Jagiellonian University Repository

Structural and functional characterization of unique peptide transporter from Gram-negative bacteria Porphyromonas gingivalis

pcg.skipToMenu

Structural and functional characterization of unique peptide transporter from Gram-negative bacteria Porphyromonas gingivalis

Show full item record

dc.contributor.advisor Potempa, Jan [SAP11010833] pl
dc.contributor.author Madej, Mariusz [SAP14010614] pl
dc.date.accessioned 2020-02-13T11:54:16Z
dc.date.available 2020-02-13T11:54:16Z
dc.date.submitted 2019-12-13 pl
dc.identifier.uri https://ruj.uj.edu.pl/xmlui/handle/item/148885
dc.language pol pl
dc.rights Copyright *
dc.rights.uri http://ruj.uj.edu.pl/4dspace/License/copyright/licencja_copyright.pdf *
dc.title Structural and functional characterization of unique peptide transporter from Gram-negative bacteria Porphyromonas gingivalis pl
dc.type Thesis pl
dc.place Kraków pl
dc.description.physical 120 pl
dc.description.additional Dostęp do publikacji jest możliwy w Archiwum UJ pl
dc.abstract.pl Paradontoza, choroba objawiająca się patologiczną resorpcją tkanek przyzębia, jest jednym z najczęściej występujących schorzeń o podłożu bakteryjnym u ludzi. Powszechnie uznaje się, że jest ona wywoływana dysbiozą flory bakteryjnej, w skład której wchodzi tzw. czerwony kompleks (Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola i Tannerella forsythia), a także inne nowo poznane organizmy periodontopatogenne. Pośród czerwonego kompleksu, bakteria P. gingivalis jest uważana za głównego modulatora odpowiedzi immunologicznej i jej usunięcie może zatrzymać stan zapalny. P. gingivalis jest Gram-ujemną, pałeczkowatą, beztlenową bakterią zaopatrzoną w szereg czynników wirulencji (w tym przede wszystkim proteinazy cysteinowe zwane gingipainami), które umożliwiają temu mikroorganizmowi namnażanie się w środowisku chronicznego stanu zapalnego. P. gingivalis nie potrafi metabolizować cukrów, dlatego też głównym źródłem węgla są dla tej bakterii peptydy pochodzące ze degradowanych przez gingipainy białek gospodarza i bakterii. Pomimo faktu, że peptydy są kluczowym składnikiem niezbędnym do wzrostu P. gingivalis, mechanizm ich pobierania jest zupełnie nieznany. Niniejsza praca przedstawia strukturalno-funkcjonalną charakterystykę kompleksu RagAB pobierającego peptydy ze środowiska zewnątrzkomórkowego przez błonę zewnętrzną P. gingivalis, wyjaśniając mechanizm transportu substratów białkowych u Gram-ujemnych bakterii. Kompleks RagAB jest jednym z głównych białek błony zewnętrznej P. gingivalis. Dzięki temu możliwe było oczyszczenie kompleksu RagAB z błony zewnętrznej dwóch dzikich szczepów P. gingivalis (W83 and ATCC 33277), w których zarówno RagA jak i RagB różnią się znacznie sekwencją aminokwasową. Struktura krystalograficzna RagAB ze szczepu W83 została rozwiązana metodą podstawienia molekularnego (ang. molecular replacement, MR). RagAB tworzy hetero-tetrameryczny kompleks składający się z dwóch podjednostek RagA oraz dwóch podjednostek RagB (RagA2B2). RagA jest dużą, 22-skrętową beta beczułką z domeną czopującą wewnątrz beczułki, ma więc budowę charakterystyczną dla zależnych od TonB transporterów (ang. TonB-dependent transporters, TBDT). RagB jest lipoproteiną na powierzchni bakterii zakotwiczoną w błonie zewnętrznej, funkcjonującą jako "molekularna pokrywka" dla RagA. W obszarze oddziaływania podjednostek RagA i RagB obserwuje się gęstość elektronową, która odpowiada peptydowi o długości ok. 13 reszt aminokwasowych. Sugeruje to, że zarówno RagA jak i RagB tworzą miejsce wiązania transportowanych peptydów. Mikroskopia krioelektronowa pojedynczej cząsteczki (ang. Single-particle cryoelectron microscopy, cryo-EM) wykazała istnienie trzech dynamicznych stanów RagAB: podwójnie zamknięty (CC), pojedynczo zamknięty (OC) oraz podwójnie otwarty (OO), a także zmiany