UNIWERSYTET JAGIELLOŃSKI
Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii
Michał Bukowski
CHARAKTERYSTYKA HIPOTETYCZNEGO OPERONU
SAOABC POTENCJALNIE KODUJĄCEGO NIEZNANY
SYSTEM REGULACJI TRANSKRYPCJI GENÓW U
STAPHYLOCOCCUS AUREUS
Rozprawa doktorska wykonana w Zakładzie Biochemii Analitycznej Wydziału Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Uniwersytetu Jagiellońskiego pod kierunkiem prof. dr. hab. Adama Dubina i dr. Benedykta Władyki
Projekt badawczy przedstawiony w rozprawie został częściowo sfinansowany ze środków Narodowego Centrum Nauki przyznanych na podstawie decyzji numer DEC-2011/01/N/NZ1/01167.
Panu prof. Adamowi Dubinowi za cenne uwagi i pomoc w pisaniu mojego pierwszego wniosku grantowego oraz za zaproszenie do kontynuowania inspirujących prac badawczych prowadzonych w Zakładzie Biochemii Analitycznej,
dr. Benedyktowi Władyce za opiekę merytoryczną podczas prowadzonych badań, cenne uwagi, dobrze układającą się i owocną współpracę,
dr. hab. Pawłowi Makowi za pomoc przy sekwencjonowaniu białek,
dr Sylwii Kędrackiej-Krok, dr Emilii Bonar i Iwonie Wójcik za pomoc w badaniach proteomicznych,
Panu prof. Jerzemu Dobruckiemu i dr. Mirosławowi Zarębskiemu za udostępnienie mikroskopu fluorescencyjnego i pomoc w wykonaniu zdjęć,
Natalii Wolak za cenne wskazówki dotyczące metody Real-Time PCR,
Agnieszce Bojko, Weronice Ilczyszyn, Mai Koseckiej, Anecie Budzie, Klaudii Polakowskiej za wyrozumiałość i wytrwałość w realizacji nie zawsze trafnych pomysłów,
dr Kasi Pustelny, Oli Pęcak, Gabrysi Zielińskiej, Monice Janczak za pomoc w rzeczach drobnych lecz istotnych,
Marcinowi Piejko za intelektualnie inspirujące dyskusje prowadzone w przerwach kawowych na temat badań naukowych i świata nauki w Polsce,
oraz wszystkim pracownikom i studentom Zakładu Biochemii Analitycznej za pomoc w rzeczach drobnych i życzliwość,
Rodzinie za zainteresowanie i wsparcie w dążeniu do celu,
składam serdeczne podziękowania.
Spis treści
1. Wykaz skrótów.............................................................................................................7
2. Streszczenie..................................................................................................................8
3. Abstract.......................................................................................................................11
4. Wstęp..........................................................................................................................13
4.1. Bakteryjne mechanizmy regulacji transkrypcji genów..................................13
4.1.1. Systemy jednokomponentowe...........................................................14
4.1.2. Systemy dwukomponentowe.............................................................15
4.1.3. Systemy trójkomponentowe..............................................................18
4.1.4. Podjednostki sigma (σ)......................................................................20
4.2. Podjednostki sigma (σ) bakteryjnej polimerazy RNA...................................20
4.3. Mechanizmy transdukcji sygnału...................................................................21
4.3.1. Podjednostka σE Escherichia coli......................................................22
4.3.2. Podjednostka σW Bacillus subtilis......................................................23
4.3.3. Podjednostka σB Bacillus subtilis i Staphylococcus aureus...............24
4.3.4. Inne modele regulacji aktywności alternatywnych podjednostek σ. .26
4.4. Podjednostki sigma (σ) Staphylococcus aureus.............................................27
4.4.1. Podjednostka podstawowa sigma A (σA)...........................................27
4.4.2. Podjednostka sigma B (σB)................................................................28
4.4.3. Podjednostka sigma H (σH)................................................................30
4.4.4. Podjednostka sigma S (σS).................................................................31
5. Cele pracy...................................................................................................................33
6. Materiały i metody......................................................................................................35
6.1. Lista oligonukleotydów..................................................................................35
6.2. Lista konstruktów plazmidowych..................................................................37
6.3. Oczyszczanie i izolacja kwasów nukleinowych.............................................37
6.3.1. Oznaczanie stężenia DNA i RNA w roztworach...............................37
6.3.2. Strącanie kwasów nukleinowych etanolem.......................................37
6.3.3. Izolacja genomowego DNA ze szczepów Staphylococcus aureus....38
6.3.4. Izolacja plazmidowego DNA ze szczepów Escherichia coli.............38
6.3.5. Izolacja plazmidowego DNA ze szczepów Staphylococcus aureus. .38
6.3.6. Izolacja całkowitego RNA ze szczepów Staphylococcus aureus......39
6.3.7. Elektroforeza kwasów nukleinowych................................................41
6.4. Metody inżynierii genetycznej.......................................................................41
6.4.1. Reakcja PCR......................................................................................41
6.4.2. Trawienie DNA enzymami restrykcyjnymi.......................................42
6.4.3. Izolacja fragmentów DNA z żelu agarozowego................................42
6.4.4. Rekombinacja fragmentów DNA......................................................42
6.4.5. Ligacja fragmentów DNA.................................................................42
6.4.6. Ligacja fragmentów DNA do plazmidu pTZ57R..............................43
6.4.7. Odwrotna transkrypcja.......................................................................43
6.4.8. Transformacja komórek Escherichia coli..........................................43
6.4.9. Elektroporacja komórek Staphylococcus aureus...............................44
6.4.10. Otrzymywanie szczepów Staphylococcus aureus typu knockout....45
6.4.11. Sekwencjonowanie DNA i synteza oligonukleotydów....................46
6.5. Oczyszczanie i izolacja białek........................................................................46
6.5.1. Oznaczanie stężenia białek w roztworach.........................................46
6.5.2. Elektroforeza białek SDS-PAGE.......................................................47
6.5.3. Izolacja białka SaoC z komórek Escherichia coli.............................47
6.5.4. Test podatności DNA wiązanego przez białko SaoC na trawienie....48
6.5.5. Izolacja całkowitego białka z komórek Staphylococcus aureus........49
6.6.
Badanie zmian ekspresji genów metodą Real-Time PCR..............................50
6.7.
Analiza porównawcza proteomów 2D-DIGE.................................................51
6.8. Badanie wirulencji szczepów Staphylococcus aureus w modelu zarodka kurzego...........................................................................................................51
6.9.
Testy różnic w antybiotykowrażliwości.........................................................52
7. Wyniki.........................................................................................................................54
7.1. Operon trzech hipotetycznych genów............................................................54
7.1.1. Lokalizacja i otoczenie genowe.........................................................54
7.1.2. Potencjalne sekwencje regulatorowe w obrębie operonu saoABC....56
7.1.3. Występowanie operonu w gatunkach rodzaju Staphylococcus..........56
7.1.4. Hipotetyczne białko wiążące DNA: SaoC.........................................58
7.2. Powiązanie z układem toksyna-antytoksyna pemIKSa...................................58
7.3. Białko SaoC posiada zdolność wiązania DNA..............................................59
7.4. Zmiany ekspresji genów operonu saoABC wywołane wpływem egzogennych czynników stresowych....................................................................................60
7.4.1.
Zmiany wywołane zakwaszeniem środowiska..................................60
7.4.2.
Zmiany wywołane brakiem preferencyjnego źródła węgla...............61
7.4.3.
Zmiany wywołane brakiem źródła aminokwasów............................61
7.5. Lokalizacja białek SaoB i SaoC w komórce bakteryjnej...............................65
7.6. Szczepy typu knockout...................................................................................66
7.6.1.
Szczepy Staphylococcus aureus RN4220 ΔsaoA i RN4220 ΔsaoC. .66
7.6.2. Dynamika wzrostu i wirulencja w modelu zarodka kurzego szczepów Staphylococcus aureus RN4220 ΔsaoA i RN4220 ΔsaoC.................67
7.7. Zmiany w proteomie indukowane aktywnością białka SaoC........................68
8. Dyskusja.....................................................................................................................70
8.1. Międzygatunkowa analiza zmienności sekwencji operonu saoABC.............70
8.2. Ekspresja genów operonu saoABC w warunkach stresowych.......................72
8.3.
Białko wiążące DNA: SaoC...........................................................................74
8.4. Szczepy Staphylococcus aureus RN4220 ΔsaoA i RN4220 ΔsaoC...............75
8.5. Powiązanie operonu saoABC z układem toksyna-antytoksyna pemIKSa.......77
8.6. Próby umiejscowienia funkcji operonu saoABC w globalnym systemie regulacji ekspresji genów...............................................................................78
9. Podsumowanie............................................................................................................79
10. Bibliografia...............................................................................................................81
11. Zasoby internetowe i programy................................................................................98
11.1. Bazy danych.................................................................................................98
11.2. Programy......................................................................................................98
11.3. Biblioteki dedykowane do biologii obliczeniowej.......................................99
1. WYKAZ SKRÓTÓW
1CS – system jednokomponentowy (ang. one-component system)
2CS – system dwukomponentowy (ang. two-component system)
2D-DIGE – dwuwymiarowa elektroforeza różnicująca w żelu
poliakrylamidowym (ang. two-dimensional difference gel electrophoresis)
3CS – system trójkomponentowy (ang. three-component system)
APS – nadtlenodwusiarczan amonu, zwyczajowo: nadsiarczan amonu (ang. ammonium persulfate)
CBB – błękit Coomassie (ang. Coomassie Brillant Blue)
CFU – jednostka formująca kolonię (ang. colony-forming unit)
DTT – 1,4-ditiotreitol
ECF – alternatywne podjednostki sigma (σ) bakteryjnej polimerazy RNA regulujące funkcje zewnątrzkomórkowe (zewnątrzcytoplazmatyczne, ang. extracytoplasmic function sigma factors)
EDTA– kwas etylenodiaminotetraoctowy
GFP – zielone białko fluorescencyjne (ang. green fluorescent protein)
HTH – białkowy motyw strukturalny helisa-zwrot-helisa (ang. helix-trun-helix)
IPTG – izopropylo-1-tio-β-D-galaktopiranozyd
LB – płynna pożywka do hodowli bakteryjnych (ang. Luria Bertani Broth)
LBA – podłoże stałe do hodowli bakteryjnych (ang. Luria Bertani Agar)
MCS – miejsce w plazmidzie przeznaczone dla wstawianych metodami inżynierii genetycznej obcych fragmentów DNA (ang. multiple clonning site)
OD600 – gęstość optyczna mierzona przy długości fali 600 nm (ang. optical density)
PAGE – elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (ang. polyacrylamide gel electrophoresis)
PCR – łańcuchowa reakcja polimerazy (ang. polimerase chain reaction)
RBS – miejsce wiązania rybosomu (ang. ribosome binding site)
RNAP – polimeraza RNA (ang. RNA polymerase)
SDS – dodecylosiarczan sodu (ang. sodium dodecyl sulfate)
SDS-PAGE – elektroforeza w żelu poliakrylamidowym w obecności SDS
TEMED – N,N,N’,N’-tetrametyloetylenodiamina
Tricyna – N-Tris-hydroksymetylo-metyloglicyna
Tris – tri-hydroksymetyloaminometan
TSA – podłoże stałe do hodowli bakteryjnych (ang. Tryptic Soy Agar)
TSB – płynna pożywka do hodowli bakteryjnych (ang. Tryptic Soy Broth)
2. STRESZCZENIE
Mechanizmy regulacji ekspresji genów w komórkach bakteryjnych, warunkując adaptacyjną odpowiedź na ciągle zmieniające się warunki środowiska zewnętrznego, odgrywają istotną rolę nie tylko w regulacji podstawowego metabolizmu ale także w procesie patogenezy. Dotychczas systemy takie jak agr (ang. accessory gene regulator), sar (ang. staphylococcal gene regulator) czy sigB (alternatywna podjednostka sigma polimerazy RNA) zostały opisane dla gronkowca złocistego (Staphylococcus aureus)i powiązane z regulacją ekspresji czynników wirulencji.
W trakcie badań nad gronkowcowym systemem toksyna-antytoksyna pemIKSa, w którym toksyna PemKSa posiada aktywność endorybonukleazową, na liście genów wytypowanych jako te, których transkrypty są statystycznie niedoreprezentowane w sekwencje rozpoznawane przez tę endorybonukleazę znalazł się gen hipotetycznego białka. Analizy bioinformatyczne pozwoliły znaleźć w obrębie jego sekwencji dwa potencjalne miejsca wiążące DNA, co sugerowało, że może on być dotychczas nieopisanym czynnikiem transkrypcyjnym. Dalsze analizy i eksperymenty przeprowadzone z wykorzystaniem odwrotnej transkrypcji wskazały, że gen ten (nazwany saoC) przynależy do jednego operonu wraz z dwoma innymi genami (operonu nazwanego saoABC). Ponadto jest to operon, którego homologi występują w sekwencjach wszystkich znanych genomów przedstawicieli rodzaju Staphylococcus i tylko w obrębie tego rodzaju.
Dokonując ekspresji i częściowego oczyszczania białka SaoC pod kontrolą promotora T7 w szczepie Escherichia coli BL21(DE3) wykazano jego zdolność wiązania DNA. Przejawiało się to nie tylko dużą ilością DNA oczyszczaną wraz z białkiem ale ochroną przed aktywnością DNAzy I przez białko SaoC krótkiego odcinka DNA (około 20 par zasad), której nie obserwowano dla cieplnie zdenaturowanego preparatu białka. Warto tutaj wspomnieć, że dwa hipotetyczne miejsca wiązania DNA w obrębie białka odpowiadają charakterystyce alternatywnych podjednostek sigma polimerazy RNA, które wiążą się do tak zwanych kaset -10 i -35 promotora.
Wiele znanych systemów kontroli ekspresji genów, w tym alternatywne podjednostki sigma czy systemy dwukomponentowe, są strukturalnie związane z błoną komórkową. W momencie aktywacji takiego systemu czynnik wiążący DNA zostaje uwalniany z przybłonowego kompleksu. Z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej wykazano peryferyjną lokalizację białka fuzyjnego SaoC-GFP w komórkach gronkowca złocistego, co stanowi kolejną przesłankę o regulatorowym charakterze systemu kodowanego przez operon saoABC.
Badania ekspresji genów operonu saoABC ujawniły bardzo złożoną zależność transkrypcji poszczególnych jego komponent w różnych warunkach stresowych. Obserwuje się silny wzrost ekspresji genu saoA w warunkach zakwaszenia (pH 5,0) a także braku preferencyjnego źródła węgla lub braku źródła aminokwasów. W tym ostatnim przypadku znacznemu wzrostowi ekspresji podlega również gen saoB. Natomiast nie zaobserwowano powtarzalnej indukcji ekspresji dla któregokolwiek z genów operonu saoABC w warunkach stresu osmotycznego, solnego, działania antybiotyku czy stresu cieplnego. Otrzymany wynik staje się interesujący w świetle faktu, że warunki braku źródeł składników odżywczych jak i niskie pH występują w endosomach komórek eukariotycznych a wiele szczepów gronkowca złocistego posiada zdolność internalizacji do komórek gospodarza z wykorzystaniem białek wiążących fibronektynę.
W toku badań nad charakterystyką funkcjonalną hipotetycznego operonu saoABC udało się również otrzymać dwa szczepy typu knockout dla genów saoA i saoC. Badanie wirulencji szczepów gronkowca złocistego w modelu zarodków kurzych nie dało niestety jednoznacznej odpowiedzi czy istnieje różnica w wirulencji otrzymanych szczepów S. aureus RN4220 ΔsaoA i RN4220 ΔsaoC. Warto tutaj zwrócić uwagę, że w standardowej hodowli w pożywkach płynnych nie obserwowano statystycznie istotnych różnic we wzroście szczepów typu knockout w porwaniu ze szczepem wyjściowym S. aureus RN4220.
Wyżej przytoczone wyniki stanowią podstawową ale spójną charakterystykę hipotetycznego operonu saoABC. Niewątpliwie jest on funkcjonalnie związany z odpowiedzią na warunki stresowe, które powszechnie oddziałują na komórki gronkowca złocistego w trakcie interakcji komórek bakteryjnych z komórkami gospodarza. Zdolność wiązania DNA przez białko SaoC ukazuje możliwość modulacji ekspresji innych genów poprzez bezpośrednie oddziaływanie z ich nośnikiem a jego lokalizacja komórkowa jak i posiadanie dwóch potencjalnych miejsc wiązania DNA pozostaje w zgodzie z charakterystykami dotychczas opisanych bakteryjnych czynników transkrypcyjnych. Z kolei brak różnic we wzroście szczepów S. aureus RN4220, RN4220 ΔsaoA i RN4220 ΔsaoC w optymalnych warunkach laboratoryjnych oraz możliwe różnice w wirulencji tych szczepów sugerują, że operon saoABC nie zawiaduje zachowaniem się komórki bakteryjnej w kontekście metabolizmu podstawowego a jego aktywność jest bardziej specyficznie związana z warunkami stresowymi.
3. ABSTRACT
Bacterial transcription regulation systems allow for adaptive response to constantly changing environmental conditions and hence play an important role not only in basic metabolism but also in pathogenesis. Systems such as agr (accessory gene regulator), sar (staphylococcal gene regulator) or sigB (an alternative RNA polymerase sigma subunit) have been described so far and demonstrated to be related to virulence factors' transcription regulation.
In a course of research focused on staphylococcal toxin-antitoxin system pemIKSa, whose toxin PemKSa possesses endoribonucleolitic activity, a set of genes underrepresented in the recognised by PemKSa sequence were presented and among them a gene coding for a putative DNA-binding protein. A preliminary analysis revealed two hypothetical DNA-binding motives within its sequence, which suggested it to be yet uncharacterised transcription factor. Subsequent reverse transcriptase experiments demonstrated that the gene (designated as saoC) belongs to an operon together with two other genes (the operone saoABC). Noteworthy, homologous to saoABC sequences are present among all known staphylococcal genomes and in staphylococcal genomes only.
Expressed in Escherichia coli BL21(DE3) and partially purified recombinant SaoC manifested DNA-binding properties. This resulted not only in considerable amount of DNA in a purified sample but also in protection of a small fragment (c. 20 base pairs) of DNA from DNase I digestion, which was not observed in an initially thermally denatured sample. Worth mentioning, two aforementioned hypothetical DNAbinding sites may correspond to the sites of alternative sigma factors that bind to the -10 and -35 promoter regions.
