The influence of posttranslational modifications on interaction between histone H3 and Survivin

The influence of posttranslational modifications on ...

Bibliographic description

title:	The influence of posttranslational modifications on interaction between histone H3 and Survivin
alternative title:	Wpływ modyfikacji potranslacyjnych na oddziaływanie między histonem H3 a surwiwiną
author:	Niedziałkowska Ewa
reviewer:	Dziedzicka-Wasylewska Marta , Jerzmanowski Andrzej
advisor:	Czyż Jarosław , Stukenberg Todd
institution:	Jagiellonian University. Faculty of Biochemistry Biophysics and Biotechnology
place of creation:	Kraków
date of submittion :	2014-06-27
pages:	136
callnumber :	Dokt. 2014/123
notes:	Dostęp do publikacji jest możliwy w Archiwum UJ
language:	English
abstract in polish:	Poprawna segregacja chromosomów w trakcie podziału komórkowego wymaga prawidłowego połączenia mikrotubul wrzeciona kinetycznego, powstającego na obu biegunach dzielącej się komórki, z kinetochorami formowanymi w regionie centromerycznym siostrzanych chromatyd. Nieprawidłowości w trakcie tego procesu prowadzą do zaburzeń liczby chromosomów a w konsekwencji do nowotworów i wrodzonych wad rozwojowych. W niniejszej pracy skoncentrowano się na mechanizmach, które są odpowiedzialne za prawidłowy przebieg podziału komórki zwracając szczególną uwagę na potranslacyjne modyfikacje chromatyny. Jedną z kluczowych roli w kontrolowaniu podziału komórki odgrywa kompleks CPC (ang. chromosomal passenger complex). W skład tego kompleksu wchodzi kinaza Aurora B oraz białka regulatorowe: surwiwina, borealina i INCENP (ang, inner centromere protein). Rola Aurory B polega między innymi na kontrolowaniu nieprawidłowo uformowanych połączeń między kinetochorem a mikrotubulami wrzeciona kinetycznego, stąd prawidłowa lokalizacja tego kompleksu jest kluczowa dla funkcji Aurory B. Celem pracy było wyznacznie molekularnych podstaw oddziaływania pomiędzy histonem H3 a surwiwiną oraz roli tego oddziaływania w kierowaniu kompleksu CPC do centromerycznego regionu chromosomu. W badaniach sprawdzono znaczenie fosforylacji treoniny-3 (T3) oraz metylacji i acetylacji lizyny-4 (K4) histonu H3 w oddziaływaniu z surwiwiną. Doświadczenia prowadzono na ludzkiej surwiwinie oraz jej odpowiedniku z Xenopus laevis. W pierwszym etapie pracy scharakteryzowano oddziaływania między histonem H3 a fragmentem kompleksu CPC z Xenopus laevis, na który składały się surwiwina, borealina oraz INCENP (reszty aminokwasowe od 1 do 58). Wyznaczono w warunkach in vitro stałą dysocjacji między N-końcowym fragmentem histonu H3 a kompleksem surwiwina:borealina:fragment INCENP1-58 oraz wykazano, że fosforylacja T3 histonu H3 wzmacnia siłę tego oddziaływania. Następnie określono molekularne podstawy tego oddziaływania wykorzystując krystalografię rentgenowską. Na tym etapie badań skoncentrowano się na ludzkiej surwiwinie i zbadano strukturalne podstawy oddziaływania tego białka z fragmentem histonu H3. Na podstawie uzyskanych struktur krystalicznych kompleksu surwiwiny i histonu H3 oraz analizy porównawczej tych struktur z innymi białkami posiadającymi domenę BIR wykazano, że N-końcowy fragment histonu H3 wiąże się w rowku tworzonym przez aminokwasy ludzkiej