkich komórkach organizmu (AttA) oraz kontroli Valium (Val) po zranieniu siatkówki oka. Przeprowadzono również analizę aktywności lokomotoryczną badanej linii z wyciszeniem attacyny A. Zaobserwowano dobowe zmiany w ekspresji attacyny A z minimum w punkcie czasowym ZT16 i maksimum w ZT20. Uzyskane wyniki wskazują na znaczny wzrost ekspresji wielu z badanych AMP w odpowiedzi na uszkodzenie siatkówki oka D. melanogaster. Ekspresja genu attacyny B u linii z wyciszeniem attacyny A uległa znacznemu zmniejszeniu w porównaniu z szczepem dzikim CS i efekt ten jest istotny statystycznie. W przeciwieństwie do tego pozostałe AMP wykazują trend to większej ekspresji w linii z wyciszeniem attacyny A niż w liniach kontrolnych. U szczepu dzikiego CS można zauważyć również zwiększoną ekspresję attacyny A i B w punkcie czasowym ZT16 czyli w minimum ekspresji attacyny A i B w odpowiedzi na zranienie siatkówki oka, podczas gdy brak jest tego efektu w punkcie czasowym ZT20 czyli w maksimum ekspresji attacyny A i B. Jest to najprawdopodobniej efekt kompensacji, w maksimum ekspresji genu nie może już dojść do dalszego zwiększania jego ekspresji, co jest możliwe w minimum ekspresji danego genu. W przyszłości kolejne badania powinny skupić się na powtórzeniu wykonanych badań z większą liczbą powtórzeń, aby wyeliminować nadmierną wariancję między powtórzeniami.

Invertebrates defend themselves against pathogens using only the innate immune system, which commonly is underestimated and considered to be less effective than the adaptive immune system. The antimicrobial peptides (AMP) found in the invertebrate hemolymph are remarkably efficient dealing with many types of pathogens and can be to some extent specific. AMP are recognized in almost all groups of organisms, even in bacteria. The mechanism of AMP action is based on permabilization of the pathogen's cell membrane, which results in cell leakage and eventually the pathogen cell death. Fat body of Drosophila melanogaster is responsible for the production of antimicrobial peptides in response to pathogen recognition by pattern recognition receptors (PRRs). There are 7 classes of AMP in D. melanogaster: attacin, drosomycin, metchnikovine, diptericin, cecropin, drosocin and defensin. Attacins are smallest AMP and are produced in response to infection with Gram-negative bacteria. Nowadays, studies on antimicrobial peptides are particularly important due to the growing problem of antibiotic resistance.The immune system of D. melanogaster, like many other physiological processes, is controlled by the circadian clock. The highest activity of the immune system is observed during the night. Therefore, in order to avoid erroneous conclusions, studies on antimicrobial peptides in D. melanogaster should include daily cycle perspective.In order to investigate the daily expression of antimicrobial peptides in the Drosophila melanogaster’s nervous system in response to the retinal damage, analyses of the expression of selected AMP genes in D. melanogaster heads were performed using qRT-PCR in; wild-type Canton S strain (CS), experimental strain with attacin A gene silencing in all cells of the organism (AttA) and control strain Valium (Val) after the eye injury. Additionally, analyses of locomotor activity of the AttA strain was carried out. The daily oscillation in attacin A expression was observed with minimum at ZT16 and maximum at ZT20. The obtained results indicate a significant increase in the expression of many tested AMPs in response to the retina damage of D. melanogaster. The Attacin B gene expression in AttA was significantly reduced compared to wild-type CS strain and this difference is statistically significant. In contrast, the remaining AMPs tend to be expressed more in the AttA strain than in control flies. Increased expression of attacin A and B at ZT16, i.e., minima expression of attacin A and B in response to the injury to the retina, can also be observed in wild-type CS strain, while this effect was absent at ZT20, i.e. maxima expression of attacin A and B. Most likely this is an effect of compensation, in the maximum, gene expression cannot be further increased, which is possible in the minimum of expression.In the future, subsequent studies should focus on repeating the performed studies with more repetitions to eliminate excessive variance between repetitions.