Many of known transcription regulation systems' components, such as twocomponent systems, are structurally bound to the cell membrane. Upon such system activation the DNA-binding component is released from the membrane-bound complex. Utilising fluorescent microscopy it was demonstrated that SaoC-GFP fusion protein is located peripherally in bacterial cells, which is yet another premise for saoABC regulatory function.
The part of the study focused on changes in expression of saoABC operon genes revealed a complex relation between each gene transcription level and exposure to a particular stress condition. A significant increase in saoA transcript level was observed upon acidification (pH 5.0) and depletion of preferential carbon or amino acid sources. In the last case the saoB transcript level was considerably elevated as well. On the other hand, no changes in saoABC genes transcription was observed for salinisation, antibiotic exposure, osmotic or heat stress. The outcome of the research seems to be of interest when referred to the fact that the combination of low pH and the lack of nutrients is characteristic for late endosomes of eukaryotic cells. Many staphylococcal strains is able to initialise self-internalisation to host cells, which is dependent on pathogen surface fibronectin-binding proteins.
In the course of the described study focused on saoABC operon, null mutants for saoA and saoC genes were successfully obtained. Unfortunately, virulence analysis of such strains in chicken embryo model has not brought unambiguous answer to the question whether there is any difference between S. aureus RN4220 ΔsaoA, RN4220 ΔsaoC and the wild type RN4220 strain. Moreover, no difference in growth dynamics was observed for the strains in rich media.
All results described above comprises basic but consistent characteristic of saoABC operon. Undoubtedly, saoABC is a response element to stress conditions, which are common to the usual for staphylococci environment of host-pathogen interactions. SaoC DNA-binding property is likely a mechanism of direct modulation of genes transcription. When taken also into consideration the fact that SaoC possesses two possible DNA-binding sites and is located peripherally in the cell, SaoC emerges as a potential transcription factor. On the other hand no differences in growth dynamics for
S. aureus RN4220, RN4220 ΔsaoA and RN4220 ΔsaoC in optimal conditions but potential differences in virulence suggest that saoABC role is far more related to specific stress conditions than to signal transduction in basic metabolic routines.
4. WSTĘP
4.1. Bakteryjne mechanizmy regulacji transkrypcji genów
Regulacja transkrypcji genów, będących jednostkami informacji biologicznej, jest jedną z integralnych funkcji organizmów żywych. Umożliwia ona układowi żywemu pozostawanie w dynamicznie zmieniającej się relacji z otaczającym środowiskiem oraz kontrolę podstawowych procesów życiowych właściwych temu układowi. Relacja ta ma często charakter dwukierunkowy: nie tylko zmienne warunki środowiska modyfikują wykorzystanie informacji biologicznej ale również ukierunkowana zmiana ekspresji tej informacji może prowadzić do modyfikacji warunków środowiska. Regulacja transkrypcji genów, obok mnogości zewnątrz-jak i wewnątrzkomórkowych czynników czy obszerności samej informacji biologicznej, nadaje kolejny wymiar tej relacji, którym jest złożoność wykorzystania tej informacji. Stąd nawet w przypadku prostszych form życia, jakimi są bakterie, systemy regulacji transkrypcji genów tworzą niezwykle złożone sieci przetwarzania odbieranych sygnałów.
Na najniższym poziomie regulacja ekspresji informacji biologicznej przejawia się w postaci regulacji procesu transkrypcji, czyli powstawania cząsteczek RNA na matrycy genomowego DNA. Wśród bakterii w toku ewolucji powstawały coraz bardziej złożone systemy regulacji procesu transkrypcji, wśród których zdecydowanie dominują cztery typy: systemy jedno-, dwu-i trójkomponentowe oraz alternatywne podjednostki sigma (σ) polimerazy RNA. W kontekście obszerności informacji genetycznej i złożoności systemów jej przetwarzania, warto zwrócić uwagę na zależność pomiędzy tymi dwoma cechami wśród bakterii. Ulrich i in. (2005) zaobserwowali, że ilość systemów jedno-i dwukomponentowych bardzo silnie koreluje z kwadratem rozmiaru genomu. Tłumacząc tę obserwację zasugerowali, że zależność ta może być czynnikiem limitującym rozmiar genomu, gdyż jego wzrost pociąga za sobą konieczność wykładniczo większych inwestycji w utrzymanie systemów przetwarzania informacji w nim zawartych. Podobne trendy dotyczące systemów regulacji ekspresji genów czy samych czynników transkrypcyjnych wykazali inni badacze (van Nimwegen 2003; Konstantinidis i Tiedje 2004; Grilli i in. 2012). Pomimo istnienia tej silnej korelacji, istnieją odchylenia od tej reguły. Przykładem może być morska cyjanobakteria Trichodesmium erythreanum i glebowa α-proteobakteria Sinorhizobium meliloti. W pierwszym przypadku mamy do czynienia z bakterią żyjącą w relatywnie stabilnych warunkach oceanu tropikalnego, nie wytwarzającą rozwojowo zróżnicowanych form, włączając w to charakterystyczne dla cyjanobakterii heterocysty (Staal i in. 2003). W drugim natomiast z bakterią zasiedlającą różne mikrośrodowiska poprzez glebę, ryzosferę aż po wnętrze rośliny (Galibert i in. 2001). Mimo porównywalnych rozmiarów genomów (7,7 i 6,7 Mpz) Trichodesium posiada 69 a Sinorhizobium aż 390 systemów jednokomponentowych (Ulrich i in. 2005). Odchylenia te obrazują wagę systemów regulacji ekspresji genów zależną od złożoności i zmienności zajmowanej przez organizm niszy ekologicznej jak również zróżnicowania stadiów życiowych.
W dalszej części rozdziału przedstawiono krótką charakterystykę wyżej wspomnianych typów systemów regulacji procesu transkrypcji u bakterii wraz z modelowymi przykładami.
4.1.1. Systemy jednokomponentowe
Systemy jednokomponentowe (1CS) charakteryzują się najprostszą architekturą i stąd uważa się je za ewolucyjnie najbardziej pierwotne (Ulrich i in. 2005; Marijuán i in. 2010). Architektura ta zamyka się w jednej cząsteczce dwudomenowego białka (rys. 1A). Jedna z domen stanowi receptor, głównie małocząsteczkowych substancji, a druga efektor, posiadając w znakomitej większości zdolność wiązania DNA a przez to możliwość wpływu na proces transkrypcji (Ulrich i in. 2005). Cząsteczka takiego białka może mieć zarówno charakter represora jak i aktywatora.
Klasycznymi przykładami takich systemów jest represor operonu laktozowego LacI i białko CAP (CRP) opisane w każdym detalu dla Escherichia coli. W warunkach braku glukozy, głównego źródła węgla, produkowana jest cząsteczka sygnalna cAMP. Białko CAP wiążąc się z cAMP tworzy kompleks oddziałujący z operatorem operonu laktozowego i promuje transkrypcję genów umożliwiających wykorzystanie laktozy jako źródła węgla (Mitra i in. 1975; Kolb i in. 1993a; Kolb i in. 1993b). Niemniej w nieobecności laktozy represor LacI, związany z operatorem operonu laktozowego, ciągle hamuje ekspresję jego genów. Dopiero allolaktoza, pośredni produkt metabolizmu laktozy, wiąże się z represorem LacI znosząc jego wiązanie z operatorem operonu laktozowego i umożliwiając ekspresję jego genów (Eron i Block 1971; Lewis i in. 1996). W ten sposób w warunkach stresu głodowego promowane jest wykorzystanie innych niż glukoza źródeł węgla, o ile te są dostępne.
Jako inny przykład może posłużyć regulator NrdR, który odgrywa rolę w regulacji procesu syntezy deoksynukleotydów z rybonukleotydów poprzez modulację ekspresji genów reduktaz rybonukleotydowych (Rodionov i Gelfand 2005; Grinberg i in. 2009). Jest to białko represorowe wiążące fosforany rybonukleotydów i deoksyrybonukleotydów. W formie związanej z trifosforanami jest nieaktywne, natomiast gdy miejsca wiążące są okupowane przez monofosforany, NrdR wiąże się do sekwencji regulatorowych wyciszając ekspresję genów (McKethan i Spiro 2013).
Czynnik transkrypcyjny Fur jest kolejnym dobrze poznanym białkiem regulatorowym. Został on zidentyfikowany jako represor produkcji sideroforów. Siderofory są małymi białkami wydzielanymi przez komórki bakteryjne, które posiadają wysokie powinowactwo do jonów metali. Ich zadaniem jest wiązanie jonów metali kluczowych dla metabolizmu komórki bakteryjnej. Kompleksy cząsteczek sideroforów i jonów metali są następnie transportowane do wnętrza komórki (Troxell i Hassan 2013). Białko Fur związane z jonami żelaza Fe2+ lub manganu Mn2+ wycisza produkcję sideroforów (Hantke 1981; Hantke 1984; Bagg i Neilands 1985; Bagg i Neilands 1987a; Bagg i Neilands 1987b; de Lorenzo i in. 1987).
Szeroka dystrybucja systemów jednokomponentowych wśród bakterii jak również Archaea a także ich regulatorowa rola, często przejawiająca się na poziomie metabolizmu podstawowego, sugerują ich pierwotny charakter (Ulrich i in. 2005). Kolejne dwie, opisane poniżej, grupy wydają się być ewolucyjnym rozwinięciem tego typu kontroli transkrypcji genów.
4.1.2. Systemy dwukomponentowe
Postuluje się, że systemy dwukomponentowe (2CS) powstały na drodze ewolucji z systemów jednokomponentowych (Ulrich i in. 2005; Marijuán i in. 2010). Rzeczywiście, stanowią one w swojej architekturze rozbudowaną wersję systemów jednokomponentowych, w których domeny receptora i efektora znajdują się w obrębie dwóch różnych białek (rys. 1B). Ponieważ część receptorowa będąca częścią transbłonowego białka jest eksponowana na zewnątrz komórki, może dochodzić do bezpośredniej recepcji sygnałów pozakomórkowych. Systemy te zatem pokonują ograniczenie systemów jednokomponentowych, które mogą reagować wyłącznie na sygnały pochodzące z wnętrza komórki. Nazwę i mechanizm działania tego rodzaju systemów regulacji transkrypcji zaproponował Nixon i in. (1986). Po raz pierwszy ogólny mechanizm działania systemów dwukomponentowych wykazali Ninfa i Magasanik (1986). Dzisiaj mechanizm ten poznany jest szczegółowo na podstawie między innymi badań krystalograficznych (Cybulski i in. 2014). Oba komponenty tego typu systemu są białkami dwudomenowymi. Komponenta osadzona w błonie poza domeną receptorową zawiera domenę przekaźnikową o aktywności kinazy histydynowej, która aktywowana wiązaniem liganda przez część receptorową katalizuje autofosforylację a następnie przeniesienie grupy fosforanowej na resztę kwasu asparaginowego w domenie odbiornikowej drugiego białka systemu dwukomponentowego prowadzącą do zmian konformacyjnych aktywujących domenę efektorową. Domena efektorowa jest drugą, obok domeny odbiornikowej, domeną drugiej komponenty systemu i aktywowana posiada zdolność wiązania do DNA (Parkinson i Kofoid 1992; Stock i Da Re 2000; Ulrich i in. 2005). Za ewolucyjnym pokrewieństwem układów dwukomponentowych z systemami jednokomponentowymi przemawia kilka faktów. Systemy jednokomponentowe przewyższają rozprzestrzenieniem i liczbą systemy dwukomponentowe. Domeny receptorowe i efektorowe w systemach jednokomponentowych wykazują znacznie większe zróżnicowanie a ponadto wśród nich znajdują się domeny występujące także w systemach dwukomponentowych. Z kolei wśród systemów dwukomponentowych nie istnieją żadne unikalne domeny, których nie można by było odnaleźć w systemach jednokomponentowych (Ulrich i in. 2005). Ponadto systemy dwukomponentowe u Archaea występują bardzo rzadko i uważa się, że pojawiły się one na drodze transferu horyzontalnego z bakterii, gdzie miały swój ewolucyjny początek. Zjawisku transferu horyzontalnego przypisuje się również udział w rozprzestrzenianiu się systemów dwukomponentowych wśród samych bakterii (Koretke i in. 2000; Ulrich i in. 2005; Alm i in. 2006).
Najbardziej znaną funkcją systemów dwukomponentowych wśród bakterii jest quorum sensing, czyli recepcja zagęszczenia populacji (Kleerebezem i in. 1997). W przypadku gronkowca złocistego odpowiada za to system agr. Reguluje on ekspresję wielu czynników, w tym związanych z przebiegiem patogenezy, w przejściu z eksponencjalnej fazy wzrostu do fazy stacjonarnej a jego operon składa się z 5 genów wśród których dwa kodują składowe klasycznego układu dwukomponentowego (Recsei i in. 1986; Peng i in. 1988; Lyon i Novick 2004; Novick i Geisinger 2008). Pierwszy z pięciu genów operonu koduje cząsteczkę RNA III. Kolejne dwa agrB i agrD odpowiednio białko transporterowe i cząsteczkę peptydu. Białko transporterowe katalizuje cyklizację peptydu, a przez to formowanie się cząsteczki sygnałowej zwanej autoinduktorem, i odpowiada za jego eksport poza komórkę. Natomiast ostatnie dwa geny, agrA i agrC, kodują składniki systemu dwukomponentowego, gdzie białko AgrC posiada część receptorową i kinazową a AgrA jest cząsteczką efektorową regulującą transkrypcję genów (Lina i in. 1998; George Cisar i in. 2009). System ten wzbudzany jest cząsteczką autoinduktora, wtedy gdy jej stężenie osiągnie wartość progową. Odpowiedniki systemów dwukomponentowych, takich jak przedstawiony wyżej i będący częścią systemu agr S. aureus, związane z quorum sensing można odnaleźć w wielu innych bakteriach, nie tylko Gram dodatnich. Przykładem są Streptococcus pneumoniae, Vibrio harveyi, Enterococcus faecalis, Escherichia coli czy Pseudomonas aeruginosa (Pestova i in., 1996; Freemen i in., 1999; Hass i in., 2002; Sperandio i in., 2002; Dong i in., 2005). System taki odnaleziono nawet w eukariotycznym gatunku drożdży Candida albicans (Kruppa i in. 2004), co sugeruje długą ewolucyjną historię systemów dwukomponentowych.
Stosunkowo dobrze scharakteryzowanym systemem dwukomponentowym gronkowca złocistego jest system HssRS (Torres i in. 2007). Jest on powiązany z jednym z najważniejszych dla bakterii wirulentnych aspektem pozyskiwania mikroelementów, czyli pozyskiwaniem żelaza z tkanek gospodarza (Mazmanian i in. 2003; Torres i in. 2006). System HssRS jest aktywowany w obecności hemu i najprawdopodobniej wynika to z bezpośredniego oddziaływania hemu z komponentą HssR. Jednak bezpośredniość tej interakcji nie jest jednoznacznie udowodniona (Torres i in. 2007). System ten pełni istotną rolę w eliminacji ryzyka związanego z cytotoksycznością nadmiaru hemu (Everse i Hsia 1997), który wynika z wysokiej wydajności systemu jego pozyskiwania (Skaar i Schneewind 2004). Odbywa się to na drodze wzrostu ekspresji, regulowanej przez komponentę HssR, transportera typu ABC HrtAB (Torres i in. 2007). Transportery ABC są transporterami zawierającymi domenę wiążącą ATP wykorzystującymi jego hydrolizę jako źródło energii (ang. ATP-binding cassette transporters). Transporter ten wypompowuje hem na zewnątrz komórki zapobiegając zahamowaniu wzrostu komórek bakterii w jego obecności (Friedman i in. 2006).
Innym przykładem systemu dwukomponentowego u gronkowca złocistego jest system VraSR S. aureus. Odgrywa on rolę w biosyntezie ściany komórkowej. Bezpośredni induktor tego systemu nie jest znany ale sam system ulega aktywacji w przypadku stresu wywołanego zaburzeniem struktury ściany komórkowej czynnikami, takimi jak peptydy antybakteryjne, antybiotyki, w tym wankomycyna, czy nawet związki roślinne, takie jak galusan epigalokatechiny (Kuroda i in. 2004; Gardete i in. 2006; Yin i in. 2006; Pietiäinen i in. 2009; Levinger i in. 2012).
W przypadku systemu SrrAB S. aureus molekularny mechanizm wzbudzenia systemu również nie jest opisany, jednak wiadomo, że system jest aktywowany przez niedobór tlenu (Yarwood i in. 2001). Ponadto wykazano, że w takich warunkach może wyciszać ekspresję istotnych czynników wirulencji czy komponent innych systemów regulatorowych powiązanych z modulacją ich ekspresji (Yarwood i in. 2001; Pragman i in. 2004), takich jak białko A, toksyna syndromu szoku toksycznego 1 (TSST-1) czy transkrypt RNAIII systemu agr, które również odpowiada za regulację transkrypcji czynników wirulencji (o czym poniżej).
4.1.3. Systemy trójkomponentowe
Rozwinięciem systemów dwukomponentowych są systemy trójkomponentowe (3CS). W tych systemach doszło z kolei do rozdzielenia domeny receptorowej od domeny przekaźnikowej (rys. 1C). Teoretycznym następstwem takiej sytuacji jest możliwość oddziaływania przez komponentę przekaźnikową z kilkoma komponentami receptorowymi a więc integracji sygnału z różnych receptorów (Marijuán i in. 2010).
W przypadku gronkowca złocistego przykładem takiego systemu jest system BraSR odpowiedzialny za oporność na bacytracynę i nizynę (Sass i in. 2008; Pietiäinen i in. 2009). Aktywuje on ekspresję dwóch transporterów typu ABC: BraDE i VraDE. Podczas gdy VraDE odgrywa rolę w detoksyfikacji poprzez wypompowywanie cząsteczek antybiotyków na zewnątrz komórki, BraDE odpowiada za, niescharakteryzowaną jeszcze w molekularnych szczegółach, recepcję bacytracyny i nizyny oraz oddziaływanie z BraSR (Hiron i in. 2011).