surwiwiny W67, D71, E76, L64, które są charakterystyczne dla białek posiadających domenę BIR i wiążących N-końcowe fragmenty białek. Ponadto porównanie struktur surwiwiny z innymi białkami posiadającymi domenę BIR wykazało, że aminokwasy H80, E65 i K62 w ludzkiej surwiwinie są charakterystyczne tylko dla tej surwiwiny pozwalając jej na specyficzne wiązanie N-końcowego fragmentu histonu H3. Znaczenie tych reszt aminokwasowych dla wiązania histonu H3 potwierdzono metodami ukierunkowanej mutagenezy, izotermalnego miareczkowania kalorymetrycznego oraz krystalografii rentgenowskiej. Ze względu na obserwowane różnice w wyznaczonych stałych wiązania ufosforylowanego na T3 histonu H3 przez surwiwiny z Homo sapiens i Xenopus leavis porównano sekwencje aminokwasowe surwiwin z wybranych organizmów modelowych z królestwa zwierząt i grzybów. Pokazano, że w obrębie analizowanych kręgowców, wyłączając ssaki, istnieją dwa warianty surwiwiny. Istotną różnicę między nimi stanowi obecność histydyny lub argininy w pozycji wiążącej ufosforylowaną T3 histonu H3. Za pomocą izotermalnego miareczkowania kalorymetrycznego wykazano in vitro, że ludzka surwiwina z histydyną (H80) w miejscu wiążącym histon H3 wykazuje większą fosfospecyficzność względem zmodyfikowanego histonu H3 w miarę spadku pH otoczenia. Z kolei surwiwina z Xenopus laevis z argininą w miejscu odpowiadającym H80 w ludzkiej surwiwinie cechuje się wzrostem fosfospecyficzności w miarę wzrostu pH otoczenia, przy czym siła wiązania ufosforylowanego fragmentu histonu pozostaje stała w analizowanym zakresie pH. Zademonstrowana odmienna zależność fosfospecyficzności różnych typów surwiwin od pH wyjaśnia początkowo obserwowaną rozbieżność charakterystyk wiązania histonu H3 przez ludzką surwiwnę pomiędzy badaniami in vitro i w hodowlach komórkowych. Ponadto, wykazano też, że temperatura nie ma znaczącego wpływu na fosfospecyficzne wiązanie N-końcowego fragmentu histonu H3 przez ludzką surwiwinę. W ostatnim etapie badań sprawdzono wpływ metylacji i acetylacji K4 histonu H3 w obecności lub braku fosforylacji T3 na oddziaływanie z ludzką surwiwiną. Wykazano, że pojedynczo i podwójnie metylowana K4 nie wpływa istotnie na siłę oddziaływania z surwiwiną oraz nie zmienia jej fosfospecyficzności. Natomiast acetylacja K4, podobnie jak jej potrójna metylacja, zmniejsza siłę wiązania między surwiwiną a potranslacyjnie zmodyfikowanym końcem histonu H3. Opisane w niniejszej pracy badania wyjaśniają rolę potranslacyjnej modyfikacji histonu H3 (fosforylacji T3) oraz surwiwiny w kierowaniu kompleksu CPC do centromerycznego regionu chromosomu. Dzięki przeprowadzonym doświadczeniom poznano molekularne podstawy oddziaływania histonu H3 z surwiwiną oraz wykryto wrażliwość fosfospecyficznego oddziaływania surwiwiny na zmiany lokalnego pH. Badania pokazują też, że potranslacyjne modyfikacje K4 histonu H3 mogą mieć znaczenie w regulacji oddziaływania CPC z chromatyną. Otrzymane wyniki doświadczalne pozwalają na postawienie hipotezy, że lokalne pH chromatyny ma znaczenie w kontroli przebiegu podziału komórkowego. Uzyskane dane pozwalają też na zadanie pytania o sens biologiczny istnienia dwóch wariantów surwiwin o różnej wrażliwości na pH u niższych kręgowców.