konformacyjne domeny czopującej po związaniu substratu. Specyficzność obu kompleksów względem długości i składu aminokwasowego została określona z wykorzystaniem spektrometrii mas (ang. mass spectrometry, MS). Analizy strukturalnofunkcyjne zostały przeprowadzone poprzez porównanie wzrostu mutantów RagAB w medium minimalnym zawierającym albuminę surowicy bydlęcej (ang. bovine serum albumin, BSA) jako jedyny składnik białkowy. Zostały również przeprowadzone analizy wiązania peptydu in vitro z wykorzystaniem termoforezy mikroskalarnej (ang. Microscale Thermophoresis, MST). Wyniki uzyskane w niniejszej pracy pozwoliły na stworzenie tzw. mechanizmu zamykanego pedałem kosza na śmieci (ang. pedal bin mechanism) umożliwiającego transport peptydów do wnętrza komórki przez system RagAB. Według tego mechanizmu, przy braku substratu kompleks RagAB jest otwarty, gdyż podjednostka RagB oddala się od RagA, eksponując miejsca wiązania peptydu w przestrzeni zewnątrzkomórkowej. Po związaniu peptydu kompleks zamyka się, a stan ten jest stabilizowany dzięki oddziaływaniu peptydu z RagA i RagB. Końcowy etap wymaga oddziaływania domeny TonB box znajdującej się w N-końcowej części RagA, z TonB. Dzięki sile protonomotorycznej możliwe jest utworzenie przejściowego tunelu w RagA i transport peptydu. Brak peptydu w kieszeni wiążącej powoduje otwarcie kompleksu co umożliwia rozpoczęcie kolejnego cyklu pobierania substratu. Podsumowując, niniejsza rozprawa doktorska przedstawia strukturalno-funkcjonalną charakterystykę kompleksu RagAB bakterii periodontopatogennej P. gingivalis, co stanowi pierwszy opis struktury i mechanizmy działania transportera dużych peptydów przez błonę zewnętrzną bakterii Gram-ujemnej. Analiza strukturalna, a także eksperymenty strukturalnofunkcyjne, MS oraz analiza wiązania peptydów in vitro wykazały jednoznacznie, że kompleks RagAB jest niezbędny do pobierania substratów białkowych przez P. gingivalis. Wyniki te przyczynią się do lepszego zrozumienia procesu transportu peptydów, nie tylko w P. gingivalis, ale również w innych bakteriach Gram-ujemnych. Co więcej, RagAB wydaję się być świetnym celem do opracowania specyficznej terapii, która będzie mogła w przyszłości posłużyć do leczenia paradontozy oraz chorób systemowych wywoływanych przez P. gingivalis. pl
dc.abstract.en Periodontal disease is one of the most frequently occurring infection-driven chronic inflammatory disease in human that results in destruction of teeth supportive tissues. According to a well-accepted paradigm, periodontitis is driven by dysbiotic bacterial flora, composed of the red complex oral bacteria (Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola and Tannerella forsythia) as well as other newly recognized periodontal pathogens. Among the red complex, P. gingivalis is considered as the most important modulator of host immune response and it is anticipated that its eradication may resolve inflammation. P. gingivalis is Gram-negative, rod-shaped, anaerobic bacterium equipped with a broad array of virulence factors (including cysteine proteinases called gingipains) which enable this bacterium to proliferate in the environment of local chronic inflammation. P. gingivalis cannot metabolise carbohydrates, and therefore the main source of carbon and nitrogen for this bacterium are peptides derived from increased proteolytic activity of gingipains. Despite the fact that peptides are crucial for growth and survival of P. gingivalis, the mechanism of their uptake is completely unknown. This study presents structural and functional characteristics of a RagAB complex transporting peptides through the outer membrane of P. gingivalis. Therefore, it sheds new light on the uptake of peptides by Gram-negative bacteria. RagAB is one of the most abundant proteins in the outer membrane of P. gingivalis. Due to this