Inne systemy tego typu występujące u różnych gatunków są odpowiedzialne również za ochronę przed peptydami antybakteryjnymi u bakterii Gram dodatnich (Li i in. 2007), ogólną reakcję na stres wywołany naruszeniem struktury ściany komórkowej czynnikami fizycznymi, chemicznymi czy poprzez zaburzenie syntezy jej składników (Suntharalingam i in. 2009), detekcję potencjału oksydoredukcyjnego (Ortiz de Orué Lucana i Groves 2009) czy zewnątrzkomórkową detekcję i metabolizm fruktozy i mannozy (Zeng i in. 2011).
Rys. 1. Schemat obrazujący działanie i rosnącą złożoność wśród systemów jedno-, dwutrójkomponentowych. (A) Systemy jednokomponentowe są najprostsze w swojej architekturze. Część receptorowa (kolor czerwony) i efektorowa (kolor niebieski) stanowią domeny w obrębie tej samej cząsteczki, która bezpośrednio po związaniu cząstki sygnalnej (kolor żółty) ulega aktywacji. (B) Trzonem systemów dwukomponentowych są błonowe białka, w obrębie których znajdują się domeny receptorowe (kolor czerwony) i kinaz histydynowych (kolor zielony). Białka te po związaniu cząsteczki sygnałowej (kolor żółty) dokonują autofosforylacji a następnie przeniesienia grupy fosforanowej na cząsteczkę efektorową (kolor niebieski). Oddzielenie części receptorowej od efektorowej i błonowa lokalizacja umożliwiają recepcję sygnałów pozakomórkowych. (C) Zwiększenie stopnia złożoności, poprzez wyodrębnienie domeny receptorowej (kolor czerwony) i kinazowej (kolor zielony) do postaci niezależnych cząsteczek, umożliwia w systemach trójkomponentowych wzbudzanie jednego systemu poprzez wiele cząsteczek receptorowych, a co za tym idzie, przez różne cząsteczki sygnałowe (na rysunku przedstawiono jedną w kolorze żółtym).
4.1.4. Podjednostki sigma (σ)
Odmiennym sposobem regulacji procesu transkrypcji u bakterii są podjednostki sigma, nazwane przez Staronia i in. (2009) trzecim, po systemach jedno-i dwukomponentowych, filarem przekazu sygnałów u bakterii. Ponieważ są one głównym tematem tej pracy, omówione zostały w szczegółach w kolejnych podrozdziałach.
4.2. Podjednostki sigma (σ) bakteryjnej polimerazy RNA
Reakcję zależnej od DNA syntezy RNA u bakterii katalizuje kompleks polimerazy RNA, złożonej z podjednostek α, β, β' i γ. Podjednostka sigma (σ) bakteryjnej polimerazy RNA jest białkiem posiadającym zdolność wiązania DNA, które po związaniu z kompleksem polimerazy RNA, zwanym również rdzeniem polimerazy, kieruje go do właściwych sobie sekwencji promotorowych (Helmann i Chamberlin 1988; Lonetto i in. 1992; Deora i Misra 1996; Sekine i in. 2012). Bakteryjny kompleks polimerazy u bakterii Gram dodatnich zawiera również dodatkową podjednostkę δ (Pero i in. 1975), która wiąże się z podjednostkami β, β'. Odpowiada ona za zwiększoną selektywność wobec sekwencji promotorowych (Achberger i Whiteley 1981; Lampe i in. 1988; Rabatinová i in. 2013; Weiss i in. 2014). W przypadku gronkowca złocistego wykazano duże różnice w ilości mRNA w obrębie różnych grup transkryptów, między szczepem typu dzikiego a szczepem typu knockout względem podjednostki δ. W tym samym badaniu wskazano dodatkowo na duży spadek ilości transkryptów genów związanych z kluczowymi czynnikami wirulencji (Weiss i in. 2014). Główna podjednostka σ odpowiada za konstytutywną ekspresję genów, ale obok niej istnieją alternatywne formy tej podjednostki, których dostępność jest ściśle regulowana. Nazywane są one alternatywnymi podjednostkami ECF (podjednostki sigma funkcji pozacytoplazmatycznych, zewnątrzkomórkowych, ang. extracytoplasmic function sigma factors).
Z reguły w normalnych warunkach alternatywne podjednostki σ są nieaktywne gdyż występują w stanie związanym z czynnikiem anty-sigma (rys. 2), chociaż istnieją również takie podjednostki ECF, które czynników anty-sigma nie posiadają (Staroń i in. 2009). Alternatywne podjednostki σ są uwalniane w następstwie zadziałania określonych sygnałów i kierują kompleks polimerazy RNA do promotorów genów, których transkrypcja ma zostać uruchomiona albo zwiększona w zaistniałych warunkach. W transdukcję sygnału uwalniającego zaangażowana jest podjednostka anty-sigma będąca często białkiem transbłonowym a samo uwalnianie alternatywnych podjednostek σ podlega bardzo ścisłej regulacji, co zostało omówione w kolejnym podrozdziale.
Rys. 2. Model krystalograficzny czynnika anty-sigma RseA (kolor czerwony) E. coli i związanej przez niego cząsteczki σE (kolor niebieski) w prezentacji stereoskopowej typu crossed-eye. Na podstawie struktury PDB ID 1OR7.
Bakteryjne podjednostki σ dzielą się na dwie duże ewolucyjne rodziny σ70 i σ54, przy czym większość z nich należy do pierwszej z nich, w tym główne podjednostki σ i podjednostki ECF (Wösten 1998; Staroń i in. 2009).
4.3. Mechanizmy transdukcji sygnału
Dostępność alternatywnych podjednostek σ jest ściśle regulowana, tak aby modulowały ekspresję genów tylko w określonych warunkach. Bardzo dobrze opracowane, kompleksowe zestawienie mechanizmów związanych z transdukcją sygnału przez tego typu systemy regulacyjne zaproponował Mascher (2013), niemniej, zróżnicowanie sposobów regulacji dostępności alternatywnych podjednostek σ, podobnie jak i wielu innych procesów życiowych bakterii, trudno jest ująć w ściśle określone ramy. W dalszej części przedstawiono zestawienie najlepiej poznanych mechanizmów aktywacji alternatywnych podjednostek σ w odniesieniu do konkretnych przykładów.
4.3.1. Podjednostka σE Escherichia coli
Podjednostka σE Escherichia coli odpowiada za regulację ekspresji genów związanych z czynnikami prowadzącymi do denaturacji białek (Mecsas i in. 1993; Ho i Ellermeier 2012). Czynniki takie powodują rozfałdowanie struktury białek peryplazmatycznych o strukturze β-baryłki, a co za tym idzie ekspozycję ich niedostępnych struktur, czyli powstanie cząsteczek OMP (ang. misfolded outer membrane proteins).
Rys. 3. Model aktywacji podjednostki σE E. coli. Podjednostka aktywowana jest poprzez kilkustopniową ograniczoną proteolizę jej czynnika anty-sigma RseA, która indukowana jest obecnością rozfałdowanych białek (OMP), przez błonowe (DegS, RseP) oraz cytoplazmatyczne proteazy ClpXP, ClpAP, Lon, FtsH, HslUV („port”). Dokładniejszy opis znajduje się w tekście. Na podstawie Ho i Ellermeier (2012).
Struktury te są wiązane przez domeny znajdujące się w dwóch białkach: DegS i RseB. Białko DegS jest proteazą zakotwiczoną elementem transmembranowym w błonie, która wiążąc rozfałdowane białka ulega aktywacji (Walsh i in. 2003; Wilken i in. 2004). Natomiast białko RseB wiąże się z transbłonowym czynnikiem anty-sigma RseA, które wiąże podjednostkę σE (Missiakas i in. 1997; Collinet i in. 2000; Campbell i in. 2003; Cezairliyan i Sauer 2007; Kim i in. 2010), i najprawdopodobniej chroni czynnik RseA przed przypadkową proteolizą. Jednak po związaniu struktur rozfałdowanych białek, białko RseB ulega dysocjacji od czynnika RseA udostępniając go aktywowanej proteazie DegS. DegS degradując peryplazmatyczną część czynnika RseA (Ades i in.
1999; Ades 2004) czyni go substratem dla innej proteazy zakotwiczonej elementem transmembranowym w błonie od strony wnętrza komórki. Odcina ona cytoplazmatyczną część czynnika RseA związaną z podjednostkę σE (Alba i in. 2002; Kanehara i in. 2002; Kanehara i in. 2003). Ostatnim krokiem jest zakończenie degradacji czynnika RseA przez cytoplazmatyczne proteazy, takie jak ClpXP, ClpAP, Lon, FtsH czy HslUV (Flynn i in. 2004; Chaba i in. 2007), a w konsekwencji uwolnienie aktywnej alternatywnej podjednostki σE i uruchomienie transkrypcji z rozpoznawanych przez nią promotorów (rys. 3). W opisany system transdukcji sygnału jest również zaangażowane błonowe białko RseC, które stymuluje uwalnianie podjednostki σE ale mechanizm jego oddziaływania nie jest jeszcze wyjaśniony (Missiakas i in. 1997; Missiakas i Raina 1998).
4.3.2. Podjednostka σW Bacillus subtilis
Podobnie, wygląda regulacja dostępności podjednostki σW Bacillus subtilis (rys. 4). W tym przypadku jednak mechanizm nie jest jeszcze tak dobrze poznany jak dla podjednostki σE E. coli, szczególnie mechanizmu recepcji sygnału. Podjednostka σW uwalniana jest w trakcie stresu związanego ze ścianą i błoną komórkową (Kingston i in. 2011) wywołanego różnymi czynnikami chemicznymi, takimi jak alkalizacja (Wiegert i in. 2001; Wilks i in. 2009) czy antybiotyki (Cao i in. 2002; Helmann 2006; Mascher i in. 2007) a także biologicznymi, jak peptydy antybakteryjne (Pietiäinen i in. 2005; Butcher i Helmann 2006). Podjednostka σW pozostaje związana z transmembranowym czynnikiem anty-sigma RsiW (Schöbel i in. 2004; Yoshimura i in. 2004). Podobnie jak to ma miejsce dla podjednostki σE E. coli, kaskada przekazu sygnału obejmuje wieloetapową degradację proteolityczną czynnika anty-sigma. Pierwszą proteazą trawiącą zewnątrzkomórkowy fragment RsiW jest metaloproteaza PrsW (Ellermeier i Losick 2006; Heinrich i Wiegert 2006; Heinrich i in. 2009). Jednak trawienie przez PrsW nie jest wystarczające do utworzenia z RsiW substratu dla kolejnej proteazy i postuluje się istnienie jeszcze innej proteazy, która prowadzi do całkowitej degradacji zewnątrzkomórkowej części RsiW (Heinrich i in. 2009). Kolejną proteazą w kaskadzie jest RasP (Schöbel i in. 2004; Ellermeier i Losick 2006; Heinrich i in. 2009), która odcina część wewnątrzkomórkową RsiW związaną z podjednostką σW. Dalszej degradacji części RsiW, która nadal jest związana z podjednostką σW, dokonują cytoplazmatyczne proteazy ClpX i ClpEP (Zellmeier i in. 2006). Opisany system zawiera również dodatkowy komponent YsdB, który podobnie do RseB E. coli reguluje negatywnie uwalnianie podjednostki σW (Turner i Helmann 2000), jednak mechanizm tej regulacji nie jest jeszcze poznany.
Rys. 4. Model aktywacji podjednostki σW B. subtilis. Podjednostka aktywowana jest poprzez kilkustopniową ograniczoną proteolizę jej czynnika anty-sigma RsiW przez błonowe (spośród których zidentyfikowane są PrsW, RasP) oraz cytoplazmatyczne proteazy ClpXP i ClpEP („port”). Dokładniejszy opis znajduje się w tekście. Na podstawie Ho i Ellermeier (2012).
4.3.3. Podjednostka σB Bacillus subtilis i Staphylococcus aureus
U obu omawianych gatunków podjednostka σB (Haldenwang i Losick 1980) (Binnie i in. 1986; Duncan i in. 1987) jest wiązana przez czynnik anty-sigma RsbW (Boylan i in. 1992; Benson i Haldenwang 1993). Z kolei czynnik RsbW jest również kompetycyjnie wiązany przez czynnik anty-anty-sigma RsbV (Benson i Haldenwang 1993; Dufour i Haldenwang 1994; Voelker i in. 1996b), ale tylko wtedy gdy sam nie jest ufosforylowany (Dufour i Haldenwang 1994). Ponadto czynnik anty-sigma RsbW fosforyluje czynnik anty-anty-sigma RsbV (Dufour i Haldenwang 1994). Układ ten pozostaje zatem nieaktywny, gdyż ufosforylowany czynnik RsbV nie wiąże czynnika RsbW a dzięki temu wolny czynnik RsbW może wiązać podjednostkę σB. Kluczową rolę w aktywacji tego systemu odgrywają omówione w następnym akapicie fosfatazy, które aktywowane defosforylują czynnik RsbV i przesuwając równowagę wiązania w kierunku RsbW-RsbV uwalniają podjednostkę σB (rys. 5). W tym momencie pojawiają się zasadnicze różnice między B. subtilis a S. aureus.
Rys. 5. Model aktywacji podjednostki σB B. subtilis. Podjednostka aktywowana jest poprzez tak zwaną wymianę partnerów. Podjednostka σB może zostać uwolniona poprzez wiązanie jej czynnika anty-sigma RsbW przez nieufosforylowany czynnik anty-anty-sigma RsbV. Jednak sam czynnik RsbW dokonuje fosforylacji swojego czynnika anty-anty-sgima RsbV przez co podjednostka σB pozostaje związana w kompleksie ze swoim czynnikiem anty-sigma RsbW. Aktywowane różnymi czynnikami stresowymi fosfatazy RsbP i RsbU defosforylują czynnik RsbV przesuwając równowagę w kierunku związanego czynnika anty-sigma RsbW i uwolnionej podjednostki σB. Dokładniejszy opis znajduje się w tekście. Na podstawie Pané-Farré i in. (2006).
U B. subtilis istnieją dwie poznane ścieżki uwalniania podjednostki σB poprzez defosforylację czynnika RsbV. Jedna związana jest ze stresem energetycznym i zależy od fosfatazy RsbP (Vijay i in. 2000; Delumeau i in. 2002; Brody i in. 2009), a druga z ogólnie pojętymi stresami środowiskowymi i zależy od kompleksu białek integrującego przekaz różnych sygnałów zwanego stresosomem, który w efekcie prowadzi do stymulacji fosfatazy RsbU (Voelker i in. 1995a; Voelker i in. 1995b; Voelker i in. 1996a; Voelker i in. 1996b). Geny wszystkich komponent, związanych z drugą z opisanych ścieżek przekazu sygnału, znajdują się w jednym ośmiogenowym operonie podjednostki σB (Kalman i in. 1990; Wise i Price 1995).
Natomiast u S. aureus brak jest zarówno genów, których produkty formują stresosom, jak i odpowiednika genu fosfatazy RsbP a podjednostka σB znajduje się w czterogenowym operonie razem z genami czynnika anty-sigma RsbW, czynnika antyanty-sigma RsbV i fosfatazy RsbU (Deora i in. 1997; Kullik i Giachino 1997; Senn i in. 2005). Sam mechanizm aktywacji fosfatazy RsbU u S. aureus jest słabo poznany. Jednak wiele badań wskazuje na silną zależność pomiędzy RsbU a prawidłowym działaniem systemu związanego z podjednostką σB w różnych warunkach stresowych do tego stopnia, że można zaryzykować stwierdzenie, że jest to jedyna ścieżka jego aktywacji (Senn i in. 2005; Pané-Farré i in. 2006; Pané-Farré i in. 2009). Warto jednak w tym miejscu zwrócić uwagę, że powyżej operonu podjednostki σB u S. aureus kodowany jest system toksyna-antytoksyna mazEFSa, którego geny mogą ulegać kotranskrypcji z operonem podjednostki σB (Donegan i Cheung 2009). Istotne w tym kontekście są również sugestie powiązania układu mazEFSa z regulacją ekspresji czynników wirulencji poprzez trawienie komórkowego mRNA (Zhu i in. 2009).
4.3.4. Inne modele regulacji aktywności alternatywnych podjednostek σ
Mechanizm regulacji aktywacji opisanych wcześniej podjednostek σE E. coli i σW Bacillus subtilis opiera się o ograniczoną proteolizę. Natomiast w przypadku podjednostek σB B. subtilis i S. aureus zachodzi on na zasadzie wymiany partnera: podjednostka σB jest wypierana z kompleksu przez czynnik anty-anty-sigma. Mascher (2013) wyróżnia jeszcze kilka innych mechanizmów aktywacji: (1) zmiany konformacyjne cytoplazmatycznego czynnika anty-sigma, które odgrywają rolę np. w recepcji zmian potencjału oksydoredukcyjnego, przykładowo σR/RsrA Streptomyces coelicolor (Li i in. 2002); (2) oddziaływania białko-białko, również prowadzące do zmian konformacyjnych, przykładowo FecI/FecR E. coli (Braun i Mahren 2005); (3) proteolizę C-terminalnego odcinka podjednostki σ, który funkcjonuje jako czynnik anty-sigma uniemożliwiając wiązanie się podjednostki σ z polimerazą i promotorem, przykładowo CorE Myxococcus xanthus (Gómez-Santos i in. 2011; Wecke i in. 2012);
(4) aktywację transkrypcyjną z wykorzystaniem systemów dwukomponentowych, w którym to przypadku brak jest czynnika anty-sigma a podjednostka σ ulega ekspresji w ściśle określonych warunkach, przykładowo SigE S. coelicolor (Paget i in. 1999; Hong i in. 2002); (5) hipotetyczny mechanizm bezpośredniej kontroli podjednostki σ przez transbłonowe kinazy serynowo-treoninowe, proponowany na podstawie sąsiedztwa genetycznego wielu domniemanych alternatywnych podjednostek σ (Staroń i in. 2009; Jogler i in. 2012).
Jak wcześniej wspomniano podział ten nie jest w stanie objąć wszystkich przypadków. Przykładam takiego przypadku może być unikalny mechanizm regulacji aktywności podjednostki σF regulującej powstawanie wici u Salmonella typhimurium. Podjednostka σF związana jest z czynnikiem anty-sigma FlgM, który ulega inaktywacji będąc transportowanym na zewnątrz komórki przez uformowane ciałko podstawowe powstającej nici (Kutsukake 1994). Podobnie funkcjonuje homologiczny system u Bacillus subtilis (Calvo i Kearns 2015).
