Jagiellonian University Repository

Dimeryzacja receptora bradykininy B2 z receptorem dopaminergicznym D2 oraz wpływ oddziaływań pomiędzy nimi na wybrane funkcje komórek śródbłonka

pcg.skipToMenu

Dimeryzacja receptora bradykininy B2 z receptorem dopaminergicznym D2 oraz wpływ oddziaływań pomiędzy nimi na wybrane funkcje komórek śródbłonka

Show full item record

dc.contributor.advisor Guevara Lora, Ibeth [SAP11017332] pl
dc.contributor.author Niewiarowska-Sendo, Anna [USOS95013] pl
dc.date.accessioned 2019-06-17T12:09:19Z
dc.date.available 2019-06-17T12:09:19Z
dc.date.submitted 2019-05-31 pl
dc.identifier.uri https://ruj.uj.edu.pl/xmlui/handle/item/77342
dc.language pol pl
dc.rights Copyright *
dc.rights.uri http://ruj.uj.edu.pl/4dspace/License/copyright/licencja_copyright.pdf *
dc.title Dimeryzacja receptora bradykininy B2 z receptorem dopaminergicznym D2 oraz wpływ oddziaływań pomiędzy nimi na wybrane funkcje komórek śródbłonka pl
dc.title.alternative Dimerization of bradykinin B2 receptor with dopaminergic D2 receptor and the effect of interactions between them on selected functions of endothelial cells pl
dc.type Thesis pl
dc.place Kraków pl
dc.description.physical 154 pl
dc.description.additional Bibliogr. s. 138-154 pl
dc.abstract.pl Receptor bradykininy typu 2 (B2R) oraz receptor dopaminergiczny typu 2 (D2R) są przedstawicielami rodzin receptorów błonowych związanych z białkiem G (GPCR), w obrębie których udokumentowano tworzenie różnych kompleksów oligomerycznych. Dotychczas wykazano, iż zarówno B2R jak i D2R mogą dimeryzować z innymi GPCR i w ten sposób regulować ważne funkcje komórkowe. Jednak jak dotąd nie zbadano, czy receptory te mogą bezpośrednio oddziaływać ze sobą. Wiedza ta może być szczególnie istotna, bowiem B2R i D2R są obecne w wielu komórkach, gdzie warunkują szereg wspólnych procesów. Odgrywają one ważną rolę w śródbłonku naczyń krwionośnych, w którym zaangażowane są między innymi w regulację adhezji leukocytów oraz w kontrolę odpowiedzi komórek śródbłonka na czynniki prozapalne. Podstawowym celem pierwszego etapu pracy było zbadanie dimeryzacji receptora bradykininy B2 z receptorem dopaminergicznym D2 i konsekwencji tego oddziaływania - modulacji odpowiedzi komórkowej związanej z wewnątrzkomórkowymi jonami Ca2+ oraz cyklicznym AMP (cAMP). W oparciu o technikę Overlap extension polymerase chain reaction zaprojektowano plazmidy, zawierające sekwencję kodującą białka fuzyjne receptora bradykininy B2 sprzężonego z zielonym (Citrine) lub czerwonym (mCherry) białkiem fluorescencyjnym. Analiza obrazu uzyskanego przy użyciu mikroskopu konfokalnego pozwoliła ocenić odpowiednią lokalizację tych receptorów w błonie komórek HEK293, transfekowanych tymi plazmidami. Natomiast konkurencyjny test wiązania bradykininy (BK), wyznakowanej radioizotopowo oraz pomiar stężenia jonów Ca2+ potwierdziły prawidłową funkcjonalność uzyskanych receptorów. W dalszych badaniach wykazano konstytutywną kolokalizację receptorów w błonach komórkowych komórek HEK293, kotransfekowanych plazmidami kodującymi B2R oraz D2R, sprzężone z Citrine lub mCherry. Ponadto stwierdzono, iż owa kolokalizacja ulegała istotnemu wzmocnieniu po 5 minutach działania BK lub sumanirolu (SUM), specyficznych agonistów odpowiednio dla B2R i D2R, podczas gdy jednoczesna aktywacja obu receptorów nie miała wpływu na ten parametr. W oparciu o technikę mikroskopii obrazowania czasów życia fluorescencji w połączeniu z rezonansowym przeniesieniem energii fluorescencji stwierdzono tworzenie dimerów pomiędzy receptorem bradykininy i receptorem dopaminergicznym. Oddziaływanie to wzmacniało się pod wpływem agonistów B2R i D2R. Analiza zmian stężenia wewnątrzkomórkowego cAMP oraz jonów Ca2+ wykazała, iż równoczesna stymulacja receptorów prowadziła do zniesienia odpowiedzi charakterystycznej dla D2R oraz B2R po stymulacji komórek swoistymi agonistami. W kolejnym etapie badań sprawdzono wpływ BK i SUM na wybrane funkcje ludzkiej linii komórek śródbłonka pochodzącej z żyły krwi pępowinowej, w których stwierdzono endogenną obecność B2R i D2R. Wykazano, iż jednoczesna aktywacja obu receptorów moduluje adhezję granulocytów do komórek śródbłonka. Bradykinina znacząco wzmacniała adhezję komórek, podczas gdy inkubacja razem z SUM prowadziła do odwrócenia zmian indukowanych przez BK. Efekty te były zależne od czasu inkubacji z agonistami, wykazując przeciwną tendencję po długotrwałej stymulacji. Ponadto w komórkach HUV-EC-C uprzednio aktywowanych czynnikiem martwicy nowotworów α (TNF-α) i kostymulowanych oboma agonistami również stwierdzono zniesienie adhezji granulocytów