abundance RagAB was purified natively from the outer membrane of two wild type strains of P. gingivalis (W83 and ATCC 33277) which show significant amino acid sequence variability of this complex. The crystal structure of RagAB from W83 strains was solved by molecular replacement (MR). RagAB forms the hetero-tetrameric complex composed of two subunits of RagA and two subunits of RagB (RagA2B2). RagA is a big 22-stranded beta-barrel with a plug domain inserted into the barrel what is typical for TonB - dependent transporters (TBDT), whilst RagB forms an extracellular lid on RagA. Examination of the RagAB dimer interface showed the electron density which can be modelled as a peptide of ~13 residues in length suggesting that both RagA and RagB form a peptide binding site. Single-particle cryoelectron microscopy (cryo-EM) revealed three dynamic states of RagAB: double closed (CC), single closed (OC) and double open (OO) and show conformational changes of the plug domain upon substrate binding. Specificity of both complexes towards peptide length and amino acid composition was determined using mass spectrometry (MS). The structure-function studies were carried out by comparing the growth of RagAB mutants in minimal medium with bovine serum albumin (BSA) as a sole peptide source. Finally, binding of peptides has been also shown in vitro using Microscale Thermophoresis (MST). The results obtained in this study allowed for characterization of the so-called pedal bin mechanism enabling uptake of peptides by RagAB and their transport inside of the cell. In the absence of substrate the RagAB complex is open and the RagB subunit moves away from RagA in a hinge-like fashion to expose a ligand binding site to the extracellular space. Upon peptide binding the closed state is stabilised via interaction of a peptide with both RagA and RagB. The final step involves interaction of TonB-box in the N-terminal part of RagA with TonB and the proton-motive force (PMF)-derived energy enables generation of transient channel through the RagA lumen and transport of the peptide. Disruption of the peptide binding site favours the open state allowing the next uptake round. To sum up, this dissertation presents structural and functional characteristics of the RagAB complex from periodontal bacterium P. gingivalis which is the first reported large peptide transporter in the outer membrane of Gram-negative bacteria. Structural studies followed by structure-function studies, MS and binding assay show unambiguously that RagAB is crucial for utilisation of protein substrates by P. gingivalis. These results will contribute to better understanding of peptide transport not only by P. gingivalis but also in other species of Gram-negative bacteria. Moreover, RagAB seems to be a great target for the development of specific drugs which can be used in the future for the treatment of periodontitis and systemic diseases caused by P. gingivalis. pl
dc.subject.pl paptydy pl
dc.subject.pl transport pl
dc.subject.pl błona zewnętrzna pl
dc.subject.pl bakterie Gram-ujemne pl
dc.subject.pl Porphyromonas gingivalis pl
dc.subject.en peptides pl
dc.subject.en transport pl
dc.subject.en outer membrane pl
dc.subject.en Gram-negative bacteria pl
dc.subject.en Porphyromonas gingivalis pl
dc.identifier.callnumber Dokt. 2019/258 pl
dc.contributor.institution Jagiellonian University. Faculty of Biochemistry, Biophysics and Biotechnology pl
dc.contributor.reviewer Bochtler, Matthias pl
dc.contributor.reviewer Otlewski, Jacek pl
dc.affiliation Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii : Zakład Mikrobiologii pl
dc.rights.original bez licencji pl
dc.identifier.project ROD UJ / O pl


Files in this item

This item appears in the following Collection(s)

Copyright Except where otherwise noted, this item's license is described as Copyright