W kolejnym rozdziale opisane zostały wszystkie znane alternatywne podjednostki σ u gronkowcowa złocistego oraz mechanizmy ich działania w zakresie, w którym są obecnie poznane.
4.4. Podjednostki sigma (σ) Staphylococcus aureus
4.4.1. Podjednostka podstawowa sigma A (σA)
Główna podjednostka σ bakteryjnej polimerazy RNA, której odpowiednikiem u
E. coli jest podjednostka σ70 a u bakterii Gram dodatnich podjednostka σA (Basheer i Iordanescu 1991), przez niektórych autorów oznaczana dla gronkowca złocistego również jako σSA (Deora i Misra 1996), pełni tę samą zasadniczą funkcję u wszystkich bakterii. Ze względu na uniwersalną funkcję i wysoką konserwatywność sekwencji tego białka, umieszczona tutaj charakterystyka odnosi się nie tylko do gronkowca złocistego a ogólnie do bakterii. Główna podjednostka σ zawiaduje podstawową transkrypcją, zatem sekwencję konsensusową, którą rozpoznaje, można znaleźć w promotorach większości genów. Nierzadko sekwencja ta występuje obok sekwencji rozpoznawanych przez alternatywne podjednostki σ, jeżeli wymagany jest określony podstawowy poziom transkrypcji danych genów, których transkrypcja ulega wzmocnieniu przez podjednostki alternatywne w ściśle określonych warunkach. Na każdy genom przypada tylko jedna podjednostka główna (Gruber i Bryant 1997). Ze względu na dużą konserwatywność sekwencji głównej podjednostki sigma wśród wszystkich bakterii (Wösten 1998) te same przeciwciała potrafią krzyżowo wiązać te białka z szerokiego spektrum gatunków filogenetycznie bardzo odległych, takich jak E. coli, B. subtilis czy
S. aureus (Deora i Misra 1995; Rao i in. 1995). Ponadto ich promotorowe sekwencje konsensusowe są do siebie zbliżone na tyle (Pátek i in. 1996; Helmann 1995), że można także w ich przypadku obserwować krzyżową międzygatunkową inicjację transkrypcji (Deora i Misra 1996). Uniwersalna sekwencja konsensusowa to odpowiednio TTGACA dla kasety -35 i TATAAT dla kasety -10. Warto tutaj zwrócić uwagę na fakt, że sekwencja konsensusowa -35 nie jest konieczna jeżeli w obrębie promotora znajduje się tak zwany rozszerzony motyw -10, czyli sekwencja TGnTATAAT (Keilty i Rosenberg 1987; Kumar i in. 1993).
4.4.2. Podjednostka sigma B (σB)
Pierwszą z alternatywnych podjednostek σ opisano dla gronkowca złocistego (Wu 1996; Kullik i Giachino 1997) jako homolog wcześniej scharakteryzowanej podjednostki o tej samej nazwie występującej u Bacillus subtilis (Haldenwang i Losick 1979; Haldenwang i Losick 1980; Haldenwang i in. 1980; Binnie i in. 1986; Boylan i in. 1992; Duncan i in. 1987). Ewolucyjne podobieństwo sprawia, że podjednostki σB obu tych gatunków są w stanie krzyżowo rozpoznawać swoje promotory. Natomiast podstawowa podjednostka σA nie potrafi inicjować transkrypcji w obrębie promotorów podjednostki σB, nawet w układzie homologicznym (Deora i in. 1997). Podjednostki σB w przypadku obu gatunków związane są z reakcją na różne czynniki stresowe. W przypadku gronkowca złocistego, wzrost ekspresji podjednostki σB w fazie posteksponencjalnej jak i w wyniku szoku cieplnego został zaobserwowany już przez Kullik i in. (1997). Ponadto ekspresja genu podjednostki σB jest również silnie indukowana w warunkach alkalizacji lub działania 1 mM MnCl2 czy 10% NaCl (Pané-Farré i in. 2006).
Jednak szybko pojawiły się sugestie, że podjednostka σB może wpływać na regulację ekspresji genów związanych z wirulencją. Pierwsza tego typu analiza dotyczyła genu gronkowcowego regulatora transkrypcji SarA (Cheung i in. 1992; Cheung i Projan 1994; Cheung i Ying 1994), który w fazie posteksponencjalnej indukuje ekspresję czynników wirulencji takich jak białko wiążące fibrynogen czy alfahemolizynę, a jego aktywność konieczna jest do pełnej funkcjonalności systemu agr (Chien i Cheung 1998; Cheung i in. 1999; Cheung i in. 2009). Powyżej tego genu znajduje się jedna z trzech sekwencji promotorowych P3, która jest rozpoznawana przez podjednostkę σB i która istotnie warunkuje ekspresję regulatora SarA w fazie posteksponencjalnej (Deora i in. 1997; Cheung i in. 1999). W innych badaniach dotyczących szczepów typu dzikiego i szczepów typu knockout zaobserwowano warunkowanie przez podjednostkę σB pozakomórkowej aktywności lipazowej nukleazowej (Kullik i in. 1998), a ponadto zaangażowanie podjednostki σB w reakcję na alkalizację i stres oksydacyjny.
Niemniej nowsze badania technikami wysokoprzepustowymi dają bardziej złożony obraz zaangażowania podjednostki σB w potencjał patogenny szczepów gronkowca złocistego. Pierwsze tego typu badanie wykonane przez Gertz i in. (2000) metodą elektroforezy dwuwymiarowej nie doprowadziło do identyfikacji wielu potencjalnych celów podjednostki σB, poza wykazaniem wcześniej zaobserwowanego wpływu na ekspresję regulatora SarA, gdyż udało się zidentyfikować tylko 18 białek. Jednak dzięki tej wiedzy i na podstawie dostępnego już genomu gronkowca złocistego, autor wyznaczył sekwencję konsensusową dla gronkowcowej podjednostki σB, region -35 GTTTTA i region -10 TGGAAA, która była zbieżna z domniemaną sekwencją wyznaczoną przez Wu (1996). Badania mikromacierzowe przeprowadzone przez Bishoff i in. (2004) z wykorzystaniem szczepu typu knockout ukazały pełniejszy obraz sytuacji, niemniej bardziej skomplikowany. Wyznaczony regulon podjednostki σB , czyli grupa genów, których ekspresja jest przez nią regulowana, zawierał geny przynależne do różnych grup funkcjonalnych. Razem 229 genów, w tym 52, których ekspresja ulegała represji. W odniesieniu do czynników wirulencji okazało się, że geny zewnątrzwydzielniczych toksyn, takich jak alfa-i gamma-hemolizyna, oraz proteaz, takich jak stafopainy, proteazy z rodziny Spl, proteaza V8, ulegały mniejszej ekspresji w szczepie typu dzikiego. Natomiast zwiększonej ekspresji ulegały geny powierzchownych białek adhezji. Zatem aktywacja podjednostki σB powoduje wyciszenie ekspresji białek zewnątrzwydzielniczych i zwiększenie ekspresji białek powierzchniowych. Podobny trend zaobserwował Pané-Farré i in. (2006) porównując transkryptomy szczepu typu dzikiego i typu knockout nie tylko w warunkach normalnego wzrostu ale również w warunkach alkalizacji. Ponieważ alkalizacja silnie indukowała ekspresję podjednostki σB, przeprowadzona analiza była bardziej selektywna i pozwoliła wytypować 77 genów podlegających regulacji przez podjednostkę σB.
4.4.3. Podjednostka sigma H (σH)
Podjednostka σH została zidentyfikowana na podstawie kontekstu genetycznego oraz w mniejszym stopniu na podstawie bardzo ograniczonej homologii do tak samo nazwanej podjednostki pochodzącej z Bacillus subtilis (Morikawa i in. 2003), która powiązana jest z inicjalizacją wytwarzania form przetrwalnikowych jak i naturalną kompetencją, czyli zdolnością pobierania materiału genetycznego z otoczenia (Grossman 1995). Konsensusowa sekwencja promotorowa, do której wiąże się ta podjednostka, została zaproponowana już przez Morikawę i in. (2003) ale dalece lepiej określona przez Fagerlunda i in. (2014). Obejmuje ona wysoce konserwatywne sekwencje AGTAA w regionie -35 oraz ACGTG w regionie -10. W toku innych badań wykazano zaangażowanie podjednostki σH w zjawisko naturalnej kompetencji u S. aureus, szczególnie poprzez indukcję ekspresji operonów comE i comG (Morikawa i in. 2003; Morikawa i in. 2012), która jest ogólnie bardzo niska. Rozszerzona analiza potencjalnego regulonu wskazuje, że podjednostka σH reguluje również ekspresją genów dprA i coiA oraz może działać synergistycznie z produktem genu comK1 (Fagerlund i in. 2014). Wszystkie spośród trzech wspomnianych genów są związane ze zjawiskiem naturalnej kompetencji (van Sinderen i in. 1995; Ogura i in. 2002a; Ogura i in. 2002b; Claverys i in. 2009; Johnston i in. 2014). U bakterii Gram dodatnich mechanizm kompetencji związany jest w wykształcaniem pili, które, jak się sugeruje, wiążą dwuniciowe DNA a następnie ulegając retrakcji transportują je poprzez warstwę pepdydoglikanowej ściany. DNA jest następnie wiązane na powierzchni błony komórkowej przez inne białka, których geny znajdują się również w regulonie podjednostki σH. W dalszym ciągu tego procesu jedna z nici poddawana jest trawieniu i DNA w postaci jednoniciowej jest transportowane transbłonowo do wnętrza komórki (Laurenceau i in. 2013). Niewielka naturalna kompetencja gronkowców jest przypisywana niskiej ekspresji czynników ją warunkujących, w tym związanych z formowaniem pili (van der Kooi-Pol i in. 2012). Wiedza na temat białek regulujących zdolność pobierania obcego materiału genetycznego z otoczenia, w tym podjednostki σH, oraz mechanizmu integrującego ich działanie jest kluczowa ze względu na fakt istotności transferu horyzontalnego w migracji determinant wirulencji wśród gronkowców (Lowder i in. 2009) jak i w kontekście opracowania narzędzi niezwykle przydatnych w badaniach nad tymi oportunistycznymi patogenami (Prax i in. 2013).
4.4.4. Podjednostka sigma S (σS)
Podjednostka σS została stosunkowo niedawno zlokalizowana w genomie i σYlaC
gronkowca złocistego, na podstawie homologii do podjednostek σM Bacillus subtilis, i opisana przez Shaw i in. (2008). Podobnie jak w przypadku podjednostki σH dokładny mechanizm regulacji jej aktywności nie jest poznany. Autorzy wspomnianej pracy (Shaw i in. 2008) nie zaobserwowali zmian w ekspresji podjednostki w hodowlach poddawanych czynnikom stresowym związanym między innymi z zakwaszeniem, alkalizacją, stresem oksydacyjnym, działaniem antybiotyków czy substancji naruszających integralność strukturalną błony komórkowej. Dla wspomnianego szerokiego zakresu czynników stresowych, nie zaobserwowano również żadnych różnic w strefie zahamowania wzrostu między szczepem typu dzikiego a szczepem typu knockout dla omawianej tutaj podjednostki, podczas przeprowadzania testów dyfuzyjnych na podłożach stałych. Zaobserwowano jednak różnice w przeżywalności, która była obniżona w przypadku szczepu typu knockout, podczas hodowli w warunkach normalnych, które trwały od 11 do 21 dni. Różnice tego typu zaobserwowano również dla krótszych czasów (do 120 min) w przypadku hodowli prowadzonych w podwyższonej temperaturze czy też w ograniczonym stopniu, dla hodowli traktowanej detergentem Triton X-100. Wykazano ponadto obniżoną śmiertelność zainfekowanego gospodarza i bardziej ograniczone rozprzestrzenianie ogólnoustrojowe w przypadku szczepu typu knockout w mysim modelu zakaźnego zapalenia stawów. Kontynuacja badań nad podjednostką σS pozwoliła na powiązanie wzrostu jej ekspresji w odpowiedzi na czynniki uszkadzające DNA. Istotnym jest tutaj fakt, że intensywność tej odpowiedzi była zróżnicowana w różnych szczepach gronkowca złocistego. Ponadto wykazano wzrost ekspresji podjednostki σS w wyniku działania komplementu plazmy wieprzowej oraz w następstwie fagocytozy przez mysie makrofago-podobne komórki. Określono również sekwencję konsensusową wiązaną przez tę podjednostkę: CAAAGT-n12-TATCA (Miller i in. 2012). Niemniej, gronkowcowa podjednostka σS pozostaje najmniej zbadaną wśród wszystkich alternatywnych podjednostek sigma i niepowiązaną bezpośrednio z żadnymi znanymi mechanizmami odpowiedzi na zmiany warunków zewnątrz czy wewnątrzkomórkowych.
5. CELE PRACY
Gronkowce są gatunkami komensalicznymi egzystującymi jako składnik normalnej flory ludzi i zwierząt, niemniej stanowią również oportunistyczne patogeny, będące przyczyną znacznego odsetka szpitalnych zakażeń, co w szczególności dotyczy gronkowca złocistego (Staphylococcus aureus) (Arnason i in. 2010; Downie i in. 2013; Gudiol i in. 2013; Huoi i in. 2013; Kanoksil i in. 2013; Luthander i in. 2013) i strat w hodowli zwierząt (Kibenge i in. 1982; Bradley i in. 2007; Ericsson Unnerstad i in. 2009). Istotne znaczenie w tym kontekście ma również zjawisko transferu horyzontalnego genów między szczepami tego samego gatunku lub różnymi gatunkami, który poza tym, że obejmuje również geny związane z wirulencją (Lowder i in. 2009; Lowder i Fitzgerald 2010) i antybiotykoopornością, może być potęgowany przez zdolność gronkowców do przeżycia na powierzchniach przedmiotów znajdujących się w miejscach publicznego użytku (Faria i in. 2009; Roberts i in. 2011; Uhlemann i in. 2011; Fluit i in. 2013; Mkrtchyan i in. 2013). Fakty te uzasadniają szczegółowe badania nad metabolizmem gronkowca złocistego i jego regulacją, które mogą przyczynić się do opracowania nowych terapii.
Niedawno opublikowane badania dotyczące systemu toksyna-antytoksyna pemIKSa gronkowca złocistego i przeprowadzone w zespole badawczym, którego członkiem jest autor niniejszej pracy, ukazują w jaki sposób może przebiegać złożona regulacja ekspresji genów związanych z wirulencją (Bukowski i in. 2011; Bukowski i in. 2013). W toku tych badań odkryto potencjalne powiązanie systemu pemIKSa z genem hipotetycznego białka wiążącego DNA (nazywanego w tej pracy saoC).
Celem niniejszej pracy była charakterystyka hipotetycznego operonu saoABC jako operonu nieopisanego dotąd systemu regulacji ekspresji genów u gronkowca złocistego. Charakterystyka ta odnosi się w szczególności do:
•
Zbadania bezpośredniego wpływu systemu pemIKSa na transkrypcję genu saoC.
•
Określenia potencjalnego operonu, którego częścią jest gen saoC, oraz jego położenia w bardziej ogólnym kontekście genetycznym.
•
Analizy rozprzestrzenienia genu saoC wśród rodzaju Staphylococcus poszukiwanie jego homologów u innych bakterii.
•
Potwierdzenia charakteru białka SaoC jako białka wiążącego DNA.
•
Analizy zmian ekspresji genów operonu, do którego przynależy gen saoC,w różnych warunkach stresowych.
•
Sprawdzenia lokalizacji komórkowej białka SaoC.
•
Skonstruowania szczepów typu knockout dla genu saoC oraz genów znajdujących się z nim w jednym operonie.
•
Zbadania istotności genu saoC i genów znajdujących się z nim w jednym operonie dla dynamiki wzrostu bakterii oraz stopnia ich wirulencji.
•
Określenia zmian w proteomie komórki bakteryjnej wywoływanych aktywnością białka SaoC, które miałyby wynikać z jego zdolności wiązania DNA a przez to modulacji ekspresji genów.
•
Weryfikacji hipotezy dotyczącej genu saoC jako składnika nieopisanego dotychczas systemu regulacji ekspresji genów u gronkowca złocistego.
6. MATERIAŁY I METODY
W opisanych w tej części protokołach biologii molekularnej, w stosunku do końcowych produktów izolacji i oczyszczania kwasów nukleinowych i białek oraz przeprowadzanych z ich wykorzystaniem reakcji stosowano wyłącznie podwójnie destylowaną, filtrowaną, sterylną i wolną od nukleaz wodę.
6.1. Lista oligonukleotydów
W niniejszym rozdziale zestawiono dane na temat oligonukleotydów (tab. 1 i tab. 2) wykorzystanych do przygotowania konstruktów plazmidowych (por. 6.2 i 6.4.11) oraz do przeprowadzenia reakcji Real-Time PCR (por. 6.6) na potrzeby opisanych w tej pracy badań. Oligonukleotydy służące do analizy występowania genu saoC wśród różnych gatunków gronkowca są zestawione w pracy Bukowskiego i in. (2015).
Tab. 1. Lista oligonukleotydów wykorzystanych jako startery w reakcji PCR w procesie tworzenia konstruktów plazmidowych. Nazwa każdego oligonukleotydu zawiera nazwę genu operonu saoABC, który znajduje się w obrębie powielanego fragmentu. Początek nazwy: pT, pD, pC35, pC51 i pK nawiązuje do docelowego dla powielanego fragmentu DNA plazmidu, odpowiednio: pACYCDuet, pETDuet, pCN35, pCN51 i pKOR-1. Dodatkowe oznaczenia to tail, fragment 100 pz poniżej sekwencji genu saoC, oraz up i down, fragment 1000 pz odpowiednio powyżej lub poniżej danego genu. Pogrubiono nukleotydy wyrównujące ramkę odczytu lub odpowiadające kodonom specjalnym start i stop. Pogrubioną kursywą zaznaczono domniemane miejsce wiązania rybosomu (RBS, ang. ribosome binding site) dla genu saoC. Pojedyncze podkreślenie oznacza nukleotydy dodane w celu flankowania lub separacji miejsc restrykcyjnych i kodonów specjalnych. Podwójnie podkreślono miejsca restrykcyjne.
