Jagiellonian University Repository

Serynowa peptydaza SPS_298 z Staphylococcus pseudintermedius – ekspresja, oczyszczanie i charakterystyka biochemiczna

pcg.skipToMenu

Serynowa peptydaza SPS_298 z Staphylococcus pseudintermedius – ekspresja, oczyszczanie i charakterystyka biochemiczna

Show full item record

dc.contributor.advisor Kasza, Aneta [SAP11016588] pl
dc.contributor.advisor Pustelny, Katarzyna pl
dc.contributor.author Worwa, Justyna pl
dc.date.accessioned 2020-07-26T12:12:31Z
dc.date.available 2020-07-26T12:12:31Z
dc.date.submitted 2015-06-16 pl
dc.identifier.uri https://ruj.uj.edu.pl/xmlui/handle/item/202754
dc.language pol pl
dc.title Serynowa peptydaza SPS_298 z Staphylococcus pseudintermedius – ekspresja, oczyszczanie i charakterystyka biochemiczna pl
dc.title.alternative The serine protease SPS_298 from Staphylococcus pseudintermedius – expression, purification and biochemical characterization pl
dc.type master pl
dc.abstract.pl Staphylococcus pseudintermedius jest oportunistycznym patogenem, którego głównym gospodarzem jest pies. Ostatnie doniesienia literaturowe pokazują, że może dochodzić do transferu tego mikroorganizmu również na ludzi. Ze względu na podobieństwo do innych gronkowców, w tym do S. aureus, oraz przy braku odpowiednich testów diagnostycznych ta bakteria jest błędnie identyfikowana. Opublikowanie sekwencji genomów S. pseudintermedius szczepów HKU10-03 i ED99 oraz przeprowadzona analiza in silico, wskazała na obecność genów kodujących białka, które mogą być potencjalnymi czynnikami wirulencji. Wśród nich znajduje się operon genów kodujących sekrecyjne peptydazy serynowe, które wykazują istotne podobieństwo sekwencji do znanych czynników wirulencji S. aureus. W przedstawionej pracy, podjęto próbę charakterystyki biochemicznej jednej z peptydaz tego operonu. W oparciu o dostępne sekwencje genomowe zaprojektowano startery, które pozwoliły na amplifikacje genu SPSINT_0298 z genomowego DNA S. pseudintermedius szczep 2220. Stosując metody biologii molekularnej otrzymano konstrukt ekspresyjny pET29a_SPS_298. Nadekspresję białka prowadzono w bakteriach Escherichia coli szczep SHuffle T7 Express LysY. Następnie oczyszczano wykorzystując metody chromatografii powinowactwa na złożu z immobilizowanymi jonami Co2+ oraz chromatografii jonowymiennej FPLC na złożu MonoS. Zastosowanie kompleksowego podejścia podczas oczyszczania pozwoliło uzyskać homogenne białko SPS_298 o czystości powyżej 95%. Badane białko było aktywne i spośród badanych substratów białkowych selektywnie hydrolizowało gronkowcowe białko A, BSA oraz β-kazeinę. Peptydaza SPS_298 wykazywała preferencję do reszt kwasu glutaminowego, kwasu asparaginowego oraz glutaminy w pozycji P1 substratu. Dla reakcji z β-kazeiną najwyższą aktywność obserwowano w buforze 50mM TrisHCl oraz PBS w zakresie pH 7,5-9 oraz w temperaturze 42-45°C. Peptydaza SPS_298 nie była hamowana przez żadną z badanych serpin. Utrata aktywności następowała w warunkach denaturujących oraz po zastosowaniu nieodwracalnych inhibitorów proteaz serynowych. Przeprowadzone prace, nad optymalizacją warunków krystalizacji pozwoliły na uzyskanie regularnych kryształów białka SPS_298, które zostały przygotowane do pomiarów dyfraktometrycznych. Przedstawione wyniki w połączeniu z rozwiązaniem struktury przestrzennej peptydazy niewątpliwie przyczynią się do poznania roli peptydazy SPS_298 w fizjologii Staphylococcus pseudintermedius. pl
dc.abstract.en Staphylococcus pseudintermedius is an opportunistic pathogen normally associated with the canine host, but also found on skin and mucous membranes of dog’s owner and veterinary physicians. Limited knowledge of S. pseudintermedius physiology and biochemical similarities to S. aureus, make those two species almost indistinguishable in regular laboratory tests. Publication of genomic sequences of S. pseudintermedius strain HKU10-03 and ED99 and its in-depth in silico analysis revealed the presence of genes encoding putative virulence factors. Among them is the cluster of genes encoding secreted serine peptidase, which show high sequence homology to substrate specific serine peptidase from S. aureus. The gene encoding one of the peptidase (SPSINT_0298) was PCR amplified from genomic DNA of S. pseudintermedius 2220 strain and cloned to pET29a expression vector. The recombinant protein, with C-terminal His-Tag, was produced in Escherichia coli SHuffle T7 Express LysY strain. Then, protein was purified using affinity and ion-exchange chromatography. The application of a complex purification procedure allowed to obtain high purity homogenous protein. The peptidase SPS_298 was active, and among tested protein substrates hydrolyzed staphylococcal protein A, BSA and β-casein. The peptidase selectively recognized glutamic acid, aspartic acid or glutamine residues at substrate P1 position. The highest activity was observed in PBS or 50mM TrisHCl buffer with a pH range 7.5-9 and temperature 42-45°C. The prominent inhibition effect was observed only for SDS or the irreversible inhibitors of serine protease, but not for other group-specific inhibitors or serpins. Screening of different crystallization buffer and further optimization of crystallization condition let to obtain good quality protein crystals. Presented results together with crystal structure determination will contribute to better understanding of Staphylococcus pseudintermedius physiology. pl
dc.subject.pl Staphylococcus pseudintermedius, peptydaza serynowa, specyficzność substratowa, oczyszczanie białek, krystalizacja pl
dc.subject.en Staphylococcus pseudintermedius, serine protease, substrate specificity, protein purification, crystallization pl
dc.contributor.reviewer Pustelny, Katarzyna pl
dc.contributor.reviewer Kasza, Aneta [SAP11016588] pl
dc.contributor.reviewer Mak, Paweł [SAP11016637] pl
dc.affiliation Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii pl
dc.identifier.project APD / O pl
dc.identifier.apd diploma-95237-126097 pl
dc.contributor.departmentbycode UJK/WBBB pl
dc.area obszar nauk przyrodniczych pl
dc.fieldofstudy biotechnologia pl


Files in this item

Files Size Format View

There are no files associated with this item.

This item appears in the following Collection(s)