Restoration of TSC2 expression in a cell line model of lymphangioleiomyomatosis and characterization of the novel cell line

Limfangioleiomiomatoza (LAM) jest to choroba nowotworowa należąca do nowotworów typu PEComa. Klasyfikowana jako choroba płuc, dotyka głównie kobiety w wieku rozrodczym. Charakteryzuje się postępującym upośledzeniem pracy płuc, powodowanym przez powstawanie cyst z komórek nieznanego pochodzenia, stopniowo zastępujących poprawnie funkcjonującą tkankę. LAM ma podłoże genetyczne, do jej wystąpienia wymagane są jedynie mutacje genu TSC1 lub TSC2 kodujących białka hamartynę i tuberynę, które w komórce formują kompleks TSC1/2 będący centrum regulacji szlaku kinazy mTOR. Utrata funkcjonalnego kompleksu TSC1/2 powoduje stałą nadaktywność szlaku mTOR, który integruje sygnały pochodzące od zewnętrznych czynników wzrostu, a także stanu energetycznego i dostępności aminokwasów w komórce. Utrata poprawnej regulacji mTOR prowadzi do uniezależnienia wzrostu i proliferacji komórki od zewnętrznych i wewnętrznych sygnałów, promując rozwój nowotworów. Aktualnie terapia LAM zakłada fizjoterapię, stosowanie inhibitora mTOR rapamycyny, a w ciężkich przypadkach przeszczep płuc. Nie są dostępne modele zwierzęce wiernie oddające chorobę LAM. Do badań dostępnych jest kilka linii komórkowych wyprowadzonych od osób chorych na LAM. W ZBchK UJ do badań nad chorobą LAM wykorzystywano powszechnie stosowanie linie: linię modelową LAM 101 TSC2˗/˗ (ludzka angiomyolipoma) oraz utworzoną z niej LAM 103 TSC2+. Ponieważ LAM 103 jest najprawdopodobniej wyprowadzona z pojedynczego klonu, pojawiły się wątpliwości, czy ten fakt nie wpływa na uzyskane wyniki. Z tego względu celem niniejszej pracy było otrzymanie nowej, nieselekcjonowanej klonalnie linii komórkowej LAM z przywróconą ekspresją TSC2, wraz z odpowiednią linią kontrolną, by następnie powtórzyć część doświadczeń równolegle z linią LAM 103 i porównać otrzymane wyniki. Wnioski wyciągnięte z przeprowadzonych porównań sugerują, że znaczny wpływ na właściwości linii LAM 103 miał sposób, w jaki została ona utworzona. Nowo otrzymane linie różnią się fenotypowo od pierwotnego układu. Sugeruje to, że możliwości poprawnego charakteryzowania LAM na podstawie pojedynczych linii komórkowych są bardzo ograniczone, a do ustalonych informacji powinno podchodzić się z ostrożnością. Dodatkowo w pracy posłużono się nowo utworzonym internetowym repozytorium danych o komórkach LAM – LAM CELL ATLAS, by potwierdzić ekspresję dwóch genów mogących stanowić przyszłe cele w terapii LAM.

Lymphangioleiomyomatosis (LAM) is a neoplastic disease belonging to the PEComa type. Classified as a lung disease, it mainly affects women of childbearing age. It is characterized by progressive impairment of lung function, caused by the formation of cysts from cells of unknown origin, gradually replacing normally functioning tissue. LAM has a genetic background, for its occurrence only mutations of the TSC1 or TSC2 genes encoding proteins hamartin and tuberin are required. Those proteins in the cell form the TSC1/2 complex, which is the center of regulation of the mTOR kinase pathway. Loss of the functional TSC1/2 complex results in constant overactivity of the mTOR pathway, which integrates signals from external growth factors as well as energy status and amino acid availability in the cell. Loss of proper mTOR regulation leads to cell growth and proliferation becoming independent of external and internal signals, promoting the development of tumors. Currently, LAM therapy involves physiotherapy, the use of an mTOR inhibitor, rapamycin, and in severe cases involves lung transplantation. Animal models that accurately reflect LAM disease are not available. Several cell lines derived from LAM patients are available for testing. LAM 101 TSC2˗/˗ model line (human angiomyolipoma) and the LAM 103 TSC2+ line created from it were used in experiments conducted at ZBchK UJ. Since LAM 103 is most likely derived from a single clone, doubts have arisen as to whether this fact does not affect the obtained results. Therefore, the aim of this study was to obtain a new, non-clonally selected LAM cell line with restored TSC2 expression, together with an appropriate control line, then to repeat part of the experiments in parallel with the LAM 103 line and compare the obtained results. Conclusions drawn from the conducted comparisons suggest that the way in which LAM 103 line was created had a significant impact on its properties. The phenotypes of newly obtained lines differ significantly from the model lines used so far. This suggests that the possibility to correctly characterize LAM from single cell lines is very limited, and the obtained experimental data should be approached with caution. In addition, the study used the newly created online repository of data on LAM cells – LAM CELL ATLAS, to confirm the expression of two genes that may be future targets for LAM therapy.