Nazwa Sekwencja Miejsce restrykcyjne
pTsaoB-F CGCGGATCCGGAATTTAAAACCATTCAATC BamHI
pTsaoB-R CCGCTCGAGTTAAAATGGTTTACGTAAATCC XhoI
pTsaoC-F CGCGGATCCGTTAACTAAAGAATTTGCAC BamHI
pTsaoC-R CCGCTCGAGTTACAGGTTGAATAAACG XhoI
pDsaoB-R CCGGTCGACTTAAAATGGTTTACGTAAATCC SalI
pDsaoC-F ATACATATGTTAACTAAAGAATTTGCACAACG NdeI
pC35saoA-F ACATGCATGCATAACTGCTTAGGTAATCTT PaeI
pC35saoA-R ACATGCATGCCTAAGCTTTGGGACCTTT PaeI
pC35saoB-F ACATGCATGCTTATCACACTGAATTCAAAATG PaeI
pC35saoB-R1 CCGGTCGACAAATGGTTTACGTAAATCC SalI
pC35saoB-R2 TGGGGTACCTTAAAATGGTTTACGTAAATCC KpnI
pC35saoC-F1 CGCGGATCCACAAACTTGAAATCACTAAC BamHI
pC35saoC-F2 TGGGCATGCGGTTGGGGTACCACAAACTTGAAATCACTAAC PaeI, KpnI
pC35saoC-R2 CCGGTCGACCAGGTTGAATAAACGTG SalI
pC35tail-F2 CGCGGATCCACTTGTGATTTGAACACAAATTT BamHI
pC35tail-R TCCGAATTCAGGAATACACAGGAGCCA EcoRI
pC35gfpmut2-F CCGGTCGACACATCAGGTGGAGGTGGATCAGGTGGAGGTGGATCAG CAAGTAAAGGAGAAGAACTTTT SalI
pC35gfpmut2-R CGCGGATCCTTATTTGTATAGTTCATCCATG BamHI
pC51saoC-F CCGGTCGACTAACTAACTAATGCAGAAAGGACTTTAAAGTATG SalI
pC51saoC-R CGCGGATCCTTACAGGTTGAATAAACGTGCG BamHI
pKsaoAup-F GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTGATGCCCATTTTGGAA ACTCTTTTC attbB1*
pKsaoAup-R AGGTCCCCGCGGAGTTGTCGCCCCTTTAAAAATTTG SacII
pKsaoAdown-F AGGTCCCCGCGGTTATCACACTGAATTCAAAATGAGATTAC SacII
pKsaoAdown-R GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTCTTCTAAATGTTGAA CAATTTTACGGAC attbB2*
pKsaoCup-F GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGTTCAAGAACATAACTC AGCATATG attbB1*
pKsaoCup-R AGGTCCCCGCGGACTTTAAAGTCCTTTCTGCATATAC SacII
pKsaoCdown-F AGGTCCCCGCGGACTTGTGATTTGAACACAAATTTAATAC SacII
pKsaoCdown-R GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTATCAGTGTAAGAAAAGC ATTCATGAAC attbB2*
*Miejsca attB1 i attB2 są miejscami rekombinacji z miejscami attP1 i attP2 w plazmidzie pKOR-1, nie restrykcyjnymi.
Tab. 2. Lista oligonukleotydów wykorzystanych jako startery w reakcjach Real-Time PCR. Nazwa każdego oligonukleotydu zawiera nazwę genu kontrolnego lub genu operonu saoABC, którego fragment
jest powielany.
Nazwa Sekwencja Długość flankowanego Wydajność reakcji PCR* [%]
fragmentu [pz]
RTsaoA-F TGTTAGTTGTAGCGGTTCGTG 73 101 ± 6
RTsaoA-R GCTTTGGGACCTTTAGATGCT
RTsaoB-F AGATTTAACACAAGATAACGGCCTC 67 106 ± 6
RTsaoB-R GTGTGACCATCATTAGTTGGATGAA
RTsaoC-F ATCAACAGACGCTAAGACGGA 78 101 ± 4
RTsaoC-R GCTCAACGCTGGCTTTTTCA
RTgyrB-F CAACAATGAACCCTGAGCACC 64 103 ± 7
RTgyrB-R CGGTTTTCTACAACGTCACCC
RT23Srna-F CCGAAGCTGTGGATTGTCCT 73 102 ± 4
RT23Srna-R GCTACTCACACCGGCATTCT
*Wartość średnia podana wraz z odchyleniem standardowym wyznaczona na podstawie trzech oznaczeń.
6.2. Lista konstruktów plazmidowych
W niniejszym rozdziale zestawiono dane na temat konstruktów plazmidowych wykorzystanych w opisywanych w tej pracy badaniach. Konstrukty oparte o plazmid pKOR-1 wykazują termoczułą replikację i dlatego komórki S. aureus nimi transformowane były namnażane w niestandardowej temperaturze 30ºC.
Tab. 3. Konstrukty plazmidowe uzyskane w trakcie badań prezentowanych w niniejszej pracy*. Nazwa konstruktu zawiera nazwy genów operonu saoABC, których fragmenty zostały w danym konstrukcie umieszczone. Kolumna startery zawiera początki nazw odpowiednich oligonukleotydów wykorzystanych w celu otrzymania umieszczonych w konstruktach fragmentów DNA w reakcji PCR. Antybiotyk selekcyjny wskazuje na rodzaj i stężenie antybiotyku wykorzystywanego w trakcie hodowli transformowanych konstruktem szczepów bakterii E. coli (–) i S. aureus (+).
Nazwa Startery Antybiotyk selekcyjny
pACYCDuet-saoB pTsaoB
(–) chloramfenikol 34 μg/ml
pACYCDuet-saoC pTsaoC
pETDuet-saoB pTsaoB-F/pDsaoB-R
(–) ampicylina 100 μg/ml
pETDuet-saoC pDsaoC-F/pTsaoC-R
pCN35-saoA-saoBgfpmu2-saoC pC35 i pC35 seria 1
pCN35-saoA-saoB-saoCgfpmu2 pC35 i pC35 seria 2 (–) ampicylina 100 μg/ml
(+) erytromycyna 10 μg/ml
pCN51-saoC pC51
pKOR-ΔsaoA pKsaoA (–) ampicylina 100 μg/ml
pKOR-ΔsaoC pKsaoC (+) chloramfenikol 5 μg/ml
pBAD-pemKSa * – (–) ampicylina 100 μg/ml
* Konstrukt uzyskany w trakcie wcześniejszych badań (Bukowski i in. 2013)
6.3. Oczyszczanie i izolacja kwasów nukleinowych
6.3.1. Oznaczanie stężenia DNA i RNA w roztworach
Stężenie DNA i RNA w próbkach oznaczano poprzez pomiar absorbancji otrzymanych wodnych roztworów przy długościach fali 260 i 280 nm z wykorzystaniem aparatu NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific) i załączonego do niego oprogramowania.
6.3.2. Strącanie kwasów nukleinowych etanolem
Do wyjściowych próbek dodawano roztworu zakwaszającego (3M NaCH3COO pH 4,0) w ilości 1/10 pierwotnej objętości próbki i 96% etanol w stosunku 1:1 po czym próbki inkubowano przez 1 h w -80ºC. Następnie wirowano je przez 10 min przy 20000×g w 4ºC. Nadsącz oddzielano a osad strąconego DNA przemywano 70% etanolem i wirowano ponownie przy takich samych parametrach. Po ponownym oddzieleniu nadsączu osad suszono i rozpuszczono w wodzie a stężenie kwasów nukleinowych w otrzymanej próbce oznaczano spektrofotometrycznie (por. 6.3.1)
6.3.3. Izolacja genomowego DNA ze szczepów Staphylococcus aureus
Izolację genomowego DNA ze szczepów S. aureus przeprowadzano z 2 ml całonocnej hodowli prowadzonej w pożywce płynnej TSB (Sigma-Aldrich) w temperaturze 37ºC z wytrząsaniem 180 obrotów na minutę. Pobraną próbkę wirowano 2 min przy 5000×g w temperaturze pokojowej a otrzymany w ten sposób osad bakterii, po usunięciu pożywki, zawieszano w 200 μl buforu EC (6 mM Tris-HCl; 1 M NaCl; 100 mM EDTA; 0.5% Brij; 0.5% sarkozyl; pH 7,6) z dodatkiem 1μl RNazy A (10 mg/ml, Thermo Scientific) i 1 μl lizostafiny (10 mg/ml, Preparatis) i inkubowano przez 2 h w 37ºC. Kolejne kroki oczyszczania przeprowadzono z wykorzystaniem zestawu do oczyszczania genomowego DNA z bakterii Genomic Mini (A&A Biotechnology) zgodnie z załączoną przez producenta instrukcją. W ostatnim etapie oczyszczania DNA eluowano w 50 μl wody i przechowywano w temperaturze -20ºC. Stężenie DNA w otrzymanych próbkach oznaczano spektrofotometrycznie (por. 6.3.1). Jakość wyizolowanego DNA oceniano poprzez elektroforezę w żelu agarozowym (por. 6.3.7).
6.3.4. Izolacja plazmidowego DNA ze szczepów Escherichia coli
Izolację plazmidowego DNA ze szczepów E. coli przeprowadzano z 2 ml całonocnej hodowli prowadzonej w pożywce płynnej LB (Sigma-Aldrich) z dodatkiem odpowiedniego antybiotyku selekcyjnego (por. 6.2) w temperaturze 37ºC z wytrząsaniem 180 obrotów na minutę. Pobraną próbkę była wirowano 2 min przy 5000×g w temperaturze pokojowej i z tak otrzymanego osadu bakterii, po usunięciu pożywki, przeprowadzano izolację plazmidowego DNA z wykorzystaniem zestawu Plasmid Mini (A&A Biotechnology) zgodnie z załączoną przez producenta instrukcją. W ostatnim etapie oczyszczania DNA eluowano w 50 μl wody i przechowywano w temperaturze -20ºC. Stężenie DNA w otrzymanych próbkach oznaczano spektrofotometrycznie (por. 6.3.1).
6.3.5. Izolacja plazmidowego DNA ze szczepów Staphylococcus aureus
Pierwszy etap izolacji plazmidowego DNA ze szczepów S. aureus, hodowlę komórek bakteryjnych oraz trawienie ściany komórkowej lizostafiną, prowadzono analogicznie do izolacji DNA genomowego (por. 6.3.3). Z jedną modyfikacją dotyczącą dodatku do pożywki odpowiedniego antybiotyku selekcyjnego (por. 6.2). Po 2 h inkubacji z lizostafiną do próbki dodawano buforu do lizy komórek L2 z zestawu Plasmid Mini (A&A Biotechnology). Pozostałe kroki były przeprowadzone zgodnie z załączoną do zestawu instrukcją producenta. W ostatnim etapie oczyszczania DNA eluowano w 50 μl wody i przechowywano w -20ºC. Stężenie DNA w otrzymanych próbkach oznaczano spektrofotometrycznie (por. 6.3.1).
6.3.6. Izolacja całkowitego RNA ze szczepów Staphylococcus aureus
Na potrzeby badania ekspresji genów metodą RealTime PCR przeprowadzano hodowlę całonocną bakterii szczepu S. aureus CH91 w pożywce płynnej TSB (Sigma-Aldrich) w temperaturze 37ºC z wytrząsaniem 180 obrotów na minutę. Następnie przygotowano nowe 20 ml hodowle w określonych pożywkach rozcieńczając całonocną hodowlę w stosunku 1:100. W przypadku większości eksperymentów była to pożywka TSB. W przypadku eksperymentów badających wpływ braku preferencyjnego źródła węgla lub źródła aminokwasów była to dla grupy kontrolnej pełna pożywka M9 z dodatkiem glukozy (preferencyjne źródło węgla) i kwasowego hydrolizatu kazeiny (źródło aminokwasów), natomiast w przypadku grup eksperymentalnych pożywka była pozbawiona odpowiednio pierwszego lub drugiego składnika. Hodowle te prowadzono w temperaturze 37ºC z wytrząsaniem 180 obrotów na minutę do osiągnięcia gęstości optycznej przy długości fali 600 nm równej 0,6; odpowiadającej logarytmicznej fazie wzrostu.
W przypadku eksperymentów dotyczących stresu solnego, osmotycznego, oksydacyjnego czy wywołanego działaniem antybiotyku do hodowli dodawano odpowiednio: NaCl, do końcowego stężenia 1 M; sorbitol, do końcowego stężenie 1 M; H2O2, do końcowego stężenie 10 mM; erytromycynę, do końcowego stężenie 10 i 1 μg/ml. Hodowle kontynuowano w temperaturze 37ºC z wytrząsaniem 180 obrotów/min.
W przypadku eksperymentu dotyczącego stresu cieplnego, hodowlę przenoszono do wytrząsarki w łaźni wodnej i kontynuowano inkubację w temperaturze 43ºC z wytrząsaniem 180 obrotów/min.
W przypadku hodowli związanych ze stresem wywołanym zakwaszeniem oraz brakiem preferencyjnego źródła węgla lub źródła aminokwasów, bakterie wirowano 10 min przy 5000×g w temperaturze pokojowej a po oddzieleniu osadu od pożywki przenoszono odpowiednio do 20 ml pożywki TSB o pH 5,0 oraz do 20 ml pożywki M9 nie zawierającej glukozy lub do 20 ml pożywki M9 nie zawierającej kwasowego hydrolizatu kazeiny. Bakterie z hodowli kontrolnych przenoszono z powrotem do 20 ml pożywki TSB o pH neutralnym lub 20 ml pełnej pożywki M9. Następnie kontynuowano wszystkie hodowle w temperaturze 37ºC z wytrząsaniem 180 obrotów/min.
Z tak prowadzonych hodowli pobierano 2 ml próbki kolejno w czasie 0, przed wprowadzaniem czynnika stresowego, oraz w czasie 10, 30, 60, 90 min po wprowadzeniu czynnika stresowego. Próbki wirowano 2 min przy 5000×g w temperaturze pokojowej a osad bakterii, po oddzieleniu od pożywki, zawieszano w 2 ml odczynnika TRI Reagent® (Sigma Aldrich) i przenoszono do kolumienek Lysing Matrix B (MP Biomedicals) zawierających złoże do mechanicznej dezintegracji. Kolumienki wytrząsano 45 s z szybkością 6,0 w instrumencie FastPrep® (MP Biomedicals) trzy razy, inkubując próbki 3 minuty na lodzie po każdym cyklu wytrząsania. Tak zdezintegrowane bakterie zamrażano w temperaturze -20ºC przed kontynuowaniem procedury izolacji i oczyszczania całkowitego RNA.
Po rozmrożeniu do próbek dodawano 200 μl chloroformu i energicznie wytrząsano przez 20 s a następnie wirowano w temperaturze 4ºC przez 10 min. Z tak przygotowanych próbek pobierano górną fazę wodną o objętości wahającej się w granicach od 400 do 500 μl i przenoszono ją do nowych probówek, w których mieszano ją w stosunku 1:1 z 70% wodnym roztworem etanolu. Tak przygotowany roztwór przenoszono do kolumienek z zestawu GeneJET RNA Purification Kit (Thermo Scientific) i kontynuowano oczyszczanie zgodnie z załączoną do zestawu instrukcją producenta wprowadzając tylko jedną modyfikację. Mianowicie, po związaniu RNA na złożu kolumienki a przed przemywaniem roztworami płuczącymi, wykonywano trawienie pozostałości DNA z wykorzystaniem zestawu On-Column DNase I Digestion Set (Sigma Aldrich) zgodnie z załączoną do zestawu instrukcją producenta.
W ostatnim etapie oczyszczania RNA eluowano w 50 μl wody i przechowywano w temperaturze -20ºC. Stężenie RNA w otrzymanych próbkach oznaczano spektrofotometrycznie (por. 6.3.1).
Pełna pożywka M9 (20 ml): 17,8 ml woda; 2 ml 10x sole M9; 20 μl 1M MgSO4; 2 μl 1M CaCl2; 80 μl witamina B1 0,5 mg/ml; 200 μl 20% glukoza; 200 μl 40% kwasowy hydrolizat kazeiny. Wszystkie wykorzystane roztwory były sterylizowane w autoklawie z wyjątkiem witaminy B1, filtrowanej przez filtr
o wielkości porów 0,22 μm.
10x sole M9 (100 ml): 12,8 g Na2HPO4·7H2O; 3,0 g KH2PO4; 0,5 g NaCl; 1,0 g NH4Cl; pH 7,4. Roztwór
sterylizowany w autoklawie.
6.3.7. Elektroforeza kwasów nukleinowych
Rozdział kwasów nukleinowych przeprowadzano w 1% żelu agarozowym z dodatkiem bromku etydyny (końcowe stężenie 0,5 μg/ml) w buforze TAE przy napięciu 10V/cm. Do próbek dodawano w odpowiedniej ilości 6-krotnie stężony bufor obciążający. Przy rozdziałach wykorzystywano także standard masowy GeneRuler 1 kb DNA Ladder (Thermo Scientific) zgodnie z zaleceniami producenta.
Bufor TAE: 40 mM Tris-HC; 20 mM kwas octowy; 1 mM EDTA; pH 8,0.
Bufor obciążający 6x: 10 mM Tris-HCl; 0.03% błękit bromofenolowy; 0.03% ksylen cyjanu FF; 60%
glicerol; 60 mM EDTA; pH 7,6.
6.4. Metody inżynierii genetycznej
6.4.1. Reakcja PCR
Reakcje PCR przeprowadzano z wykorzystaniem polimerazy DNA Run DNA Polymerase (A&A Biotechnology) zgodnie z zaleceniami producenta. Jeżeli wykorzystywano próbki oczyszczonego genomowego DNA jako matrycę jego ilość w przeliczeniu na 10 μl mieszaniny reakcyjnej wahała się w granicach od 50 do 200 ng. W przypadku reakcji PCR na koloniach bakterii E. coli jako matryca służył niewielki fragment kolonii bakteryjnej pobrany sterylną końcówką do pipety. Reakcje w celach analitycznych, czyli poszukiwania danego fragmentu DNA w DNA matrycowym, przeprowadzano w objętości 10 μl, natomiast w celu oczyszczania i izolacji (por. 6.3.7 i 6.4.3) na potrzeby klonowania molekularnego (por. 6.4.2 i 6.4.5) w objętości 120 μl, podzielonej na cztery 30 μl próbki. W większości przypadków wykorzystywano poniższy program reakcji PCR: 1. 95ºC 2 min; 2. 95ºC 30 s; 3. 50ºC 30 s; 4. 76ºC ; 5. etap 2, 3 i 4 powtórzone 29 razy; 6. 76ºC 10 min; 4ºC koniec. Czas elongacji był proporcjonalny do długości oczekiwanego produktu PCR, 1 min/1 kpz, jednak nie krótszy niż 1 min. W niewielu przypadkach wprowadzono drobne modyfikacje, które są wyszczególnione w odpowiednich rozdziałach. Produkty reakcji PCR rozdzielano na żelu agarozowym (por. 6.3.7) a w przypadkach, w których fragmenty DNA były wykorzystywane do klonowania molekularnego, po rozdziale w żelu były ligowane do wektora pTZ57R (por. 6.4.6) lub poddawane trawieniu enzymatycznemu (por. 6.4.2).