do komórek śródbłonka. W oparciu o techniki cytometrii przepływowej oraz Western blotting wykazano znaczące zmiany produkcji białek adhezyjnych komórek śródbłonka, takich jak E-selektyna oraz międzykomórkowa cząsteczka adhezyjna 1. Dodatkowo w komórkach preinkubowanych z TNF-α i równocześnie aktywowanych oboma agonistami receptorów, obserwowano zmniejszoną syntezę interleukin 6 i 8 oraz endoteliny 1. Zmianom tym towarzyszyła zwiększona fosforylacja śródbłonkowej syntazy tlenku azotu, prowadząca do wzrostu stężenia NO. Analiza produkcji reaktywnych form tlenu wykazała, iż SUM hamuje efekt indukowany przez BK. Stwierdzono także modyfikacje aktywności enzymów antyoksydacyjnych, takich jak dysmutaza ponadtlenkowa oraz katalaza. Równoczesna stymulacja komórek śródbłonka agonistami B2R i D2R wzmocniła syntezę białek antyapoptotycznych - Bcl-xL i Bcl-2, w stosunku do białka proapoptotycznego Bax oraz obniżała aktywność kaspaz 3 i 7. W oparciu o uzyskane wyniki można postulować, iż modulacja procesów zapalnych oraz oksydacyjno-redukcyjnych w komórkach śródbłonka po równoczesnej aktywacji B2R i D2R może odbywać się za pośrednictwem ścieżek sygnalizacyjnych zależnych od fosforylacji przekaźnika sygnału i aktywatora transkrypcji 3 oraz kinazy białkowej B i kinazy białkowej aktywowanej mitogenem p44/42. Podsumowując, w toku niniejszej pracy udało się po raz pierwszy wykazać powstawanie funkcjonalnego dimeru B2R i D2R w błonie komórek HEK293, którego tworzenie jest regulowane przez specyficznych agonistów tych receptorów. Ponadto obserwowane zmiany w stężeniu wewnątrzkomórkowych jonów Ca2+ oraz cAMP potwierdziły wpływ oddziaływania pomiędzy B2R i D2R na modulację tych szlaków sygnalizacyjnych. W badaniach przeprowadzonych w komórkach śródbłonka wykazano, iż agonista D2R może kontrolować aktywność B2R, prowadząc do zmian w adhezji granulocytów do śródbłonka oraz przeciwdziałając prozapalnym i prooksydacyjnym efektom indukowanym przez BK. Uzyskane wyniki poszerzają wiedzę na temat oddziaływań receptorów B2R i D2R i mogą przyczynić się do lepszego zrozumienia patologii naczyniowych, szczególnie związanych z zaburzeniami zapalnymi, takimi jak miażdżyca. pl
dc.abstract.en Bradykinin receptor type 2 (B2R) and dopamine receptor type 2 (D2R) belong to a superfamily of G protein-coupled receptors (GPCRs), within which the formation of oligomers has been frequently demonstrated. So far, it has been shown that both B2R and D2R can dimerize with other GPCRs and these receptor interactions affect the regulation of important cellular functions. Nevertheless, a direct cooperation between B2R and D2R has not been studied until now. As both these receptors regulate a number of common cellular processes, a knowledge about their interactions may be particularly important. Especially, these receptors play an essential role in the vascular endothelium, where they regulate leukocyte adhesion to the endothelium and control the endothelial cell responses to pro-inflammatory mediators. The main aim of this study was to explore the possible dimerization between bradykinin B2 and dopamine D2 receptors and its consequences in the modulation of cellular response dependent on the intracellular Ca2+- as well as cyclic AMP-dependent pathways, after activation with specific receptor agonists. Based on the overlap extension polymerase chain reaction technique, plasmids, encoding fusion proteins of B2R coupled to the green (Citrine) or to the red (mCherry) fluorescent protein, were designed. Analysis of the confocal microscopy images allowed us to assess the appropriate location of both B2R fusion proteins in the membrane of HEK293 cells, transfected with these plasmids. In turn, a competitive binding test with radiolabeled bradykinin (BK) and the measurement of intracellular Ca2+ concentration confirmed the proper functionality of the obtained receptors. In further studies, a basal co-localization of bradykinin and dopamine receptors on the membrane of HEK293 cells, transiently co-transfected with the plasmids encoding B2R and D2R coupled with Citrine or mCherry, was demonstrated. In addition, that co-localization was found to be significantly enhanced after 5 minutes incubation with BK or sumanirole (SUM), the specific agonists for B2R and D2R, respectively. A simultaneous activation of both receptors did not affect this co-localization. The combination of fluorescence lifetime imaging microscopy and fluorescence resonance energy transfer techniques allowed us to confirm the dimer formation between bradykinin and dopamine receptors. Moreover, that interaction