Cytometric analysis of T lymphocytes modified with a chimeric antigen receptor against the GD2 surface protein

Celem pracy było ustalenie optymalnych warunków ekspansji limfocytów T z komórek pochodzących z kożuszka leukocytarno-płytkowego krwi obwodowej, a następnie wytworzenie limfocytów T z ekspresją chimerycznego receptora antygenowego skierowanego przeciwko białku GD2 (CAR-T anty-GD2), z wykorzystaniem cytometrii przepływowej w ocenie wyników kolejnych etapów badań. Cytometria przepływowa jest techniką diagnostyczną umożliwiającą m.in rozróżnianie komórek poprzez pomiar fluorescencji ich powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych elementów struktury. Wśród licznych zastosowań metoda ta pozwala na określanie ilości komórek w próbie oraz ich żywotności i identyfikacji fenotypowej.Optymalne wyniki namnażania komórek z kożuszka leukocytarno-płytkowego uzyskano w środowisku IL-7 i IL-15, w którym otrzymano 98,7% komórek CD45+CD3+ w 15. dniu hodowli. Kolejno porównano efektywność ekspansji limfocytów T pod wpływem anty-CD3 i anty-CD28 w postaci wolnej oraz związanej na nanomatrycy (TransAct) lub na kulkach magnetycznych (DynaBeads) w środowisku IL-7 razem z IL-15. Najlepsze wyniki uzyskano podczas użycia TransAct: w ciągu 13 dni 69-krotne zwiększenie liczebności komórek, w tym 89,7% o fenotypie CD3, oraz podczas użycia DynaBeads: 64-krotne zwiększenie liczebności komórek, w tym 73,5% o fenotypie CD3.Aby wytworzyć limfocyty CAR-T anty-GD2 przeprowadzono transdukcję limfocytów T z hodowli w medium IL-7/IL-15 w środowisku DynaBeads z użyciem lentiwirusa zawierającego konstrukt CAR z genem dla przeciwciała anty-GD2 oraz gen oporności na puromycynę. Porównano zastosowanie lentiwirusa niezagęszczonego (2,0 x 106 IFU/mL) i zagęszczonego (1,6 x 106 IFU/200 μL), uzyskując lepsze wyniki z wirusem niezgęszczonym: po 7 dniach hodowla zawierała 7,5% CAR-T anty-GD2, a po 10 dniach 9,9% CAR-T anty-GD2, co dowodzi także zadowalającej stabilności uzyskanej ekspresji receptora CAR. Przeprowadzono selekcję CAR-T anty-GD2 w oparciu o opracowaną krzywą przeżywalności limfocytów T w obecności puromycyny przy wykazanym najniższym stężeniu selekcyjnym 0,5 μg/mL.Wniosek z przedstawionego badania stanowi, że w opracowanych warunkach hodowli i transdukcji monitorowanej z użyciem analizy cytometrycznej można skutecznie wytworzyć limfocyty CAR-T anty-GD2, które po dalszej optymalizacji efektywności transdukcji mogłyby być użyte w celowanej terapii komórkowej w leczeniu zwojaka zarodkowego i innych nowotworów z ekspresją białka GD2.

The aim of this study was to develop optimal expansion protocol of the buffy coat driven T-lymphocytes and to use them to generate the T lymphocytes with the expression of the chimeric antigen receptor recognizing GD2 protein (CAR-T anti-GD2), with the use of the flow cytometry method in assessment of the results of the successive steps of investigations.Flow cytometry is a diagnostic technique that allows the differentiation of cells by measuring the fluorescence of specific cell membrane elements or intracellular structures. Among many applications, it allows to determine the number of cells in a sample, their viability and phenotypic identification.The optimal conditions for culturing T lymphocytes were obtained with the use of IL-7 and IL-15, showing 98,7% of CD45+CD3+ cells in 15th day of the cultivation. Consecutively, T-cell expansion effectiveness was compared with the presence of IL-7 combined with IL-15 and soluble or substrate-bound (TransAct) or magnetic beads-bound (Dynabeads) anti-CD3 and anti-CD28. The best growth was observed with TransAct: 69-fold increase in the cell number in 13-day culture, including 89,7% CD3+ cells. Similarly with DynaBeads, 64-fold increase in the cell number after 13 days, including 73,5% CD3+ cells, was found.In manufacturing CAR-T anti-GD2, T-cells were transduced with the CAR receptor with the use of lentivirus construct carrying the gene encoding CAR receptor with anti-GD2, and puromycin resistance sequence. Application of the non-concentrated virus (2,0 x 106 IFU/mL) and concentrated (1,6 x 106 IFU/200 μL) was compared, revealing better results with non-concentrated form: After 7 days the culture contained 7,5% CAR-T anti-GD2 of all T-lymphocytes, and after 10 days even more, 9,9% CAR-T anti-GD2 cells. This result shows the obtained satisfactory stability of the CAR receptor expression. Selection of cells with expression of the chimeric receptor using puromycin was performed, based on the previously formulated kill curve, when the assessed selection concentration was 0,5 μg/mL.The conclusion of the study was drawn, that using hereby formulated protocol of the culture and transduction, with the flow cytometry monitoring, the CAR-T anti-GD2 cells could be effectively manufactured for the application in the treatment of GD2 possitive tumors, although further optimalizations of the method are necessary.