DNA and RNA staining by Hoechst 33342 under various pH and fixation method conditions

Hoechst 33342 to popularny barwnik fluorescencyjny, który został opracowany w celu barwienia DNA. Oprócz zalet takich jak możliwość barwienia żywych komórek, niski koszt oraz prostota w użytkowaniu, okazuje się, że fluorofory z tej rodziny posiadają cechy, które mogą determinować barwienie RNA w odpowiednich warunkach tzn. niskie pH środowiska oraz odpowiednia metoda utrwalania komórek. Barwienie RNA przez Hoechst 33342 oraz DAPI i Vybrant® DyeCycle™ Violet cechuje się wizualizacją jąderek oraz cytoplazmy. Utrwalenie komórek formaldehydem i umieszczenie próbek w pH = 2 skutkuje zmianą wzoru barwienia Hoechst 33342, który świadczy o wyznakowaniu RNA, jednakże taki sposób występuje jedynie w zakresie emisji 500-580 nm. Utrwalenie komórek metanolem lub etanolem jest warunkiem uzyskania odmiennego wzoru barwienia przy jednoczesnym zastosowaniu niskiego pH w obu analizowanych kanałach. Kolejną zaletą utrwalania komórek alkoholem jest fakt, iż pozwala ona na analizę rozmieszczenia rozlokowanej w jądrze komórkowym heterochromatyny w preparatach umieszczonych w pH neutralnym oraz 4. Zmiana sposobu barwienia może być związana z pojawieniem się protonowanych form barwnika w niskim pH, a takie formy mogą przyczyniać się do zwiększonego powinowactwa do RNA. Fakt tego zjawiska można jeszcze wytłumaczyć bezpośrednim wpływem kwasowego pH na strukturę DNA lub zmianą geometrii cząsteczki barwnika. Potwierdzeniem uzyskanych wyników jest przeprowadzona próba sprawdzająca sposób barwienia Hoechst 33342 w komórkach traktowanych rybonukleazą A.Sprawdzono wpływ EDTA na sposób barwienia Hoechst 33342 i dodanie chelatora ma znaczenie, jest to związane z brakiem jonów dwuwartościowych. Wykazano również że, proces zmiany wzoru barwienia jest w pełni odwracalny. Właściwości DAPI oraz Vybrant® DyeCycle™ Violet świadczą o podobnych cechach, jak w przypadku Hoechst 33342. Barwniki te poddane odpowiednim warunkom mogą wiązać się z RNA.

Hoechst 33342 is a popular fluorescent dye that has been developed to stain DNA. In addition to advantages such as the possibility of staining live cells, low cost and simplicity, it turns out that fluorophores from this family have features that can determine RNA staining under appropriate conditions, i.e. low pH of the environment and a method of cell fixation. RNA staining by Hoechst 33342 and DAPI and Vybrant® DyeCycle™ Violet is characterized by visualization of nucleoli and cytoplasm. Fixation of cells with formaldehyde and placing samples at pH = 2 results in a change in the Hoechst 33342 staining pattern, which is indicated by RNA labeling, however, this way occurs only in the 500-580 nm emission range. Cell fixation with methanol or ethanol is a factor for obtaining a different staining pattern while using low pH in both analyzed channels. Another advantage of using this method of cell fixation is the fact that it allows analysis of the distribution of heterochromatin located in the cell nucleus in preparations placed at neutral pH and 4. Change in the dyeing method may be associated with the appearance of protonated dye forms at low pH and this form of fluorophore may contribute to increased RNA affinity. Another reason for this phenomenon may be the direct effect of acidic pH on the structure of DNA or a change in the geometry of the dye molecule. Confirmation of the results is a test checking the Hoechst 33342 staining method in ribonuclease A treated cells.The effect of EDTA on the staining was checked. The addition of a chelator causes a change in staining cells, it is associated with the absence of divalent ions. It has also been shown that the process of changing the staining pattern is fully reversible. The properties of DAPI and Vybrant® DyeCycle™ Violet testify to similar characteristics as in the case of Hoechst 33342. These dyes subjected to the appropriate conditions can bind to RNA.