Immobilization of ketosteroid dehydrogenases with histidine tag in metal-organic frameworks

Immobilizacja enzymów opisuje potencjalny proces fizycznego lub chemicznego wiązania enzymów na stałym podłożu. Ta wyjątkowo skuteczna procedura wymagana jest do ważnych zastosowań enzymów w medycynie, ochronie środowiska i przemyśle. Powszechnie do immobilizacji enzymów wykorzystywane są takie nośniki jak: krzemionka, tlenki nieorganiczne, biopolimery, nanocząstki. Coraz więcej pojawia się w literaturze informacji na temat wykorzystaniu sieci metalo-organicznych do procesu wiązania enzymów. Wiele tradycyjnych strategii, które zostały zastosowane do stabilizacji enzymów, są kompatybilne z chemią materiałów typu MOF. Dodatkowo wymiary porów i funkcjonalność chemiczna MOF-ów może zostać zoptymalizowana pod kątem enkapsulacji odpowiedniego enzymu do poziomu precyzji, który nie jest osiągalny dla innych materiałów porowatych, takich jak zeolity, czy mezoporowate krzemionki. Właściwości te wyraźnie wyróżniają sieci metalo-organiczne na tle innych związków.Celem pracy było zsyntetyzowanie biokompozytów metodą immobilizacji wiązania powierzchniowego, w których wybrane sieci metalo-organiczne zastosowano jako materiały nośnikowe, natomiast fazę aktywną stanowił w nich enzym AcmB-His. W związku z dużym powinowactwem AcmB-His do jonów Ni2+ i występowaniem w jego strukturze 6 metek histydynowych z grupami funkcyjnymi -NH2, badania przeprowadzono z udziałem struktur Ni-MOF-74 oraz UiO-66-NH2. Następnie po opracowaniu procedury immobilizacji, wyznaczono ilość związanego białka na powierzchni nośników metodą Bradforda i scharakteryzowano powstałe biokompozyty z wykorzystaniem rentgenowskiej dyfraktometrii proszkowej (PXRD), spektroskopii w podczerwieni (IR) i obrazowania SEM. Na samym końcu przeprowadzono testy aktywności biokompozytów w specyficznej dla AcmB-His reakcji Δ1-dehydrogenacji jednego ze związków z grupy 3-ketosteroidów, androst-4-en-3,17-dionu (AD) do androst-1,4-dien-3,17-dionu (ADD) w celu określenia ich aktywności katalitycznych i stabilności operacyjnych. Postęp reakcji katalitycznych obserwowano z wykorzystaniem techniki wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC).

Enzyme immobilization describes the potential process of physically or chemically binding enzymes to a solid substrate. This extremely effective procedure is required for important enzyme applications in medicine, environmental protection and industry. Common supports used for enzyme immobilization include silica, inorganic oxides, biopolymers, and nanoparticles. More and more information is appearing in the literature about the use of metal-organic frameworks for the enzyme binding process. Many traditional strategies that have been used to stabilize enzymes are compatible with the chemistry of MOF-type materials. In addition, the pore dimensions and chemical functionality of MOFs can be optimized to encapsulate the appropriate enzyme to a level of precision that is not achievable with other porous materials, such as zeolites or mesoporous silicas. These properties clearly distinguish metal-organic frameworks to other compounds.The aim of this study was to synthesize biocomposites by surface bond immobilization, in which selected metal-organic frameworks were used as support materials, while the active phase in them was the AcmB-His enzyme. In a view of AcmB-His's high affinity for Ni2+ ions and the presence of 6 histidine tags with -NH2 functional groups in its structure, the study was carried out with Ni-MOF-74 and UiO-66-NH2 structures. Then, after developing the immobilization procedure, the amount of attached protein on the surface of the supports was determined using the Bradford method and the resulting biocomposites were characterized using Powder X-ray Diffractometry (PXRD), Infrared Spectroscopy (IR) and SEM imaging. At the very end, the activity of the biocomposites, in the AcmB-His-specific Δ1-dehydrogenation reaction of one of the compounds of the 3-ketosteroid group, androst-4-ene-3,17-dione (AD) to androst-1,4-dien-3,17-dione (ADD), was tested to determine their catalytic activities and operational stability. The progress of catalytic reactions was observed by using High Performance Liquid Chromatography (HPLC) technique.