Jagiellonian University Repository

Charakterystyka strukturalna oddziaływania domen TIR

pcg.skipToMenu

Charakterystyka strukturalna oddziaływania domen TIR

Show full item record

dc.contributor.advisor Dubin, Grzegorz [SAP11019243] pl
dc.contributor.author Przetocka, Sara pl
dc.date.accessioned 2020-07-26T12:53:53Z
dc.date.available 2020-07-26T12:53:53Z
dc.date.submitted 2015-06-19 pl
dc.identifier.uri https://ruj.uj.edu.pl/xmlui/handle/item/203400
dc.language pol pl
dc.title Charakterystyka strukturalna oddziaływania domen TIR pl
dc.title.alternative Structural characterization of TIR domains interaction pl
dc.type master pl
dc.abstract.pl Receptory Toll-podobne (TLR) są odpowiedzialne za aktywację odpowiedzi wrodzonej układu immunologicznego po rozpoznaniu molekularnych wzorców patogenności. Ścieżka transdukcji sygnału receptorów TLR wymaga związania do receptora białek adaptorowych, do których zalicza się MyD88 (ang. myeloid differentiation primary response gene 88) oraz MAL (ang. MyD88 adapter-like protein). Białko MyD88 odgrywa ważną rolę w różnych procesach fizjologicznych oraz chorobotwórczych takich jak indukcja stanu zapalnego oraz proces nowotworzenia. Z kolei mutacje białka MAL kojarzone są ze zwiększoną podatnością lub opornością na niektóre choroby, takie jak bakteriemia, gruźlica czy malaria. Dlatego ważne jest poznanie molekularnych podstaw działania tych białek. Każdy TLR oraz wszystkie białka adaptorowe zawierają domenę TIR (ang. Toll/IL-1 receptor), która pełni kluczową rolę w ich interakcji. Dotychczas przedstawiono dwa możliwe modele oddziaływania domen TIR białek: MAL, MyD88 oraz TLR4. Jednak do tej pory molekularny mechanizm oddziaływania TIR:TIR pozostaje niewyjaśniony. W prezentowanej pracy wykorzystując metody biologii molekularnej uzyskano konstrukt domeny TIR białka MyD88 z metką GST, a następnie wykonano optymalizację warunków ekspresji białka. Opracowano również trzyetapowy proces oczyszczania domeny MyD88-TIR z wykorzystaniem chromatografii powinowactwa na złożu Glutathione Sepharose 4 FF, sączenia molekularnego oraz chromatografii jonowymiennej. Dzięki uprzejmości dr Eugene Valkov uzyskano konstrukt domeny TIR białka MAL z metką histydynową i opracowano protokół oczyszczania białka za pomocą chromatografii powinowactwa na złożu niklowym oraz chromatografii jonowymiennej. Wykorzystując białko MyD88-TIR znakowane izotopem azotu 15N przeprowadzono pomiary jedno- oraz dwuwymiarowego widma NMR, które potwierdziły, że białko jest poprawnie sfałdowane i nie ulega agregacji. Metodą analitycznego sączenia molekularnego pokazano, że domeny TIR białek MAL oraz MyD88 przyjmują w roztworze formę monomeru. W celu sprawdzenia funkcjonalności otrzymanych domen TIR przeprowadzono eksperyment pull-down, który potwierdził oddziaływanie obu domen. Ponadto wykorzystując metodę sączenia molekularnego zaobserwowano prawdopodobne formowanie się kompleksu domeny TIR białka MAL oraz MyD88. W celu sprawdzenia czy otrzymany kompleks jest homo- czy heterodimerem przeprowadzono rozdział elektroforetyczny, jednak wyniki te nie są klarowne i wymagają dalszej analizy. pl
dc.abstract.en Toll-like receptors (TLRs) play central role in the innate immune response and inflammation by recognizing pathogen-associated molecular patterns. A TLR signalling depends on recruitment and association of adaptor proteins including MyD88 (myeloid differentiation primary response gene 88) and Mal (MyD88 adapter-like protein, also known as TIRAP). MyD88 takes part in various physiological and phatogenic processes such as inflammation, host defence and carcinogenesis, whereas mutations in MAL are associated with higher susceptibility or resistance to infectious diseases including bacteraemia, tuberculosis and malaria. Thus, it is important to elucidate the molecular mechanism of interaction of those adaptor proteins. All TLRs and adaptor proteins contain structurally conserved Toll/interleukin-1 receptor (TIR) domain, which is crucial in their interaction. Up to date two possible models of MyD88, Mal and TLR4 interactions have been proposed. Despite numerous reports on TIR domains, the molecular mechanism of TIR:TIR domain interactions remains an unresolved issue. In this study construct of MyD88 TIR domain with GST tag was obtained using molecular cloning methods and the conditions for protein expression were optimised. Three-step purification protocol with affinity, size-exclusion and ion-exchange chromatography has been established for MyD88 TIR domain. Construct of MAL TIR domain with histidine tag has been kindly provided by dr Eugene Valkov. Purification procedure of MAL-TIR using affinity and ion-exchange chromatography has been developed. Using NMR experiments it has been shown that MyD88 TIR domain is properly folded and does not undergo aggregation. TIR domains of MAL and MyD88 were also shown to exist as a monomers in solution state on the basis of size-exclusion chromatography. Pull-down analysis confirmed that recombinant TIR domains from MyD88 and MAL are fully functional and interact with each other. Size-exclusion chromatography demonstrated probable formation of complex of MAL and MyD88 TIR domains. To examine whether obtained complexes are homo- or heterodimers SDS-PAGE analysis was performed. However, obtained results are not clear and require further investigation. pl
dc.subject.pl domena TIR, Mal, MyD88, nowotworzenie, receptory Toll-podobne pl
dc.subject.en cancer, Mal, MyD88, TIR domain, Toll-like receptors pl
dc.contributor.reviewer Mak, Paweł [SAP11016637] pl
dc.contributor.reviewer Dubin, Grzegorz [SAP11019243] pl
dc.affiliation Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii pl
dc.identifier.project APD / O pl
dc.identifier.apd diploma-95887-126004 pl
dc.contributor.departmentbycode UJK/WBBB pl
dc.area obszar nauk przyrodniczych pl
dc.fieldofstudy biotechnologia pl


Files in this item

Files Size Format View

There are no files associated with this item.

This item appears in the following Collection(s)