Celem pracy dyplomowej było opracowanie metody detekcji G-kwadrupleksów (G4-DNA) w żywych komórkach oraz zbadanie wpływu transfekcji oligonukleotydami DNA tworzącymi G4 na ekspresję oksygenazy hemowej-1. G4-DNA to niekanoniczna drugorzędowa struktura DNA, która wpływa na regulację replikacji, transkrypcji oraz jest zdolna do hamowania działania telomerazy. Hem jak i jego pochodne są w stanie związać się do G-kwadrupleksów. Niektóre pochodne, takie jak N-metylomezoporfiryna IX (NMM), są w stanie stabilizować te struktury, jednak bezpośredni wpływ hemu na ich stabilność nie jest poznany.Do detekcji G-kwadrupleksów użyto NMM, która po utworzeniu kompleksu z G4 wykazuje zwiększone własności fluorescencyjne, natomiast nie wiąże się ona do kanonicznego dwuniciowego DNA. Metoda ta wymagała optymalizacji w celu ustalenia efektywnego stężenia N-metylomezoporfiryny IX, a także czasu inkubacji komórek oraz wykrywalnego stężenia oligonukleotydu G4. Oksygenaza hemowa-1 (HO-1) w warunkach standardowych ulega bardzo niskiej ekspresji, natomiast jest znacznie zwiększona na wskutek indukcji czynnikami takimi jak wzrost stężenia hemu w komórce, pojawienie się stresu oksydacyjnego, hipoksji. HO-1 katalizuje reakcję rozkładu hemu do biliwerdyny, tlenku węgla (II) oraz Fe2+. Hem jest ważnym kofaktorem wielu enzymów, jednak w postaci wolnej jest on toksyczny dla komórki, dlatego też musi być efektywnie usuwany. Wyniki wskazują na możliwość zastosowania NMM jako sondy do detekcji G-kwadrupleksów DNA w żywych komórkach. Wiązanie to jest równie specyficzne w warunkach in vivo jak w in vitro. Metoda ta może być tańszym, prostszym w użyciu zamiennikiem dla obecnie używanych przeciwciał anty-G4 lub bardziej specyficzną sondą w porównaniu do obecnie używanych związków niskocząsteczkowych, które charakteryzuje możliwość związania się niespecyficznie do innych miejsc DNA. Zauważono także wzrost ekspresji HO-1 w odpowiedzi na wprowadzenie sekwencji indukujących powstanie G-kwadrupleksów, jednak uzyskane wyniki nie sugerują wyraźnego wpływu egzogennych struktur G4 na poziom wolnego hemu w komórkach.

This study investigates a new method of G-quadruplex detection in the nucleus of living cells and the influence of G4-heme binding on heme oxygenase-1 (HO-1) expression. G4-DNA is a noncanonical secondary DNA structure regulating replication, transcription, and is able to inhibit telomerase. Heme, as well as its derivatives, can bind to G-quadruples structures. Some of the derivatives, such as N-methyl-mesoporphiryn IX (NMM), have the ability to stabilize G4. However, the direct influence of heme on their stability is not known. To detect G-quadruplex structures, we used NMM, which shows increased fluorescent properties after binding to G4, whereas it does not bind to canonical double-stranded DNA. This method needed to be optimized to determine the effective concentration of N-methyl mesoporphiryn IX, as well as the incubation time of cells and concentration of G4 oligonucleotide. Heme oxygenase-1 (HO-1) in standard conditions has low expression, whereas its levels are significantly increased in response to stimulating factors such as high heme concentration, presence of oxidative stress, or hypoxia. HO-1 catalyzes the degradation of heme to biliverdin, carbon dioxide, and Fe2+. Heme is an essential cofactor of many enzymes; however, in its free form, it is toxic to the cell, so it must be effectively removed. Results indicate the possibility of using NMM as a probe to detect G-quadruplex structures in living cells. The binding is specific in vivo as it is in vitro. This method can be used as a cheaper, easier to use alternative for current anti-G4 antibodies or a more specific probe than current low molecular weight compounds, that can also bind off-target. An increase of HO-1 expression was also observed in response to G4-forming sequences introduction. However, results do not suggest an apparent effect of exogenous G4 on free heme levels.