6.4.2. Trawienie DNA enzymami restrykcyjnymi
Wszelkie trawienia DNA wykonywano z wykorzystaniem nierozcieńczonych, otrzymanych z innych procedur, oczyszczonych próbek DNA, enzymami restrykcyjnymi producenta Thermo Scientific w dostarczanych buforach i w zalecanych warunkach oraz w całkowitej objętości 50 μl przez 4 h. W objętości tej 40 μl przypadało na próbkę DNA a podstawowa ilość enzymu wykorzystywana do przeprowadzenia tych reakcji wynosiła 1 μl i względem niej określano zalecane nadmiarowe ilości enzymów w przypadku trawienia więcej niż jednym enzymem. Stężenie DNA w próbkach wykorzystywanych do trawienia wahało się w granicach od 50 do 250 ng/μl. Trawione fragmenty DNA rozdzielano na żelu agarozowym (por. 6.3.7) a następnie poddawano oczyszczaniu (por. 6.4.3).
6.4.3. Izolacja fragmentów DNA z żelu agarozowego
Fragmenty DNA izolowano z żelu agarozowego z wykorzystaniem zestawu GelOut Concentrator (A&A Biotechnology) zgodnie z załączoną do zestawu instrukcją producenta. W ostatnim etapie oczyszczania DNA eluowano w 20 μl wody i przechowywano w temperaturze -20ºC. Stężenie DNA w otrzymanych próbkach było oznaczane spektrofotometrycznie (por. 6.3.1).
6.4.4. Rekombinacja fragmentów DNA
Rekombinację fragmentów DNA flankujących wybrane geny (por. 6.4.10) do wektora pKOR-1, pozyskanego dzięki uprzejmości autora (Bae i Schneewind 2006), przeprowadzano z wykorzystaniem enzymu Gateway® BP ClonaseTM II Enzyme Mix (Invitrogen) zgodnie z zaleceniami producenta dodając 2 μl mieszaniny ligacyjnej (por. 6.4.5) jako produktu zawierającego miejsca rekombinacji attB1 i aatB2. Reakcję prowadzono przez 16 h w 25ºC.
6.4.5. Ligacja fragmentów DNA
Trawione enzymami restrykcyjnymi (por. 6.4.2) a następnie oczyszczone fragmenty DNA (por. 6.3.7 i 6.4.3) ligowano z wykorzystaniem ligazy faga T4, T4 DNA Ligase (Thermo Scientific) o aktywności 1 U/μl zgodnie z zaleceniami producenta.
Całkowita ilość DNA używana do ligacji wynosiła 400 ng a reakcję przeprowadzano w objętości 10 μl w temperaturze 22ºC przez noc. W przypadku umieszczania fragmentu DNA z pojedynczym genem w plazmidzie stosunek molowy ich ilości wynosił 5:1, natomiast w przypadku ligacji dwóch fragmentów DNA o zbliżonej długości 1:1.
6.4.6. Ligacja fragmentów DNA do plazmidu pTZ57R
Na potrzeby klonowania molekularnego produkty reakcji PCR (por. 6.4.1) po ich oczyszczeniu (por. 6.3.7 i 6.4.3) poddawano najczęściej ligacji (por. 6.4.5) do plazmidu pTZ57R pochodzącego z zestawu InsTAClone (Thermo Scientific) w celu tworzenia plazmidowej biblioteki fragmentów jak i dalszego ich powielania w komórkach bakterii szczepu E. coli TOP 10 (Life Technologies). Mieszaninę ligacyjną wykorzystywano do transformacji komórek E. coli TOP 10 (por. 6.4.8). W celu ustalenia klonów zawierających pożądany konstrukt, na otrzymanych koloniach wykonywano reakcję PCR (por. 6.4.1) z wykorzystaniem starterów flankujących MCS plazmidu pTZ57R: M13-F i M13-R (por. 6.1). Następnie z kolonii dających produkt reakcji PCR o oczekiwanej długości izolowano plazmid (por. 6.3.4). Wyizolowane plazmidowe DNA w części przechowywano jako bibliotekę fragmentów a w części było trawione enzymami restrykcyjnymi w celu otrzymania powielonego fragmentu DNA i jego ligacji do plazmidu docelowego (por. 6.4.5).
6.4.7. Odwrotna transkrypcja
Odwrotną transkrypcję przeprowadzano z wykorzystaniem odwrotnej transkryptazy wirusa M-MuLV RevertAid Premium Reverse Transcriptase (Thermo Scientific) zgodnie z zaleceniami producenta stosując 2 μg oczyszczonego RNA (por. 6.3.6) i startery typu reverse (-R) specyficzne dla danych genów (por. 6.1) lub losowe heksanukleotydy. Te ostatnie wykorzystywano w celu otrzymania puli cDNA na matrycy całkowitego RNA na potrzeby reakcji Real-Time PCR (por. 6.6). Otrzymane po reakcji próbki rozcieńczano 10-krotnie wodą i przechowywano w -20ºC.
6.4.8. Transformacja komórek Escherichia coli
Komórki kompetentne szczepów E. coli BL21(DE3) i TOP 10 (Life Technologies) przygotowano zgodnie z protokołem wg Hanahan (1983).
Do 100 μl rozmrożonej na lodzie zawiesiny komórek dodano od 50 do 250 ng plazmidowego DNA (por. 6.3.4) lub 4 μl mieszaniny ligacyjnej (por. 6.4.5 i 6.4.6) i delikatnie zamieszano końcówką pipety. Tak przygotowaną próbkę inkubowano na lodzie 30 min a następnie 45 s w temperaturze 42ºC i ponownie na lodzie przez 5 min. Kolejnymi krokami było dodanie 500 μl pożywki LB i inkubacja w 37ºC przez 1 h. Po tym czasie próbkę mieszano przez kilkukrotne odwracanie probówki i określoną jej ilość, 500 μl w przypadku szczepu BL21(DE3) i 50 μl w przypadku szczepu Top 10, wysiewano na szalkę z podłożem stałym LBA z dodatkiem odpowiedniego antybiotyku (por. 6.2). Następnie szalkę inkubowano w 37ºC przez noc w celu wzrostu kolonii bakteryjnych.
6.4.9. Elektroporacja komórek Staphylococcus aureus
Komórki bakteryjne do elektroporacji przygotowano zakładając świeżą hodowlę z hodowli całonocnej prowadzonej w pożywce B2 w 37ºC z wytrząsaniem 200 obrotów/min. W tym celu dodawano do świeżej pożywki następującą objętość hodowli nocnej: 0,25·500/OD600, gdzie 500 to objętość zakładanej hodowli wyrażona w ml a OD600 to gęstość optyczna hodowli całonocnej mierzona przy długości fali równej 600 nm. Hodowlę prowadzono w 37ºC z wytrząsaniem 200 obrotów/min przez 1 h. Warunkiem kontynuowania procedury było osiągnięcie przez hodowlę w tym czasie OD600 równego co najmniej 0,4. Następnie hodowlę wirowano przy 5000 obrotów/min przez 10 min w temperaturze pokojowej, nadsącz oddzielano a osad bakterii zawieszano w 30 ml sterylnej wody. Wirowanie i zawieszanie w sterylnej wodzie powtarzano kolejne dwa razy. Po ostatnim wirowaniu poprzedniego kroku procedury, osad bakterii zawieszano w 10 ml sterylnego 10% (V/V) roztworu glicerolu i ponownie wirowano. Po oddzieleniu nadsączu osad bakterii zawieszano w 5 ml sterylnego 10% (V/V) roztworu glicerolu i inkubowano w temperaturze pokojowej 15 min. Zawiesinę bakterii rozdzielano na 100 μl porcje do probówek 1,5 ml i zamrażano w ciekłym azocie. Tak przygotowane próbki przechowywano w -80ºC.
Elektroporację przeprowadzano dodając do rozmrożonej w temperaturze pokojowej wcześniej przygotowanej próbki bakterii od 500 do 1000 ng plazmidowego DNA. Próbkę inkubowano w temperaturze pokojowej 30 min i następnie przenoszono do 400 μl kuwety z elektrodami aluminiowymi i poddawano działaniu pojedynczego impulsu elektrycznego przy napięciu początkowym 1,8 kV i czasie trwania 2,5 ms (predefiniowany program StA) z wykorzystaniem aparatu MicroPulser™ Electroporator (Bio-Rad). Do zawiesiny bakteryjnej dodawano 700 μl pożywki B2 i inkubowano w temperaturze 37ºC przez 90 min po czym wysiewano zawiesinę (w ilości 100 μl i 700 μl) na dwie płytki z pożywką TSB i odpowiednim antybiotykiem. Płytki inkubowano przez noc w 37ºC w celu wzrostu kolonii.
Pożywka B2:10 g kwasowy hydrolizatu kazeiny; 25 g ekstraktu drożdżowego; 1 g K2HPO4; 25 g NaCl; dopełnione wodą do 1L i wysterylizowane; po sterylizacji dodać 25 ml 20% sterylnego roztworu glukozy (końcowe stężenie 0,5%).
6.4.10. Otrzymywanie szczepów Staphylococcus aureus typu knockout
Szczepy typu knockout otrzymano z wykorzystaniem plazmidu pKOR-1 w oparciu o procedurę opisaną przez Bae i Schneewinda (2006) wyprowadzając je ze szczepu S. aureus RN4220 (Nair i in. 2011). Dwa szczepy transformowane (por. 6.4.9) odpowiednio konstruktem pKOR-ΔsaoA i pKOR-ΔsaoC (por. 6.4.9) hodowano przez noc w 20 ml płynnej pożywki TSB z chloramfenikolem w stężeniu 5 μg/ml (por. 6.2) w 30ºC z wytrząsaniem 180 obrotów/min. Następnie zakładano analogiczne hodowle rozcieńczając nocne hodowle w stosunku 1:1000 i hodowano je przez całą noc w temperaturze 42ºC w łaźni wodnej z wytrząsaniem 180 obrotów/min. Etap ten miał na celu wyselekcjonowania komórek, w których konstrukt, dający oporność na chloramfenikol a niemogący replikować się w podwyższonej temperaturze, uległ integracji z chromosomem na drodze replikacji homologicznej. Próbki z nocnej hodowli traktowano ultradźwiękami z wykorzystaniem aparatu UP100H (100W, 30 kHz, Hielsher) przez 30 s przy amplitudzie 80% i cyklu 0,5 s w celu rozdzielenia komórek bakteryjnych, które w przypadku gronkowca występują w postaci pakietów, co może powodować wzrost kolonii poliklonalnych. Ze względu na fakt, że gronkowce są bakteriami Gram dodatnimi i posiadają stosunkowo grubą i mocną ścianę komórkową, nie ulegają w takich warunkach dezintegracji. Próbki traktowane ultradźwiękami wykorzystywano do posiewu redukcyjnego na płytkach ze stałą pożywką TSA z chloramfenikolem, które inkubowano przez kolejną noc w temperaturze 42ºC. Z płytek wybierano po jednej dużej kolonii. Wielkość kolonii wskazuje na wbudowanie się plazmidu do chromosomu bakteryjnego, co przejawia się dobrym wzrostem na pożywce z antybiotykiem. Kolonie te posłużyły do założenia kolejnych hodowli nocnych w płynnej pożywce TSB bez antybiotyku prowadzonych w temperaturze 30ºC. W trakcie ich trwania konstrukt mógł ulegać replikacji i wycinać się z chromosomu bakteryjnego na drodze kolejnej replikacji homologicznej. Część z takich replikacji prowadzi do powrotu do stanu wyjściowego ale część może prowadzić do wycięcia się konstruktu w taki sposób, że wprowadzona do niego wstawka z fragmentami flankującymi dany gen, ale bez tego genu, zostanie wymieniona z homologicznym odcinkiem DNA w chromosomie bakteryjnym, który ten gen zawiera. Prowadzi to do usunięcia wybranego genu z chromosomu bakteryjnego. Namnażanie się komórek w pożywce bez antybiotyku może, wskutek nierównomiernej segregacji niskokopijnych konstruktów, doprowadzić w efekcie do powstania linii z usuniętym wybranym genem z chromosomu bakteryjnego i nie będącej nosicielem plazmidu pKOR zawierającego usuwany fragment chromosomu. W celu selekcji linii, które nie posiadają plazmidu pKOR, próbki hodowli nocnych rozcieńczonych 10000-krotnie i potraktowanych ultradźwiękami, w sposób opisany wcześniej, wysiewano na pożywce stałej TSA z anhydrotetracykliną w stężeniu 100 ng/ml. Anhydrotetracyklina indukuje ekspresję antysensownego RNA, którego gen jest obecny w plazmidzie pKOR, spowalniającego znacząco wzrost kolonii. Po inkubacji płytek w 30ºC przez noc selekcjonowano kilka dużych kolonii i wykorzystywano je do izolacji genomowego DNA (por. 6.3.3), które służyło jako matryca w reakcjach PCR z wykorzystaniem par starterów flankujących miejsca, w których znajdują się usuwane geny. Otrzymanie skróconych produktów reakcji, w porównaniu do produktów otrzymanych dla genomowego DNA szczepu wyjściowego, jak również brak oporności wyselekcjonowanych linii na chloramfenikol świadczy o pomyślnym przebiegu procedury, czyli otrzymaniu szczepów typu knockout z usuniętymi wybranymi genami i nie będących nosicielami plazmidów pKOR zawierających usuwane fragmenty DNA.
6.4.11. Sekwencjonowanie DNA i synteza oligonukleotydów
Sekwencjonowanie wszystkich konstruktów plazmidowych stworzonych w ramach badań opisanych w niniejszej pracy (por. 6.2) oraz syntezę oligonukleotydów (por. 6.1) zlecono firmie Genomed.
6.5. Oczyszczanie i izolacja białek
6.5.1. Oznaczanie stężenia białek w roztworach
Stężenie białek oznaczano z wykorzystaniem odczynnika Bradforda (Bradford 1976). Do 1 ml odczynnika dodawano 5 μl odpowiednio rozcieńczonego wyjściowego roztworu białka, tak aby absorbancja przy długości fali 595 nm mieściła się w zakresie od 0,1 do 0,7. Stężenie wyliczano na podstawie wspomnianej wartości absorbancji i krzywej standardowej wyznaczonej w tym podanym zakresie dla albuminy wołowej.
Odczynnik Bradforda: 35 mg/L CBB G-250; 5% etanol; 5% kwas fosforowy V; 35 mg barwnika rozpuszczano w 50 ml etanolu przez 2 godziny a następnie dodawano 60 ml 85% kwasu fosforowego i uzupełniano wodą do objętości 1 L, przechowywano w 4ºC.
6.5.2. Elektroforeza białek SDS-PAGE
Elektroforeza białek SDS-PAGE była przeprowadzana zgodnie z protokołem wg Schäggera i von Jagowa (1987) w obecności SDS. Żel o grubości 1 mm składał się w 1/3 objętości z żelu zagęszczającego a w 2/3 z żelu rozdzielającego. W żelu zagęszczającym elektroforeza była prowadzona pod napięciem 5 V/cm a w rozdzielającym 10 V/cm. Przed rozdziałem do próbek dodawano w odpowiedniej ilości 2-krotnie stężony bufor obciążający a następnie inkubowano je na wrzącej łaźni wodnej przez 5 min. Po przeprowadzaniu rozdziału żel utrwalano przez 30 min, barwiono przez 2 h i odbarwiano do momentu zredukowania większości tła.
Żel zagęszczający: 3,8% akrylamid; 0,1% bis-akrylamid; 700 mM Tris-HCl; 0,08% SDS; 0,08% APS;
0,08% TEMED; pH 8.45.
Żel rozdzielający: 9,6% akrylamid; 0,3% bis-akrylamid; 1 M Tris-HCl; 0,1% SDS; 11% (v/v) glicerol;
0,05% APS; 0,05% TEMED; pH 8.45.
Bufor obciążający 2x: 125 mM Tris-HCl; 4% SDS; 20% (v/v) glicerol; 0,05% CBB G-250; 200 mM
DTT; pH 8,45.
Bufor anodowy: 100 mM Tris-HCl; 100 mM trycyna; 0,1% SDS; pH 6,8.
Bufor katodowy: 200 mM Tris-HCl; pH 8,9.
Utrwalacz: 50% metanol; 10% kwas octowy.
Barwnik: 0,025% CBB R-250; 10% kwas octowy.
Odbarwiacz: 10% kwas octowy.
6.5.3. Izolacja białka SaoC z komórek Escherichia coli
Produkcję rekombinowanego białka SaoC prowadzono w układzie pET w komórkach E. coli BL21(DE3). W tym celu komórki szczepu transformowanego (por. 6.4.8) konstruktem pETDuet-saoC hodowano w 20 ml pożywki płynnej LB (Sigma-Aldrich) z dodatkiem odpowiedniego antybiotyku (por. 6.2) w temperaturze 37ºC z wytrząsaniem 180 obrotów/min. Następnie przygotowano nową 20 ml hodowlę w pożywce TSB rozcieńczając całonocną hodowlę w stosunku 1:100. Hodowle tę prowadzono w temperaturze 37ºC z wytrząsaniem 180 obrotów/min do osiągnięcia gęstości optycznej 0,6 mierzonej przy długości fali 600 nm. Następnie dodawano do niej czynnik indukujący ekspresję genu saoC, 1M IPTG (Sigma-Aldrich) w stosunku 1:1000, i kontynuowano hodowlę w temperaturze 20ºC przez noc. W kolejnym etapie hodowlę wirowano 20 min przy 5000×g w temperaturze 4ºC. Pozostałe etapy izolacji białka SaoC wykonywano w temperaturze 4ºC lub na lodzie.
