Jagiellonian University Repository

Wpływ inkubacji z etopozydem na liczebność i wielkość ognisk związanych z naprawą DNA (γH2AX i 53bp1) w cyklu komórkowym

pcg.skipToMenu

Wpływ inkubacji z etopozydem na liczebność i wielkość ognisk związanych z naprawą DNA (γH2AX i 53bp1) w cyklu komórkowym

Show full item record

dc.contributor.advisor Zarębski, Mirosław [SAP11019075] pl
dc.contributor.author Deszcz, Daria pl
dc.date.accessioned 2020-07-26T19:00:25Z
dc.date.available 2020-07-26T19:00:25Z
dc.date.submitted 2015-10-14 pl
dc.identifier.uri https://ruj.uj.edu.pl/xmlui/handle/item/208877
dc.language pol pl
dc.title Wpływ inkubacji z etopozydem na liczebność i wielkość ognisk związanych z naprawą DNA (γH2AX i 53bp1) w cyklu komórkowym pl
dc.title.alternative The effect of incubation with etoposide on the quantity and size of DNA repair foci (γH2AX and 53bp1) throughout the cell cycle pl
dc.type master pl
dc.abstract.pl Przedmiotem badań niniejszej pracy magisterskiej było, zbadanie wpływu fazy cyklu komórkowego na liczbę ognisk i rozmieszczenie 53bp1, γH2AX, PCNA w komórkach HeLa 2-14 oraz zbadanie wpływu inkubacji z etopozydem na liczbę i typ ognisk 53bp1 oraz γH2AX w komórkach HeLa, w zależności od fazy cyklu komórkowego. Ważną funkcją PCNA jest regulacja i kontrola cyklu komórkowego. Białko PCNA jest równomiernie rozmieszczony w całej objętości jądra, gdy nie zachodzi replikacja w komórkach (faza G1/G2 cyklu komórkowego). Tworzenie się skupisk białka PCNA w jądrze jest związane z procesem replikacji DNA (faza S cyklu komórkowego). W odpowiedzi na uszkodzenie DNA (zwłaszcza DSB), histon H2AX może ulegać fosforylacji w pozycji Ser139, powstaje wówczas fosforylowana postać H2AX nazywana γH2AX . Białko 53bp1 wykrywa dwuniciowe pęknięcia DNA (DSB), a następnie gromadzi się na chromatynie otaczając miejsce przerwania nici DNA. Ważną funkcją 53bp1 jest wybór drogi naprawy dwuniciowych pęknięć DNA (DSB). Komórki eukariotyczne mają dwa główne szlaki naprawy DSB: niehomologiczne łączenie końców DNA (NHEJ) oraz rekombinacja homologiczna (HR). Wybór ścieżki naprawy dwuniciowych pęknięć DNA (DSB) zależy od tego, czy konieczne jest wycinanie nici DNA w czasie cyklu komórkowego. Decyzja, który szlak wybrać do naprawy ma zasadnicze znaczenie dla stabilności genomowej i jest ściśle kontrolowane w czasie różnych faz cyklu komórkowego. Wykorzystano metodę immunofluorescencji, która pozwoliła na wybarwienie miejsc wykrycia uszkodzenia DNA (ogniska γH2AX) oraz naprawy dwuniciowych pęknięć DNA (DSB) (ogniska białka 53BP1). Następnie dla części komórek dokonano uszkodzenia chromatyny za pomocą etopozydu i ponownie przeprowadzono immunofluorescencję. Wszystkie obrazy zarejestrowano przy pomocy mikroskopu konfokalnego. Przeprowadzono wstępne doświadczenia pozwalające na rozróżnienie faz G1, S oraz G2 cyklu komórkowego. Stosując metodę immunofluorescencji, wybarwiono ogniska białka 53bp1 i γH2AX. Obrazy jąder podzielono ze względu na fazy cyklu komórkowego. Na uzyskanych trójwymiarowych obrazach jąder komórkowych przeprowadzono proces dekonwolucji, a następnie przy użyciu programu ImageJ wykonano obliczenia liczby oraz wielkości ognisk, które zamieszczono na wykresach kolumnowych. Analogicznie postępowano dla komórek inkubowanych z etopozydem.Istotną obserwacją wynikającą z przeprowadzonych doświadczeń jest fakt, że ogniska białka 53bp1 i γH2AX częściowo się pokrywają. Pokrywające się ogniska odpowiadają dwuniciowym pęknięciami DNA (DSB). Ogniska γH2AX niesparowane z białkiem 53bp1 mogą odpowiadać pojedynczym pęknięciami nici DNA (SSB), a ogniska 53bp1 niesparowane z γH2AX odpowiadają ciałkom jądrowym. Kolejnym ważnym wnioskiem jest fakt, że podczas procesu replikacji (faza S) powstaje najwięcej uszkodzeń DNA. W fazie G1 powstają duże ogniska białka 53bp1, które mogą pochodzić z innego procesu niż naprawa DSB. Analizując wyniki liczbowe zauważono, że dla komórek po inkubacji z etopozydem im później w cyklu komórkowym znajdują się komórki, tym więcej uszkodzeń obserwujemy. pl