abstract in english:	The proper chromosome segregation during cell division requires formation of correct attachments between sister chromatids and microtubules that emanate from the opposite poles of dividing cell. Spindle microtubules attach to the kinetochore a specific site formed at the centromeric region of the chromosome. This process is strictly controlled by various cellular mechanisms and its failure results in aberrant chromosome segregation leading to aneuploidy and in consequence to tumorigenesis or congenital disorders. This doctoral desideration thesis regards mechanisms that are responsible for error-free cell division and focuses on the influence of chromatin posttranslational modifications in the regulation of this process. One of the key components of the regulation mechanisms is a chromosomal passenger complex (CPC), which is essential for genomic stability. The complex controls multiple processes during cell division and, if necessary, responds to errors that occur during mitosis or meiosis. The CPC is composed of four subunits: one enzymatic - kinase Aurora B, and three regulatory: Survivin, Borealin and inner centromere protein (INCENP). Aurora B is responsible for correcting improper kinetochore:microtubules attachments, so the proper localization of the kinase is crucial for its functions. The goal of this work was to determine the molecular basis of the interaction between Survivin and the N-terminal fragment of histone H3 and its role in directing the CPC to the centromeric region of mitotic chromosomes. In the course of experiments the importance of histone H3 phosphorylation on threonine-3 (T3) and methylation or acetylation on lysine-4 (K4) was validated. Studies were carried out on recombinant human and Xenopus laevis Survivins. In the first phase of the studies, the interaction between the N-terminal histone H3 fragment and Xenopus laevis CPC subcomplex composed of Survivin, Borealin and the first 58 amino acids of INCENP was tested. The affinity between the CPC subcomplex and the histone H3 N-terminal tail was determined by the fluorescence polarization assay that showed that phosphorylation on T3 of histone H3 enhanced the strength of measured interaction. The molecular basis of the interaction between Survivin and the histone H3 was determined by the X-ray crystallography in the subsequent phase of my studies. The structures of the complexes of human Survivin (hSurvivin) and the histone H3 peptide were determined and compared with the structures of baculoviral IAP repeat-containing (BIRC) proteins. This comparison revealed that the N-terminal fragment of H3 was bound to the hSurvivin groove formed by residues W67, D71, E76, L64 characteristic for BIRC proteins that bound their binding partners through their N-terminal fragments. Moreover, the comparison of hSurvivin structures with other BIRC proteins showed that hSurvivin H80, E65 and K62 were characteristic of Survivin and were important for histone H3 tail binding. Site-directed mutagenesis, isothermal titration calorimetry (ITC) and X-ray crystallography were used to confirm the importance of the hSurvivin H80, E65 and K62 residues in binding to the N-terminal fragment of H3. The binding characteristics of human and Xenopus laevis Survivins measured by ITC were different. Therefore, in the next step of these studies, Survivin sequences from selected model organisms from Fungi and Animal kingdoms were compared and analyzed to determine the basis for observed differences. The comparison of Survivins' sequences showed that among vertebrates, with exclusion of mammals, there were two variants of the Survivin protein. The presence of a histidine or an arginine in the position corresponding to hSurvivin H80, which binds phosphate from T3 of H3, turned out to be the most significant difference between both variants. As shown by ITC assays, hSurvivin with a histidine in the histone tail binding region was more phosphospecific in the lower values of investigated pH. On the contrary, Survivin from Xenopus laevis with an arginine in the position corresponding to hSurvivin H80 showed different characteristic. It was more phosphospecific as the pH increased, but the binding affinity toward the T3 phosphorylated histone fragment was unchanged within investigated range of pH. The demonstrated different dependence of phosphospecificity in response to pH in various types of Survivin explains the initially observed discrepancy between hSurvivin binding to histone H3 observed in vitro and in-cell studies. It was also shown that temperature had no significant effect on binding of the H3 N-terminal tail by hSurvivin. The influence of methylation and acetylation of K4 of histone H3 on binding by hSurvivin was tested during the final phase of the studies. ITC binding assays showed that the mono- and dimethylation of K4 did not significantly affect the binding affinity of hSurvivin to the modified histone tails and did not influence the hSurvivin phosphospecificity. On the contrary, the trimethylation and acetylation of K4 decreased the affinity of hSurvivin to the histone tail fragments. Findings described in this thesis detail the role of posttranslational modifications of histone H3 and Survivin in targeting the CPC to the inner centromeric region of the chromosome. These studies determined the molecular basis of the histone H3:hSurvivin interaction and showed that the hSurvivin binding to T3-phosphorylated histone H3 is sensitive to pH changes, while Xenopus Survivin-B is less so. They showed that the posttranslational modifications of histone H3 K4 could be a part of a regulatory mechanism which governed the CPC - chromatin interactions. The results presented in this thesis suggest that local pH of chromatin may have a role in controlling cell division. They also prompt questions about the biological significance of two Survivin variants in lower vertebrates.
affiliation:	Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii
type:	dissertation, thesis