Po oddzieleniu pożywki osad bakterii zawieszano w 2 ml buforu A (50 mM Tris-HCl; 2,5 mM MgCl2; 1 mM MgCl2; pH 8,0). Tak przygotowaną zawiesinę bakterii poddawano dezintegracji z wykorzystaniem aparatu UP100H (100W, 30 kHz, Hielsher) przez 30 s przy amplitudzie 80% i cyklu 0,5. W kolejnym etapie zawiesinę zdezintegrowanych bakterii wirowano 15 min przy 5000×g. Białko SaoC pozostaje we frakcji nierozpuszczalnej w postaci agregatów, w których zachowuje swoją natywną strukturę i które można rozpuścić stosując bufory z wysokim stężeniem NaCl. Dlatego też nadsącz usuwano a osad zawieszano w 2 ml buforu B (50 mM Tris-HCl; 1 M NaCl; pH 8,0) po czym zawiesinę wirowano 15 min przy 20000×g. Nadsącz z rozpuszczonym białkiem SaoC przenoszono do czystej probówki i rozcieńczano buforem A w stosunku
1:1. Powodowało to ponowną agregację białka. Próbkę wirowano ponownie 15 min przy 5000×g. Po usunięciu nadsączu osad zagregowanego białka płukano ponownie 2 ml buforu A i wirowano przy takich samych parametrach jeszcze raz otrzymując oczyszczone w dużym stopniu białko SaoC w postaci osadu o bardzo lepkiej konsystencji. Próbki otrzymanego preparatu poddano elektroforezie SDS PAGE (por. 6.5.2) a prążek pochodzący od oczyszczonego białka sekwencjonowaniu metodą degradacji Edmana w celu potwierdzenia jego tożsamości.
Oczyszczanie kontrolne mające wykazać, że obecność DNA w próbce jest związana z produkcją białka SaoC, wykonano w analogiczny sposób z wykorzystaniem konstruktu pETDuet-saoB (por. 6.2). Jednak w tym przypadku ostatecznie otrzymana próbka nie zawierała żadnych wykrywalnych ilości kwasów nukleinowych (por. 6.5.4).
6.5.4. Test podatności DNA wiązanego przez białko SaoC na trawienie
Testy trawienia DNA związanego z białkiem SaoC wykonywano mieszając 10 μl otrzymanego osadu białka SaoC (por. 6.5.3) z roztworem 1 μl DNazy I (1 U/μl, Thermo Scientific) i 1 μl RNazy A (10 mg/μl, Thermo Scientific) w 8 μl buforu do DNazy I dostarczanego przez producenta. Całość delikatnie zamieszano i inkubowano 30 min w 37ºC w termobloku z wytrząsaniem 500 obrotów/min przez 10 s co 1 min. W czasie tym obserwowano zanikanie fragmentów osadu białkowego i powstawanie mętnej jednorodnej zawiesiny. Następnie mieszaninę poddawano denaturacji cieplnej w temperaturze 95ºC przez 5 min. Zdenaturowaną mieszaninę wirowano 10 min przy 20000×g w temperaturze pokojowej. Nadsącz przenoszono do nowej probówki i strącano kwasy nukleinowe (por. 6.3.2). Osad strąconych kwasów nukleinowych zawieszano w 50 μl wody. 5 μl tak otrzymanego roztworu poddawano rozdziałowi elektroforetycznemu (por. 6.3.7).
Próbki otrzymanego roztworu poddawano również ponownemu trawieniu DNazą I i RNazą A w buforze do DNazy I, poprzez zmieszanie 8 μl roztworu kwasów nukleinowych z 1 μl 10-krotnie stężonego buforu i 1 μl jednego z wspominanych enzymów i inkubację 30 min w 37ºC. Następnie próbki denaturowano i strącano z nich kwasy nukleinowe w sposób analogiczny do opisanego w poprzednim akapicie. 10 μl tak otrzymanych roztworów poddawano rozdziałowi elektroforetycznemu (por. 6.3.7).
6.5.5. Izolacja całkowitego białka z komórek Staphylococcus aureus
Na potrzeby badania wpływu wiążącego DNA białka SaoC na proteom bakteryjny szczepu S. aureus RN4220 ΔsaoC przeprowadzano całonocną hodowlę bakterii tego szczepu transformowanych plazmidem pCN51 (Charpentier i in. 2004) lub konstruktem pCN51-saoC w 20 ml pożywki płynnej TSB (Sigma-Aldrich) z dodatkiem odpowiedniego antybiotyku selekcyjnego (por. 6.2) w temperaturze 37ºC z wytrząsaniem 180 obrotów/min. Następnie przygotowano nowe 20 ml hodowle w pożywce TSB rozcieńczając całonocną hodowlę w stosunku 1:100. Hodowle te prowadzono w temperaturze 37ºC z wytrząsaniem 180 obrotów/min do osiągnięcia gęstości optycznej 0,6 mierzonej przy długości fali 600 nm. Następnie dodawano do nich 5 μl 10 mM chlorku kadmu (CdCl2), uzyskując końcowe stężenie równe 2,5 μM, i kontynuowano hodowlę w takich samych warunkach. Po upływie 90 min wirowano całą hodowlę 10 min przy 5000×g w 4ºC. Po usunięciu pożywki osad bakterii zawieszano w 1 ml odczynnika TRI Reagent (Sigma-Aldrich) i wykonywano mechaniczną dezintegrację w taki sam sposób jak dla próbek, z których izolowano RNA (por. 6.3.6).
Kolejne kroki procedury izolacji białek z tak przygotowanych próbek wykonywano zgodnie z protokołem producenta załączonym do odczynnika TRI Reagent. Otrzymany i wysuszony osad białkowy zawieszano w 200 μl buforu S (30 mM Tris; 7 M mocznik; 2 M tiomocznik; 4% CHAPS). Stężenie białka w tak otrzymanych roztworach mierzono z wykorzystaniem odczynnika Bradforda (por. 6.5.1).
6.6. Badanie zmian ekspresji genów metodą Real-Time PCR
W badaniu zmian ekspresji wykorzystano RNA całkowite izolowane ze szczepu
S. aureus CH91 (por. 6.3.6), które było następnie wykorzystane do przeprowadzenia reakcji odwrotnej transkrypcji (por. 6.4.7). Wykorzystując rozcieńczoną mieszaninę reakcyjną odwrotnej transkrypcji, jako matrycę, przygotowywano reakcje Real-Time PCR na płytkach 96-dołkowych. Całkowita objętość mieszaniny reakcyjnej w jednym dołku wynosiła 15 μl.
Najpierw przygotowywano roztwory zawierające startery specyficzne dla genów i odczynnik iTaq Universal Sybr Green Super Mix (Bio-Rad). Odczynnik ten zawierał buforowaną mieszaninę barwników fluorescencyjnych, w tym barwnik SYBR® Green wykorzystywany do detekcji zmian ilości dwuniciowego DNA, i polimerazy typu hot-start. Roztwór taki w ilości 220 μl zawierał: 165 μl odczynnika iTaq Universal Sybr Green Super Mix; 33 μl wodnego roztworu pary starterów dla danego genu w stężeniu 10 μM każdy; 22 μl wody. Następnie do dołków na płytce nanoszono po 5 μl matrycy z każdej z 5 próbek z serii czasowej (por. 6.3.6). Całą serię czasową próbek matrycy nakładano w ten sposób w trzech powtórzeniach i niezależnie dla każdego z trzech genów operonu saoABC oraz jednego genu referencyjnego, gyrazy B (gyrB) lub 23S rRNA (23srna). W przypadku eksperymentów wykorzystujących gen 23S rRNA jako referencję, używano matrycy dodatkowo rozcieńczonej 10-krotnie w wodzie. W następnym kroku do dołków z matrycą nanoszono po 10 μl przygotowanych wcześniej roztworów ze starterami i odczynnikiem iTaq Universal Sybr Green Super Mix otrzymując po 15 μl mieszaniny reakcyjnej w każdym dołku. Płytkę wirowano 5 min przy 1000×g i umieszczano w aparacie CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad) i przeprowadzano reakcję zgodnie z następującym programem: 1. 95ºC 2 min; 2. 95ºC 30 s; 3. 55ºC 30 s (detekcja ilości DNA); 4. 74ºC 30 s; 5. powtórz kroki 2, 3, 4 40 razy; wyznacz krzywą topnienia w zakresie temperatur od 65 do 95ºC ze skokiem 0,5ºC.
W obliczeniach wykorzystano otrzymane wartości Ct (ang. cycle threshold) czyli wartości cyklu reakcji PCR, dla którego sygnał z danego dołka na płytce przekroczył, ustalaną automatycznie przez oprogramowanie, wartość progową. Na ich podstawie wyliczano względne zmiany ekspresji badanych genów zgodnie z metodą zaproponowaną przez Livak i Schmittgena (Livak i Schmittgen 2001), niezależnie dla każdego z trzech powtórzeń. Istotność statystyczną różnicy pomiędzy danym punktem czasowym z grupy kontrolnej i z grupy eksperymentalnej badano testem t.
6.7. Analiza porównawcza proteomów 2D-DIGE
Trzy serie próbek całkowitego białka ze szczepu S. aureus RN4220 ΔsaoC transformowanego plazmidem pCN51 (kontrola) lub konstruktem pCN51-saoC po indukcji jonami Cd2+ (por. 6.5.5) były poddawane różnicującej elektroforezie dwuwymiarowej w żelu poliakrylamidowym (2D DIGE, ang. two-dimensional difference gel electrophoresis) (Alban i in. 2003; Timms i Cramer 2008; Minden i in. 2009). Przed rozdziałem obie pule białek były znakowane z osobna barwnikami fluorescencyjnymi G-Dye200+ i G-Dye300+ zgodnie z zaleceniami producenta (NH DyeAGNOSTICS). Standard wewnętrzny był przygotowywany poprzez zmieszanie próbek białek z wszystkich izolacji i wyznakowanie ich barwnikiem G-Dye100+.
W każdym rozdziale, osobno dla każdej z trzech wyizolowanych serii, poddawano w wyżej opisany sposób przygotowane i zmieszane ze sobą trzy próbki. Jako pierwszy etap rozdziału wykonywano ogniskowanie izoelektrycze 50 μg mieszaniny znakowanych próbek na 17 cm paskach z gradientem pH (Bio-Rad) z wykorzystaniem aparatu Protean IEF Cell (Bio-Rad) zgodnie z zaleceniami producenta. Rozdział w drugim kierunku był oparty o elektroforezę wg Laemmliego (Laemmli 1970) w 12% żelu poliakrylamidowym.
Żel po rozdziale poddawano skanowaniu z wykorzystaniem aparatu Typhoon Trio (GE Healthcare) i analizie w programie Quant and DeCyder 2D (GE Healthcare) w celu wyszukania różnicujących plamek. Następnie był wybarwiany srebrem (Shevchenko i in. 1996) a różnicujące plamki były wycinane a zawarte w nich białka identyfikowane z wykorzystaniem spektrometrii masowej.
6.8. Badanie wirulencji szczepów Staphylococcus aureus w modelu zarodka kurzego
Eksperymenty opisane w tej części były wykonane w zgodzie z prawem o ochronie zwierząt obowiązującym na terenie Rzeczypospolitej Polskiej. Zarodki kurze były poddawane eutanazji w 17 dniu rozwoju, czyli 4 dni przed wykluciem.
Zalężone jaja pozyskano z komercyjnej hodowli. Pochodziły one on kur hodowanych bez użycia antybiotyków czy polepszaczy paszy. Jaja były inkubowane w 37ºC przy względnej wilgotności w granicach od 50 od 60%. Eksperyment rozpoczynano w 10 dniu rozwoju zarodków kurzych, gdyż jak wykazano są one najbardziej podatne na infekcję komórkami gronkowca w tym właśnie stadium rozwoju (Soltesz i Mardh 1987). Jaja dodatkowo selekcjonowano przed eksperymentem prześwietlając je lampą owoskopową w celu odrzucenia jaj niezalężonych oraz tych z obumarłymi zarodkami. W skorupkach nakłuwano sterylnie igłą otwory o średnicy 1,2 mm przez które wstrzykiwano do worka omoczniowego 50 μl zawiesiny zawierającej 10-5 CFU komórek bakterii. Otwory zaklejano gorącym woskiem. Dwie serie kontrolne były odpowiednio nastrzykiwane 0,7% roztworem NaCl lub nie poddawane jakiejkolwiek manipulacji. Po 7 dniach sprawdzano żywotność zarodków a dalszy ich rozwój przerywano, żywe zarodki poddawano eutanazji. W przypadku martwych zarodków, stan ich rozwoju był oceniany zgodnie z kluczem opracowanym przez Hamburgera i Hamiltona (1992) w celu określenia doby ich obumarcia po inokulacji. Eksperymenty wykonano w 4 powtórzeniach po 40 jaj w każdym. Zjadliwość badanych szczepów wyrażono jako frakcję obumarłych w trakcie trwania eksperymentu zarodków. Istotność statystyczną różnic pomiędzy uśrednionymi z dwóch eksperymentów wartościami tej frakcji badano testem t.
6.9. Testy różnic w antybiotykowrażliwości
Na potrzeby badania różnic we wrażliwości na różne antybiotyki pomiędzy szczepami typu knockout S. aureus RN4220 ΔsaoA, RN4220 ΔsaoC i szczepem typu dzikiego RN4220 przeprowadzano całonocną hodowlę bakterii tych szczepów w 20 ml pożywki płynnej TSB (Sigma-Aldrich) w temperaturze 37ºC z wytrząsaniem 180 obrotów/min. Następnie przygotowano nowe 20 ml hodowle w pożywce TSB rozcieńczając całonocną hodowlę w stosunku 1:100. Hodowle te prowadzono w temperaturze 37ºC z wytrząsaniem 180 obrotów/min do osiągnięcia gęstości optycznej 1,0 mierzonej przy długości fali 600 nm. Próbki z hodowli rozcieńczano 10-krotnie otrzymując 0,5 ml zawiesiny dla każdego szczepu. Następnie zawiesiny równomiernie nanoszono na płytki ze stałym podłożem TSA (Sigma-Aldrich) z wykorzystaniem nasączonych w nich pałeczek do wymazów. Na środku płytki umieszczano krążek nasączony odpowiednim antybiotykiem i inkubowano przez noc w 37ºC. Po tym czasie dokonywano pomiarów stref zahamowania. Doświadczenie powtarzano dwa razy.
W eksperymencie wykorzystano następujące krążki diagnostyczne o średnicy 6,35 mm nasączone odpowiednimi ilościami antybiotyków: BBL™ Sensi-Disc™ Susceptibility Test Discs (Becton Dickinson and Company): amikacyna 30 μg, ampicylina 10 μg, cefoksytyna 30 μg, chloramfenikol 30 μg, ciprofloksacyna 5 μg, doksycyklina 30 μg, erytromycyna 15 μg, klidamycyna 2 μg, neomycyna 30 μg, rifampicyna 5 μg, sulfametoksazol/trimetoprym 23,75/1,25 μg, tetracyklina 30 μg, wankomycyna 30 μg; Antimicrobial Susceptibility Disks (Bio-Rad): gentamycyna 10 μg, streptomycyna 300 μg; Krążki diagnostyczne o średnicy 9 mm (Centrum Badań Mikrobiologicznych i Autoszczepionek): furanizadol 50 μg, nowobiocyna 2 μg.
7. WYNIKI
7.1. Operon trzech hipotetycznych genów
7.1.1. Lokalizacja i otoczenie genowe
Operon saoABC jest zlokalizowany w chromosomie bakteryjnym w bezpośrednim sąsiedztwie genów białek zaangażowanych w biosyntezę nukleotydów i metabolizm węgla (rys. 6A) Są to, powyżej hipotetycznego operonu, geny związane z metabolizmem i transportem ksantyny, odpowiednio xpt, gen fosforybozylotransferazy kasantynowej i pbuX, gen permeazy ksantynowej. Posuwając się jeszcze wyżej, występują ponadto geny guaB i guaA, odpowiednio dehydrogenazy inozyno-5'monofosforanowej i syntazy GMP (nieprzedstawione na rys. 6A). Poniżej omawianego operonu znajduje się gen białka o wysokiej homologii do symportera dikarboksylan/Na+ (DASS family protein), białka z tej rodziny są zaangażowane między innymi w transmembranowy transport aminokwasów.
Omawiany operon składa się z trzech hipotetycznych genów, oznaczonych tutaj jako saoA, saoB i saoC. W przypadku genomu S. aureus ED98 (GenBank CP001781), używanego tutaj jako genom referencyjny, geny operonu saoABC znajdują się w kolejnych chromosomowych loci oznaczonych w tym genomie jako SAAV_0353, SAAV_0352 i SAAV_0351. Niewielkie odległości pomiędzy tymi genami nieprzekraczające 150 pz, znacząco większe odległości od sąsiadujących genów, sięgające od około 500 do 1000 pz, oraz położenie na przeciwnej nici DNA, w przypadku genów położonych powyżej omawianego hipotetycznego operonu, wskazują na jego topologiczną odrębność. Znajduje to potwierdzenie w istnieniu wspólnego transkryptu mRNA obejmującego wyłącznie geny tego operonu (rys. 6B).
Rys. 6. Analiza hipotetycznego operonu saoABC. (A) Powyżej locus saoABC w przeciwnej orientacji położone są geny fosforybozylotransferazy kasantynowej (xpt) i permeazy ksantynowej (pbuX). Znacznie poniżej znajduje się gen białka o homologii do symportera dikarboksylan/Na+ (DASS family protein). Nad schematem umieszczono podziałkę odległości, której początek pokrywa się z początkiem genu saoA. Poniżej zaznaczono długości genów operonu saoABC oraz odległości między nimi i najbliższymi genami. (B) RT-PCR wykonany na całkowitym RNA szczepu S. aureus CH91 z wykorzystaniem startera forward pTsaoAF hybrydyzującego do początku genu saoA oraz starterów reverse (1) pCtailR, (2) pTsaoCR, (3) pTsaoBR i (4) pTsaoAR hybrydyzujących odpowiednio do miejsca położonego 100 pz poniżej operonu oraz końców kolejnych jego genów zaczynając od ostatniego. Każda druga ścieżka w parze to kontrola zanieczyszczenia wyjściowej próbki RNA przez DNA genomowe. Podobny zestaw reakcji z wykorzystaniem startera forward pCsaoAF położonego 100 pz powyżej operonu saoABC nie prowadził do uzyskania żadnego sygnału. (C) Analiza niekodujących sekwencji położonych powyżej (ang. upstream) genów operonu saoABC wykonana w oparciu o dopasowania wielosekwencyjne dla 17 gatunków z rodzaju Staphylococcus. Zaznaczono sekwencje wysoce konserwatywne zidentyfikowane jako miejsca miejsca wiązania podjednostek σA, σB, domniemanej podjednostki σ (σ?), białka CAP oraz palindromowa sekwencja o nieznanej funkcji i miejsca wiązania rybosomów (RBS).
