title: | Badanie subproteomu jąder komórkowych w pilokarpinowym modelu padaczki skroniowej. |
alternative title: |
Proteomic analysis of brain nuclear protein in pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. |
author: | Skupień Agnieszka |
reviewer: | Dubin Adam ![]() ![]() |
advisor: | Kędracka-Krok Sylwia ![]() |
date of submittion : | 2012-06-22 |
language: | Polish |
abstract in Polish: | Padaczka skroniowa jest najczęściej spotykaną postacią epilepsji. Pomimo długotrwałych badań, molekularne podłoże tej choroby wciąż jest słabo poznane. Proteomiczne podejście do zagadnienia opiera się na porównywaniu ekspresji białek w stanie fizjologicznym i patologicznym, co w konsekwencji umożliwia wykrycie markerów chorobotwórczych. Niestety, ze względu na złożoność materiału badawczego (szczególnie tkanek ludzkich), analiza proteomiczna jest ograniczona do białek występujących najobficiej. W tym kontekście poznanie składu białkowego poszczególnych kompartmentów komórkowych wydaje się być tyleż interesujące ileż uzasadnione; strategia ta pozwala bowiem sięgnąć w głąb tzn. w obszar białek niskokopijnych. Analiza proteomu jąder komórkowych, może dostarczyć istotnych informacji dotyczących rozwoju choroby gdyż umożliwia śledzenie zmian w poziomie białek regulujących ekspresję genów.Kluczowym etapem analizy subproteomu jest odpowiednie przygotowanie badanego materiału, które obejmuje trzy główne etapy tzn. izolację badanych organelli, ekstrakcję białek oraz ich oczyszczenie z substancji interferujących z analizą proteomiczną. Z przeprowadzonych w niniejszej pracy eksperymentów wynika, że lepszą jakość izolowanych jąder komórkowych otrzymuje się po zastosowaniu homogenizatora teflon – szkło o stosunkowo szerokiej szczelinie (przynajmniej 200 µm). W przypadku jąder komórkowych głównymi substancjami interferującym z analizą proteomiczną są kwasy nukleinowe. W przeprowadzonych doświadczeniach testowano skuteczność najczęściej stosowanych metod oczyszczania próbki białek z kwasów nukleinowych. Najlepsze rezultaty stwierdzono dla procedury z zastosowaniem sonikacji i dodatku endonukleazy Benzoanse w połączeniu z precypitacją acetonem. Dla uzyskania wiarygodnych wyników podczas analizy proteomu i fosfoproteomu konieczne jest ograniczenie proteolizy i defosforylacji. W toku niniejszej pracy dobrano odpowiednią ilość inhibitorów, ograniczających degradację białek i utratę fosforylacji. Niestety konsekwencją tego kroku było zmniejszenie aktywności Benzonase, dlatego niezbędne było dalsze dopracowanie preparatyki próbki pod kątem funkcjonalności Benzonase, co ostatecznie udało się osiągnąć. Jednak, pomimo ograniczenia utraty fosforylacji i rygorystycznego przestrzegania procedury barwienia Pro – Q Diamond (zgodnie z instrukcją producenta), barwienie fluorescencyjne białek fosforylowanych przebiegało w sposób niewydajny i niepowtarzalny dlatego zrezygnowano z tej części eksperymentu.Na bazie zoptymalizowanej wcześniej procedury przeprowadzono właściwy eksperyment, który miał na celu porównanie poziomu ekspresji frakcji białek jądrowych w mysim pilokarpinowym modelu padaczki skroniowej. Zbadano trzy grupy zwierząt i dla każdej z nich wykonano po sześć powtórzeń biologicznych. Uzyskano dobrej jakości obrazy elektroforetyczne. Ze względu na długotrwałą procedurę optymalizacji, nie udało się przeprowadzić analizy ilościowej. Ale dzięki zastosowaniu techniki shotgun potwierdzono wzbogacenie wyizolowanej frakcji w białka jądrowe. |
abstract in English: | Temporal lobe epilepsy is the most common type of epilepsy. Despite the long-term studies, molecular mechanism of epilepsy remains poorly understood. Application of proteomic studies to compare proteins in healthy and pathological states gives opportunity of identification diseases biomarkers. Unfortunately, due to the complexity of the biological sample, analysis of the proteome is limited to the most abundant proteins. Therefore, the investigation of protein composition related to particular cell compartments is interesting as well as justified. Especially, a study of nuclear proteome can provide an important information concerning expression alterations of proteins engaged gene regulation.The key step in the analysis of the cell organelle proteome is proper preparation of the biological material. That includes: the organelle isolation, proteins extraction and removal of substance interfering with the proteomic analysis. During the experiments preformed in present work, better quality of isolated nuclei was noticed when teflon - glass homogenizer with relatively wide clearance (of at least 200 µm) was applied. The essential issue of nuclear fraction sample preparation is the removal of nucleic acids. It is because of the interference nuclei acids with the protein separation process within 2DE (two dimensional gel electrophoresis). At the initial stage of this work the effectiveness of different (commonly used for removal of nucleic acid contaminants) methods was tested. The best results were obtained for the procedure using sonication and endonuclease Benzoanse treatment in combination with acetone precipitation. In order to obtain the reliable results of proteome and phosphoproteome analysis, the reduction of degree of proteolysis and dephosphorylation are absolutely necessary. Suitable composition and amount of the inhibitors were established. Unfortunately, applied inhibitors caused evident decrease of the Benzonase activity and therefore it was necessary to improve the procedure taking in consideration of Benzonaze functionality. Despite the reduction of dephosphorylation and strict keeping of Pro - Q Diamond staining protocol according to the manufacturer recommendation, the fluorescent staining of phosphorylated proteins was inefficient and irreproducible, so we were forced to abandon the analysis of phosphoproteome. On the basis the optimized procedure the main experiment was carried out. It was designed to compare the changes in nuclear protein expression level in pilocarpine model of temporal epilepsy. Three groups of animals were examined, each consisted of six biological replicates. High quality 2DE patterns were obtained. However, quantitative analysis was not performed, because of the long lasting optimization procedure. But, using shotgun analysis we were able to confirmed the significant fold enrichment for nuclear proteins in isolated fractions. |
keywords in Polish: | elektroforeza dwuwymiarowa, przygotowanie próbki, subproteomika, jądro komórkowe, pilokarpinowy model padaczki skroniowej, |
keywords in English: | two-dimensional gel electrophoresis, sample preparation, subproteome, cell nucleus, temporal lobe epilepsy |
affiliation: | Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii |
type: | master work |
Files | Size | Format | View |
---|---|---|---|
There are no files associated with this item. |