Optimization of diagnosis of the hyperinsulinemic hypoglycemia using high throughput sequencing

Wstęp: Hipoglikemia hiperinsulinemiczna (HH) charakteryzuje się niezahamowanym wydzielaniem insuliny, niezależnie od poziomu glikemii. Przedłużająca się hipoglikemia może doprowadzić do do trwałego uszkodzenia mózgu. U źródeł postaci rodzinnej (FHI) leżą mutacje monogenowe. Dotychczas z chorobą skorelowano 12 genów; w zależności od mutacji schorzenie to wymaga różnego postępowania terapeutycznego. W Polsce jest ono modyfikowane w zależności od odpowiedzi pacjenta na stosowane leczenia.. Badania genetyczne wykonuje się w bardzo ograniczonym zakresie, wskutek wysokich kosztów oznaczeń. Celem niniejszej pracy było opracowanie metody umożliwiającej włączenie szeroko zakrojonej analizy genetycznej do diagnostyki HH.Materiały i metody: Badanie przeprowadzono wśród 12 pacjentów z 3 rodzin z HH. Zaprojektowano startery obejmujące wszystkie sekwencje kodujące 12 wybranych genów (ABCC8, KCNJ11,HADH1, GCK, GLUD1, SLC16A1, UCP2, HNF4A, G6PC, SLC37A4, INSR, MEN1) i wystandaryzowano reakcje PCR z ich użyciem. Powielone fragmenty DNA pacjentów następnie poddano wysokoprzepustowemu sekwencjonowaniu nowej generacji z użyciem platformy Ion (LifeTechnologies). Wyniki oceniono z użyciem dedykowanych narzędzi bioinformatycznych.Wyniki: Zaprojektowano badanie obejmujące 12 genów, którego koszty udało się zminimalizować do poziomu akceptowalnego dla potrzeb rutynowej diagnostyki genetycznej. Umożliwi to przyspieszenie postawienia pełnej diagnozy HH oraz wyboru optymalnego leczenia pacjenta. Mutacje patogenne znaleziono w 2 z 3 badanych rodzin. Jedno dziecko zostało dzięki temu zdiagnozowane przed pojawieniem się objawów klinicznych.Podsumowanie: Sekwencjonowanie wysokoprzepustowe można z powodzeniem wdrożyć do standardowej diagnostyki chorób o heterogennym podłożu genetycznym jako metodę przesiewową. Uzyskane wyniki wymagają potwierdzenia za pomocą metod niskoprzepustowych. Badanie wykonane u pojedynczej osoby może jednak prowadzić do uzyskania wyników fałszywych, stąd zaleca się badania kilku osób z rodziny.

Introduction: Hyperinsulinemic hypoglycaemia (HH) is characterised by uninhibited secretion of insulin, regardless on the glucose level. Chronic hypoglycaemia may lead to long-term health consequences, such as permanent brain injury. Familial Hyperinsulinism (FHI) is caused by monogenic defects/mutations. So far, 12 genes were associated with the disease; depending on the mutation, the disease requires different therapeutic approach. In Poland the treatment is modified depending on the patient’s response to the subsequent procedures. Genetic testing is conducted in a very limited scope, due to the high cost of the tests in question. The goal of this paper was to develop a method allowing for including broad genetic analysis to the HH diagnostics.Materials and methodology: The research involved 12 patients from the three families affected with HH. Starters were designed, containing all coding sequences of the 12 selected genes (ABCC8, KCNJ11,HADH1, GCK, GLUD1, SLC16A1, UCP2, HNF4A, G6PC, SLC37A4, INSR, MEN1); PCR reaction were standardised. The replicated fragments of patients’ DNA then underwent new generation high throughput sequencing using the Ion platform (LifeTechnologies). The results were assessed using dedicated bioinformatic tools.Results: A test comprising 12 genes was designed and its costs were brought down to a level acceptable for routine genetic diagnostics. It will allow for speeding up the process of making a full HH diagnosis and the selection of optimal treatment for the patient. The pathogenic mutations were found in 2 out of 3 families. The test allowed one child to be diagnosed before any clinical symptoms appeared.Summary: High throughput sequencing may be successfully used in standard diagnostics of heterogenic genetic diseases as a screening method. The results obtained in the test require confirmation using low throughput methods. Moreover, conducting the test on just one family member may lead to false results, therefore it is recommended to test several family members at once.