dc.abstract.en The aim of the thesis is to investigate the effect of phases cell cycle on the quantity of formation clusters (foci) location 53bp1, γH2AX, PCNA in cell HeLa 2-14 and to investigate the effect of incubation with etoposide on the quantity and type of foci of 53bp1 and γH2AX in HeLa cells, depending on the phase of the cell cycle. An important function of PCNA is to regulate and control the cell cycle. The protein PCNA is uniformly distributed throughout the volume of the nuclei, when there is no replication in cells (phase G1 / G2 of the cell cycle). The formation clusters of protein PCNA in the nuclei is involved in the process of DNA replication (S phase of the cell cycle). In response to DNA damage (particularly DSB), histone H2AX can be phosphorylated at position Ser139, and in the process create a phosphorylated form of H2AX called γH2AX. Protein 53bp1 detects double stranded break DNA (DSB), and accumulates in the area of damage. An important function of 53bp1 is the choice of the repair path for double-strand DNA breaks (DSB). Eukaryotic cells have two main repair pathways DSB: DNA non-homologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Choice of the repair pathway of double-stranded breaks DNA (DSB) is connected with the necessity to cut the DNA strand during the cell cycle. The decision which repair path is chosen is essential for genomic stability and closely controlled during the various phases of the cell cycle.The immunofluorescence techniques have been used to enable visualization of DNA damage sites (foci γH2AX) and repair of double-stranded DNA breaks (DSB) (foci protein 53bp1). Subsequently cells were incubated with etoposide and chromatin damaged by etoposide observed with immunofluorescence. All images were recorded using a confocal microscope.Preliminary experiments allow the distinction of the phases G1, S and G2 in the cell cycle. Using immunofluorescence method, stained foci protein 53bp1 and γH2AX were observed. Images were divided according to phases of the cell cycle. On the 3D-images of nuclei cell deconvolution process was conducted and then using ImageJ calculation of the quantity and size of the foci was performed. Similarly, the procedure for cells incubated with etoposide.An important observation resulting from the conducted experiments is the fact that the foci of protein 53bp1 and γH2AX overlap. Overlapping foci match to double-stranded DNA breaks (DSB). Foci γH2AX unpaired with the protein 53bp1 can match to a single strand breaks DNA(SSB) and unpaired 53BP1 foci of γH2AX match nuclei bodies. Additionally it was noted that during the replication process, the S phase, the highest number of DNA damage events occurred. Large clusters of 53bp1 protein are created in chase G1, the orgin of those clusters (foci) me be different then DSB rep air pathway. Quantitative analysis of the results showed that after incubation with etoposide, the later in the cell cycle cells were, the more damage was observed. pl
dc.subject.pl białko 53bp1, γH2AX, PCNA, cyklina B1, mikroskopia konfokalna, DSB, SSB, etopozyd pl
dc.subject.en protein 53bp1, γH2AX, PCNA, cyclin B1, confocal microscopy, DSB, SSB, etoposide pl
dc.contributor.reviewer Czyż, Jarosław [SAP11015316] pl
dc.contributor.reviewer Zarębski, Mirosław [SAP11019075] pl
dc.affiliation Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii pl
dc.identifier.project APD / O pl
dc.identifier.apd diploma-101910-131387 pl
dc.contributor.departmentbycode UJK/WBBB pl
dc.area obszar nauk przyrodniczych pl
dc.fieldofstudy biofizyka pl


Files in this item

Files Size Format View

There are no files associated with this item.

This item appears in the following Collection(s)