Development of a method for the analysis of organic acids in infant stool samples using a capillary electrophoresis system with a non-contact conductivity detector

Zmiany w stężeniach krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych SCFA oraz kwasu mlekowego i bursztynowego są związane ze zmianami w mikrobiomie jelitowym. Na zmiany w stężeniach SCFA, które należą do produktów fermentacji bakterii jelitowych, już w pierwszych miesiącach życia może wpływać wiele czynników. Sposób porodu, rodzaj przyjmowanego pokarmu, wcześniactwo, przyjmowane antybiotyki czy komplikacje pojawiające się podczas ciąży są jednymi z czynników wpływających na poziomy SCFA u niemowląt. Dokładny wpływ poszczególnych czynników nie został do tej pory jednoznacznie określony. Poszukiwane są więc metody pozwalające na oznaczanie SCFA w próbkach pobranych od niemowląt w sposób nieinwazyjny, w celu prowadzenia dalszych badań, z wykorzystaniem większych grup ochotników. Celem badań było opracowanie metody pozwalającej na analizę kwasów organicznych w próbkach kału pobieranych od niemowląt z wykorzystaniem systemu do elektroforezy kapilarnej z bezkontaktowym detektorem przewodnictwa. Opracowywana metoda miała na celu oznaczenie ilościowe 9 kwasów występujących w próbkach kału niemowląt, kwasu: mrówkowego, bursztynowego, octowego, mlekowego, propionowego, masłowego, izomasłowego, walerianowego oraz izowalerianowego. Badania prowadzono na zminiaturyzowanym układzie do elektroforezy kapilarnej z pojemnościowo sprzężonym bezkontaktowym detektorem konduktometrycznym C4D.Podczas etapu optymalizacji wybrano ostateczny skład buforu separacyjnego: 10 mM MES/His z dodatkiem 1% β-CD; 0,05 mM sperminy i 10% metanolu. Zastosowane dodatki do buforu umożliwiły odwrócenie przepływu elektroosmotycznego oraz rozdzielenie 9 badanych kwasów. Przeprowadzona walidacja metody pozwoliła na wyznaczenie takich parametrów jak: liniowość metody (dla kwasu walerianowego i izowalerianowego w zakresie 10 – 75 µg/ml, a dla pozostałych kwasów w zakresie 5 – 75 µg/ml; R2 > 0,999), LOD (< 2 µg/ml), LOQ (< 6 µg/ml), precyzja (CV < 5%), prawdziwość (<10%) oraz efekt matrycy (w przedziale ±20% wartości oczekiwanych). Następnie opracowana metoda CE-C4D została oceniona przy pomocy modelu RGB. Uzyskany wynik jasności metody wyniósł 58,4% i był zbliżony do wyniku uzyskanego dla porównywanych metod. Opracowana metoda została w ostatnim etapie zastosowana do oznaczenia stężeń kwasów w 9 próbkach pobranych od niemowląt w wieku 1, 2 oraz 3 miesięcy. Uzyskane zakresy stężeń poszczególnych SCFA mieściły się w zakresie fizjologicznym. Założone cele zostały z powodzeniem zrealizowane podczas prowadzonych badań. Opracowana metoda może zostać wykorzystana do oznaczania SCFA w próbkach kału pobranych od niemowląt, co przyczyni się do poszerzenia wiedzy na temat rozwoju mikroflory jelitowej niemowląt.

Changes in the concentrations of short-chain fatty acids (SCFAs), also lactic and succinic acids are associated with changes in the intestinal microbiome. Many factors already in the first months of life can cause changes in the concentrations of SCFAs, which belong to the fermentation products of intestinal bacteria. The way of delivery, type of food consumed, prematurity, antibiotics taken and complications occurring during pregnancy are some of the factors influencing SCFA levels in infants. The exact impact of individual factors has not been clearly determined yet. Therefore, methods are being sought to determine SCFA in samples taken from infants in a non-invasive way, in order to conduct further research using larger groups of volunteers.The aim of the research was to develop a method that will enable analysis of organic acids in stool samples collected from infants, using a capillary electrophoresis system with a non-contact conductivity detector. The developed method aimed to quantitatively determine 9 acids occurring in infant stool samples: formic acid, succinic acid, acetic acid, lactic acid, propionic acid, butyric acid, isobutyric acid, valeric acid and isovaleric acid. The research was carried out on a miniaturized capillary electrophoresis system with a capacitively coupled contactless conductivity detector (C4D).During the optimization stage, the final composition of the separation buffer was selected: 10 mM MES/His with the addition of 1% β-CD; 0.05 mM spermine and 10% methanol. The buffer additives used enabled the reversal of electroosmotic flow and the separation of 9 tested acids. The validation of the method allowed for the determination of parameters such as: linearity of the method (for valeric and isovaleric acid in the range of 10 - 75 µg/ml, and for other acids in the range of 5 - 75 µg/ml; R2>0.999), LOD (< 2 µg/ml), LOQ (< 6 µg/ml), precision (CV < 5%), truthfulness (<10%), and matrix effect (within ±20% of expected values). Then, the developed CE-C4D method was evaluated using the RGB model. The obtained brightness result of the method was 58.4% and it was similar to the result obtained for the compared methods. In the last stage, the developed method was used to determine acid concentrations in 9 samples taken from infants aged 1, 2 and 3 months. The obtained concentration ranges of individual SCFAs were within the physiological range.The assumed goals were successfully achieved during the research. The developed method can be used to determine SCFA in stool samples collected from infants, which will contribute to expanding knowledge about the development of infants' intestinal microflora.