Jagiellonian University Repository

Edycja genomu przy pomocy nukleaz TALEN przenoszonych poprzez mikrofragmenty komórkowe pochodzące z mezenchymalnych komórek macierzystych

pcg.skipToMenu

Edycja genomu przy pomocy nukleaz TALEN przenoszonych poprzez mikrofragmenty komórkowe pochodzące z mezenchymalnych komórek macierzystych

Show full item record

dc.contributor.advisor Bobis-Wozowicz, Sylwia pl
dc.contributor.advisor Zuba-Surma, Ewa pl
dc.contributor.author Sit, Karolina pl
dc.date.accessioned 2020-07-26T13:09:00Z
dc.date.available 2020-07-26T13:09:00Z
dc.date.submitted 2015-06-22 pl
dc.identifier.uri https://ruj.uj.edu.pl/xmlui/handle/item/203633
dc.language pol pl
dc.title Edycja genomu przy pomocy nukleaz TALEN przenoszonych poprzez mikrofragmenty komórkowe pochodzące z mezenchymalnych komórek macierzystych pl
dc.title.alternative Genome editing via microvesicles derived from mesenchymal stem cells expressing TALENs pl
dc.type master pl
dc.abstract.pl Sztuczne, hybrydowe enzymy takie jak nukleazy TALEN (ang. Transcription activator-like effector nucleases) stanowią atrakcyjne narzędzia do edycji genomu stosowane w inżynierii genetycznej. Nukleazy rozpoznają, a następnie przecinają specyficzną sekwencję nukleotydową w genomie powodując podwójne pęknięcia nici DNA (ang. Double Strand Breaks – DSBs). Powstałe pęknięcia są następnie naprawiane przez komórkowe mechanizmy naprawy DNA, czyli precyzyjny mechanizm rekombinacji homologicznej lub niehomologiczne scalanie końców DNA. W tym drugim przypadku wprowadzane są drobne mutacje, które skutkują wyciszeniem docelowego genu. Nukleazy tego rodzaju mogą być dostarczane do komórek m.in. poprzez transdukcję wektorami wirusowymi. Jednakże, w niniejszej pracy połączono technikę edycji genomu z wykorzystaniem mikrofragmentów (ang. microvesicles – MVs), jako nośników nukleaz TALEN. MVs to małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe złuszczane z powierzchni błony komórkowej w stanach fizjologicznych oraz patologicznych. MVs zawierają bioaktywne molekuły takie jak mRNA, mikroRNA (miRNA) białka oraz lipidy, przez co uczestniczą w komunikacji międzykomórkowej. MVs funkcjonują jako naturalne nośniki cząsteczek między komórkami, odpowiadają za horyzontalny transfer informacji genetycznej oraz mogą powodować zmianę fenotypu komórek akceptorowych.Celem niniejszych badań było sprawdzenie czy mikrofragmenty wyizolowane ze zmodyfikowanych, ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z pępowiny (ang. human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells – hUC-MSC) mogą przenosić nukleazy TALEN do komórek wykazujących ekspresję białka EGFP i prowadzić do specyficznego wyciszenia genu EGFP. Przeprowadzono izolację, charakterystykę antygenów powierzchniowych, a następnie modyfikację komórek hUC MSC poprzez nukleofekcję plazmidowym DNA zawierającym gen TALEN. Zmodyfikowane genetycznie komórki hUC-MSC-TALEN wykazywały ekspresję nukleaz TALEN, która została potwierdzona na poziomie genomowego DNA, mRNA oraz białka. Wyizolowano mikrofragmenty z pożywek kondycjonowanych z hodowli hUC-MSC-TALEN, które to MVs zawierały mRNA specyficzne dla nukleaz TALEN. Transfer MVs-TALEN do komórek linii HEK293T z ekspresją pojedynczej kopii genu EGFP (HEK293T-EGFP) prowadził do wzrostu ilości transkryptów TALEN w komórkach docelowych. Ponadto, uzyskano wyciszenie genu EGFP po 10-dniowej kohodowli komórek hUC-MSC-TALEN z komórkami HEK293T EGFP.Przeprowadzone badania pokazują, że mikrofragmenty komórkowe mogą być wykorzystane jako nośniki materiału genetycznego do edycji genomu. MVs przenoszą mRNA nukleaz TALEN do komórek docelowych prowadząc do wyciszenia genu docelowego. Jednakże konieczne są dalsze badania dotyczące specyficznego pakowania materiału genetycznego do MVs oraz zwiększenia wydajności transferu do komórek docelowych. pl
dc.abstract.en Designer nucleases such as Transcription activator-like effector nucleases (TALENs) constitute very useful tools in genome engineering. These hybrid enzymes recognize and cut DNA sequence in a specific, pre-defined locus, thus creating Double Strand Breaks (DSBs). The breaks can be then repaired by a precise cellular mechanism based on homologous recombination (HR) or imprecisely, by an error-prone non homologous end joining (NHEJ) pathway. In the latter case, a small insertions or deletions are introduced to DNA leading to mutations, which results in gene knockout. In this study, we combined genome editing via TALENs with the use of microvesicles (MVs) as their carriers to target cells. MVs are small cell - derived vesicles shedded from cell surface during cellular activation or in steady state. They contain a variety of bioactive molecules such as mRNA, microRNA (miRNA), lipids and proteins thus are involved in cellular communication. MVs can act as natural carriers of molecules between cells, leading to horizontal transfer of bioactive cargo and subsequently influencing cell fate. The goal of this study was to investigate whether MVs isolated from genetically modified human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells (hUC-MSC) can transfer designer nucleases to EGFP expressing cells leading to specific gene knockout of this gene. hUC MSC were isolated, characterized by expression of typical surface markers and genetically modified to express TALENS via nucleofection of plasmid DNA. Genetic modification of hUC-MSC resulted in expression of designer nucleases, which was confirmed on genomic DNA, transcript and protein levels. Microvesicles isolated from conditioned media from modified cells contained mRNA for TALEN nucleases. Transfer of MVs-TALEN to HEK293T-EGFP resulted in increase of TALENs mRNA level in recipient cells. Furthermore, after 10 days of co-culture UC-MSC-TALEN with HEK293T-EGFP, flow cytometry analysis indicated significant EGFP knockout followed by global decrease in mean fluorescence intensity.This study suggests that microvesicles can be utilized for genome editing purposes by transferring mRNA of designer nucleases to recipient cells, resulting in specific gene knockout. Further studies regarding improvement of packaging bioactive molecules into vesicles and increasing efficiency of MVs transfer need to be conducted. pl
dc.subject.pl edycja genomu, nukleazy TALEN, mikrofragmenty, mezenchymalne komórki macierzyste pl
dc.subject.en genome editing, TALENs, microvesicles, mesenchymal stem cells pl
dc.contributor.reviewer Bobis-Wozowicz, Sylwia pl
dc.contributor.reviewer Zuba-Surma, Ewa pl
dc.contributor.reviewer Horwacik, Irena [SAP11116244] pl
dc.affiliation Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii pl
dc.identifier.project APD / O pl
dc.identifier.apd diploma-96132-129918 pl
dc.contributor.departmentbycode UJK/WBBB pl
dc.area obszar nauk przyrodniczych pl
dc.fieldofstudy biotechnologia pl


Files in this item

Files Size Format View

There are no files associated with this item.

This item appears in the following Collection(s)