was enhanced by B2R and D2R agonists. The analysis of intracellular cAMP and Ca2+ concentrations in transfected or non-transfected cells showed an abolition of the D2R or B2R characteristic responses after simultaneous stimulation of the receptors. The next stage of the study was carried out on the human endothelial cell line from umbilical cord vein, in which an endogenous expression of B2R and D2R was demonstrated. The influence of BK and SUM on selected endothelial functions in this cellular model was studied. The obtained results showed that simultaneous activation of both receptors modulated the adhesion of granulocytes to endothelial cells. The B2R agonist significantly enhanced the cell adhesion, while the co-activation of both receptors led to a reversal of the BK-induced changes. Those effects were dependent on the time of incubation with agonists, demonstrating an opposite tendency after a long-term stimulation. Moreover, in HUV-EC-C cells, previously activated with tumor necrosis factor α (TNF-α), the granulocytes adhesion to endothelial cells co-stimulated with both agonists was also found to be abolished. At the same time, based on the flow cytometry and Western blotting techniques, significant changes in the expression of endothelial cell adhesion proteins such as E-selectin and intercellular adhesion molecule 1 were demonstrated. In addition, cells pre-incubated with TNF-α showed a decreased production of interleukin 6, interleukin 8 and endothelin 1 after simultaneously activation of both receptors. Those changes were accompanied by an enhanced phosphorylation of endothelial nitric oxide synthase, leading to the increase in NO concentration. Studies on the production of reactive oxygen species indicated that SUM inhibits the effect induced by BK. Changes in the activity of antioxidant enzymes such as superoxide dismutase and catalase were also detected. On the other hand, simultaneous stimulation of endothelial cells with BK and SUM enhanced the expression of genes for antiapoptotic proteins, such as Bcl-xL and Bcl-2, with a significant decrease in the gene expression of the pro-apoptotic protein Bax. The activity of caspases 3 and 7 also decreased. The obtained results suggest the modulation of inflammatory and pro-oxidative processes in endothelial cells under the simultaneous activation of B2R and D2R, that can be attributed to changes in signaling pathways dependent on phosphorylation of signal transducer and activator of transcription 3, protein kinase B and mitogen-activated protein kinase p44/42. In summary, this study demonstrated for the first time the existence of a functional B2R-D2R heterodimer on the membrane of HEK293 cells, with the interaction degree being regulated by the specific agonists of these receptors. In addition, changes in the concentration of intracellular Ca2+ and cAMP confirmed the effect of such interactions on the modulation of signaling pathways characteristic for B2R and D2R. Studies performed on endothelial cells showed a protective role of the D2R agonist in the control of B2R activity, leading to changes in the adhesion of granulocytes to endothelial cells and counteracting the pro-inflammatory and pro-oxidative effects induced by BK. The obtained results deepened the knowledge about the interaction between B2R and D2R receptors and may contribute to a better understanding of vascular pathologies, especially those associated with inflammatory disorders such as atherosclerosis. pl
dc.subject.pl adhezja granulocytów do komórek śródbłonka pl
dc.subject.pl aoptoza pl
dc.subject.pl receptory błonowe związane z białkiem G pl
dc.subject.pl stan zapalny pl
dc.subject.pl stres oksydacyjny pl
dc.subject.en apoptosis pl
dc.subject.en G-protein-coupled receptors pl
dc.subject.en inflammation pl
dc.subject.en granulocyte-endothelial cell adhesion pl
dc.subject.en oxidative stress pl
dc.identifier.callnumber Dokt. 2019/115 pl
dc.contributor.institution Uniwersytet Jagielloński. Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii. Zakład Biochemii Analitycznej pl
dc.contributor.reviewer Ciemierych-Litwinienko, Maria Anna pl
dc.contributor.reviewer Kajta, Małgorzata pl
dc.affiliation Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii : Zakład Biochemii Analitycznej pl
dc.rights.original OTHER; otwarte repozytorium; ostateczna wersja autorska (postprint); w momencie opublikowania; 0 pl
dc.identifier.project ROD UJ / OP pl


Files in this item

This item appears in the following Collection(s)

Copyright Except where otherwise noted, this item's license is described as Copyright