Production and purification of K50R mutein of CDKF;1 protein from Arabidopsis thaliana with a GST-tag

Kontrola cyklu komórkowego to kluczowy element regulujący funkcjonowanie komórki eukariotycznej. Jest on w dużym stopniu kontrolowany przez cyklinozależne kinazy serynowo-treoninowe (CDKs, ang. cycline dependent kinases). Rośliny posiadają 8 znanych typów CDK, wśród których dodatkowo wyróżniono grupę kinaz aktywujących CDK (CAKs, ang. CDK activating kinases), do której należą przedstawiciele typów CDKD i CDKF. Badane białko CDKF;1 jest jedynym przedstawicielem swojego typu u Arabidopsis thaliana i posiada aktywność niezależną od cyklin. Zamiana lizyny w pozycji 50 (odpowiadającej za dopasowanie ATP) na argininę tworzy muteinę o obniżonej aktywności fosforylacyjnej. Dzięki tej właściwości CDKF;1 K50R można wykorzystać do testów kinazowych jako niezbędną kontrolę dla białka dzikiego. Ważne jest, aby preparat białkowy cechowała wysoka czystość i stabilność. Próby pozyskania muteiny zawierającej metką histydynową nie dały satysfakcjonujących rezultatów, dlatego celem danej pracy było zbadanie wpływu dołączenia metki GST (ang. glutation S-transferazy, znacznie zwiększającej rozpuszczalność białka rekombinowanego) do N- i C- końców białka CDKF;1 K50R oraz produkcji zrekombinowanego białka w różnych szczepach bakteryjnych.

Cell cycle control is a key element of eukariotic cell functioning regulation. It is mainly controlled by cyclin-dependent kinases that are serine/threonine-specific (CDK). Plants have 8 known types of CDKs among which there is an additionally distinguished group of CDK-activating kinases (CAK), to which belong the representatives of CDKD and CDKF types. The studied protein CDKF;1 is the only representative of its type in Arabidopsis thaliana and it has a cyclin-independent activity. The exchange of lysine 50 (responsible for ATP alignment) for arginine creates a mutein with a lowered phosphorylation activity. Thanks to that property CDKF;1 K50R can be used for kinase tests as a necessary control for the wild type protein. It’s vital that the protein preparate is characterized by high purity and stability. The attempts at acquiring the mutein containing a His-tag didn’t give satisfactory results, hence the goal of this paper was to to study the influence of adding a GST-tag (glutathione S-transferase, significantly increases the solubility of the recombined protein) to N- and C- terminal ends of CDKF;1 K50R protein and producing the recombinant protein in different bacterial strains.