5
7.1.2. Potencjalne sekwencje regulatorowe w obrębie operonu saoABC
Wszystkie potencjalne sekwencje regulatorowe wytypowano na podstawie stopnia konserwatywności w genomach 17 gatunków z rodzaju Staphylococcus. Po wyodrębnieniu konserwatywnych motywów DNA próbowano ustalić ich tożsamość w odniesieniu do danych literaturowych (rys. 6). Ponieważ rys. 6C przedstawia konserwatywność sekwencji określoną na podstawie dopasowania wieloskewencyjnego, co skutkuje wprowadzaniem przerw, odległości pomiędzy proponowanymi kasetami -10 i -35 promotorów nie wyrażają rzeczywistych odległości w poszczególnych genomach, które były jednak brane pod uwagę podczas wyznaczania domniemanych promotorów. Powyżej genu saoA odnaleziono kasetę -10 podstawowej podjednostki σA (TATAAT, por. 4.4.1) oraz poprzedzający ją motyw bogaty w nukleotydy A i T, który może odpowiadać kasecie -35. Poniżej miejsca wiązania podjednostki σA znajduje się miejsce wiązania gronkowcowej podjednostki σB GTTT-(n16)-GGGTA (por. 4.4.2). W obrębie sekwencji niekodującej powyżej genu saoB można odnaleźć tylko pojedynczy konserwatywny motyw rozszerzonej kasety -10 (TGCTATAAT), która stanowi autonomiczne miejsce wiązania podstawowej podjednostki σA (TGnTATAAT, por. 4.4.1). W obrębie sekwencji powyżej genu saoC istnieje konserwatywny motyw, który przypomina budową motywy rozpoznawane przez alternatywne podjednostki σ, czyli zawiera krótkie sekwencje odpowiadające kasetom -35 oraz -10 rozdzielone kilkunastoma nukleotydami. Sekwencje te to dla domniemanej kasety -35 CTTGAAA natomiast dla domniemanej kasety -10 GTTTAAACT. Poniżej domniemanej sekwencji promotorowej występuje konserwatywny odcinek o długości około 25 nukleotydów, w obrębie którego występuje sekwencja palindromowa TGACGTTT-(n14)-AAACGTCA. Jeszcze niżej występuje motyw TACATAAA, który wskazywany jest przez program BPROM (Solovyev i Salamov 2011) jako potencjalne miejsce wiązania białka CAP (CRP). Dla każdego genu operonu saoABC udało się również zidentyfikować miejsce wiązania rybosomu (RBS).
7.1.3. Występowanie operonu w gatunkach rodzaju Staphylococcus
Homologi operonu saoABC odnaleziono we wszystkich dostępnych w bazie GenBank genomach przedstawicieli rodzaju Staphylococcus (Bukowski i in. 2015), których obecnie jest znanych 17. Porównując sekwencję poszczególnych genów operonu zwraca na siebie uwagę fakt unikalnego wzoru konserwatywności genu saoC, którego 5'-terminalna rozległa część oraz krótki 3'-terminalny odcinek wykazują duży stopień konserwatywności natomiast odcinek pomiędzy nimi znacząco się różni pod względem sekwencji jak i długości (rys. 7). Na wspomnianym rysunku zaznaczono również w obrębie genu saoC odcinki potencjalnie kodujące motywy wiążące DNA, co jest omówione bardziej szczegółowo w dalszej części tej pracy. Z wykorzystaniem zoptymalizowanego zestawu starterów potwierdzono obecność operonu saoABC poprzez poszukiwania genu saoC również dla gatunków, dla których sekwencje genomów są nieznane (rys. 8). W ten sposób wykazano jego obecność sumarycznie w 29 spośród 36 aktualnie wyróżnianych w obrębie rodzaju Staphylococcus gatunków.
Rys. 7. Porównanie sekwencji genów operonu saoABC pochodzących z różnych gatunków rodzaju Staphylococcus. W każdym panelu na górze znajduje się podziałka długości. Po stronie lewej nazwy gatunków a po prawej długości odpowiadających im sekwencji kodujących. Poziome linie prezentują ciągłość sekwencji dopasowania wielosekwencyjnego, pod którymi znajduje się prezentacja stopnia konserwatywności poszczególnych genów, gdzie skala od 0 do 100% konserwatywności jest przedstawiona gradientowo od koloru białego do czarnego. Dla genu saoC literami a i b oznaczono miejsca potencjalnie kodujące motywy wiążące DNA w obrębie sekwencji białka SaoC dla S. aureus.
Rys. 8. Produkty reakcji PCR dla genu saoC na matrycy genomowego DNA dla 25 różnych gatunków z rodzaju Staphylococcus. (1) S. arlettae, (2) S. aureus, (3) S. auricularis, (4) S. capitis, (5) S. caprae,
(6)
S. carnosus, (7) S. delphini, (8) S. epidermidis, (9) S. equorum, (10) S. gallinarum, (11) S. hominis,
(12)
S. intermedius, (13) S. kloosi, (14) S. ludginensis, (15) S. muscae, (16) S. pasteurii,
(17)
S. piscifermentas, (18) S. pseudintermedius, (19) S. saprophyticus, (20) S. schleiferii, (21) S. sciuri,
(22)
S. simulans, (23) S. vitulinus, (24) S. warnerii, (25) S. xylosus. Gwiazdkami oznaczono gatunki, dla których sekwencje genomów są aktualnie niedostępne.
7.1.4. Hipotetyczne białko wiążące DNA: SaoC
W obrębie sekwencji białka SaoC wytypowano dwa motywy potencjalnie wiążące DNA. Jeden z nich znajduje się na początku sekwencji białka, w jego wysoce konserwatywnej międzygatunkowo części (por. rys. 7), natomiast drugi w na początku drugiej połowy sekwencji w miejscu międzygatunkowo wysoce zmiennym (rys. 9).
Rys. 9. Sekwencja białka SaoC z zaznaczonymi jako strzałki dwoma potencjalnymi motywami HTH (ang. helix-turn-helix, helisa-zwrot-helisa) posiadającymi zdolność wiązania DNA. Nad sekwencją umieszczono podziałkę długości.
7.2. Powiązanie z układem toksyna-antytoksyna pemIKSa
Układ toksyna-antytoksyna pemIKSa, scharakteryzowany w naszym zespole badawczym (Bukowski i in. 2013), posiada zdolność do regulowania ekspresji genów na drodze sekwencyjnie specyficznej degradacji transkryptów mRNA w obrębie sekwencji U↓AUU, gdzie strzałką oznaczono miejsce trawienia. Jest on układem potencjalnie zaangażowanym w regulację ekspresji genów związanych z wirulencją. Analiza występowania sekwencji U↓AUU w potencjalnych transkryptach sekwencji kodujących genomu S. aureus ED98 ujawniła statystycznie istotne niedoreprezentowanie w genie saoC (Bukowski i in. 2013). Sekwencja genu saoB zawiera 12, natomiast genu saoC tylko 2 takie sekwencje. Niemniej w dobrze sprawdzonym modelu tego układu skonstruowanym w E. coli BL21(DE3) (Bukowski i in. 2013) na transkryptach obu genów mogą powstawać białka nawet podczas ekspresji toksyny PemKSa (rys. 10). W modelu tym wykorzystuje się plazmid pBAD-pemKSa do kontrolowanej arabinozą produkcji toksyny PemKSa i plazmid pETDuet do kontrolowanej IPTG ekspresji badanego genu, w tym przypadku był to plazmid pETDuet-saoB lub pETDuet-saoC.
7.3. Białko SaoC posiada zdolność wiązania DNA
Dokonując ekspresji białka SaoC z plazmidu pETDuet-saoC w komórkach E. coli BL21(DE3) zaobserwowano jego zdolność wiązania DNA. Białko SaoC produkowane jest w formie nierozpuszczalnej, można je jednak odzyskać poprzez rozpuszczenie w buforze zawierającym 1M NaCl (rys. 11A). Z tak otrzymanej próbki można strącić etanolem kwasy nukleinowe, rozdzielić je w żelu agarozowym i zaobserwować barwiące się bromkiem etydyny prążki. Tę pulę kwasów nukleinowych można najpierw oddysocjować od białka SaoC na drodze denaturacji cieplnej, co powoduje przesunięcie prążka na żelu agarozowym w kierunku zakresu niższych długości gdyż nie następuje opóźnienie migracji kwasów nukleinowych spowodowanej stanem związania z białkiem. Jeżeli przez dysocjacją cieplną potraktuje się preparat DNazą I otrzyma się, chroniony przed trawieniem przez białko SaoC, krótki fragment o długości poniżej 50 pz (rys. 11B). Fragment ten można poddać działaniu zarówno DNazy I jak i RNazy A aby wykazać, że oczyszczony fragment jest fragmentem DNA a nie RNA (rys. 11C). Wykonanie podobnego eksperymentu z wykorzystaniem pustego plazmidu pETDuet lub plazmidu pETDuet-saoB z genem białka SaoB nie prowadziło do wykrycia obecności kwasów nukleinowych w próbkach pochodzących z prób solubilizacji frakcji nierozpuszczalnej białek z użyciem 1M NaCl.
Rys. 11. Ekspresja wiążącego DNA białka SaoC w szczepie E. coli BL21(DE3). (A) Indukowana IPTG ekspresja skutkuje produkcją większości białka we frakcji nierozpuszczalnej. Możliwe jest jednak rozpuszczenie białka SaoC w buforze zawierającym 1M NaCl. (B) Preparat rozpuszczonego w 1M NaCl białka SaoC zawiera znaczną ilość kwasów nukleinowych, które na drodze denaturacji cieplnej można uwolnić ze stanu związanego z białkiem co powoduje przesunięcie prążka w kierunku zakresu niższych długości. Natomiast poddając początkowy preparat białka działaniu DNazy I można zaobserwować istnienie krótkiego fragmentu DNA, które będąc związane z białkiem SaoC jest chronione przed trawieniem. (C) Tak otrzymany i oddysocjowany, na drodze denaturacji cieplnej, od białka SaoC fragment DNA poddaje się trawieniu DNazą I ale nie RNazą A, co wskazuje, że pula kwasów nukleinowych wiązana przez białko SaoC to DNA.
7.4. Zmiany ekspresji genów operonu saoABC wywołane wpływem egzogennych czynników stresowych
W toku badań nad operonem saoABC sprawdzono czy różne egzogenne czynniki stresowe mogą wywoływać zmiany w ilości mRNA genów saoA, saoB i saoC. Wykorzystano metodę Real-Time PCR. Wyniki przedstawiono dla dwóch niezależnych eksperymentów wykorzystujących jako referencyjny gen gyrazy B (gyrB). W celu dodatkowej weryfikacji w drugim eksperymencie wykorzystano również gen RNA rybosomolanego, 23S rRNA (23srna). Spośród sprawdzanych czynników takich jak stres solny, stres osmotyczny, stres oksydacyjny, zakwaszenie, stres cieplny, działanie antybiotyku, brak preferencyjnego źródła węgla czy brak źródła aminokwasów, zaobserwowano powtarzalne wzory zmian w przypadku zakwaszenia oraz braku preferencyjnego źródła węgla czy braku źródła aminokwasów.
7.4.1. Zmiany wywołane zakwaszeniem środowiska
Obniżenie pH pożywki do wartości 5,0, w której hodowane były bakterie, wywoływał duże, przekraczające dwukrotność bazowej ekspresji, dodatnie zmiany w poziomie transkryptu genu saoA. Trend ten widoczny jest dla przedstawionych dwóch niezależnych eksperymentów, zarówno w przypadku wykorzystania jako genu referencyjnego genu gyrazy B (gyrB) jak i genu 23S rRNA (23srna) (rys. 12).
7.4.2. Zmiany wywołane brakiem preferencyjnego źródła węgla
Usunięcie z pożywki preferencyjnego źródła węgla, glukozy, podobnie jak zakwaszenie skutkowało wzrostem poziomu transkryptu genu saoA (rys. 13). W tym przypadku można również zaobserwować widoczny spadek ilości mRNA dla genu saoC. Jednak podobnie jak spadek ilości mRNA dla genu saoB, w przypadku wykorzystania genu 23S rRNA (23srna) jako genu referencyjnego, nie może być uznany na podstawie przeprowadzonych eksperymentów jako powtarzalny.
7.4.3. Zmiany wywołane brakiem źródła aminokwasów
W przypadku usunięcia z pożywki źródła aminokwasów zaobserwowano najbardziej intensywne zmiany w poziomie transkryptów genu operonu saoABC. Zmiany te dotyczyły dużego, przekraczającego dwukrotność bazowej ekspresji, wzrostu mRNA dla genu saoA i saoB (rys. 14).
Rys. 12. Zmiany w poziomie transkryptów genów operonu saoABC wywołanych zakwaszeniem środowiska dla dwóch niezależnych eksperymentów (A i B) oraz dwóch genów referencyjnych (genu gyrazy B, gyrB, i genu 23S rRNA, 23srna). Wartości względnego poziomu ekspresji wyrażają krotność zmian względem czasu 0, w którym ilość transkryptów jest przyjęta jako poziom referencyjny (zerowy). Gwiazdki umieszczone nad słupkami wyrażającymi wartość odchylenia standardowego oznaczają poziom istotności statystycznej zmian względem próbki z pobranej w tym samym czasie w eksperymencie kontrolnym (* p < 0,050; ** p < 0,010; *** p < 0,001).
Rys. 13. Zmiany w poziomie transkryptów genów operonu saoABC wywołanych brakiem preferencyjnego źródła węgla w pożywce dla dwóch niezależnych eksperymentów (A i B) oraz dwóch genów referencyjnych (genu gyrazy B, gyrB, i genu 23S rRNA, 23srna). Wartości względnego poziomu ekspresji wyrażają krotność zmian względem czasu 0, w którym ilość transkryptów jest przyjęta jako poziom referencyjny (zerowy). Gwiazdki umieszczone nad słupkami wyrażającymi wartość odchylenia standardowego oznaczają poziom istotności statystycznej zmian względem próbki z pobranej w tym samym czasie w eksperymencie kontrolnym (* p < 0,050; ** p < 0,010; *** p < 0,001).
Rys. 14. Zmiany w poziomie transkryptów genów operonu saoABC wywołanych brakiem źródła aminokwasów w pożywce dla dwóch niezależnych eksperymentów (A i B) oraz dwóch genów referencyjnych (genu gyrazy B, gyrB, i genu 23S rRNA, 23srna). Wartości względnego poziomu ekspresji wyrażają krotność zmian względem czasu 0, w którym ilość transkryptów jest przyjęta jako poziom referencyjny (zerowy). Gwiazdki umieszczone nad słupkami wyrażającymi wartość odchylenia standardowego oznaczają poziom istotności statystycznej zmian względem próbki z pobranej w tym samym czasie w eksperymencie kontrolnym (* p < 0,050; ** p < 0,010; *** p < 0,001).
7.5. Lokalizacja białek SaoB i SaoC w komórce bakteryjnej
Wykorzystując plazmid pCN35 (Charpentier i in. 2004), w którym umieszczono zmodyfikowane sekwencje operonu saoABC, wykonano próbę obserwacji lokalizacji białek SaoB i SaoC w komórce bakteryjnej. Dwie alternatywne wersje operonu zawierały geny saoB i saoC połączone z genem gfpmut2. Ekspresja białek na matrycy tych plazmidów prowadziła do powstania form fuzyjnych SaoB-GFP i SaoC-GFP umożliwiając obserwację ich ekspresji jak i ewentualne zróżnicowanie ich lokalizacji w obrębie komórki bakteryjnej (rys. 15).
Rys. 15. Obraz mikroskopowy uzyskany w świetle przechodzącym (jasne pole) oraz jako obraz fluorescencji w świetle niebieskim (fluorescencja) dla bakterii będących nosicielami kolejno plazmidów pCN35 (gfpmut2-), pCN68 (gfpmut2+), pCN35-saoA-saoBgfmut2-saoC oraz pCN35-saoA-saoBsaoCgfmut2. W przypadku SaoB-GFP można zaobserwować zwiększoną ekspresję białka fuzyjnego w nielicznych komórkach, w ktorych obraz morfologicznie jest podobny do obrazu otrzymanego dla wolnego GFP. Natomiast w przypadku białka SaoC-GFP brak jest jakościowych różnic w ekspresji białka fuzyjnego ale otrzymany obraz różni się morfologicznie od obrazów dla wolnego GFP i białka SaoC-GFP. Różnice te wynikają z faktu fluorescencji peryferyjnej części komórek, co dodatkowo podkreślono dla trzech, odosobnionych i dobrze widocznych komórek bakteryjnych.
W odniesieniu do kontrolnego eksperymentu, w którym cząsteczki wolnego GFP były produkowane na matrycy plazmidu pCN68 (Charpentier i in. 2004), zaobserwowano duże różnice w ekspresji białka SaoB-GFP. Było ono produkowane w większej ilości tylko w nielicznych komórkach, które dawały obraz świecących kół, podobnie jak w przypadku wolnego GFP. Natomiast poziom ekspresji białka SaoC nie wykazywał jakościowych różnic między różnymi komórkami ale obraz mikroskopowy miał morfologicznie odmienny wygląd od tych otrzymanych dla wolnego GFP czy fuzyjnego białka SaoB-GFP. Przy bardziej dokładnej analizie można dostrzec, że jest to spowodowane nierównomiernym rozkładem sygnału. W przypadku białka SaoC-GFP komórki bakteryjne wyglądały jak puste w środku krążki. Wskazuje to na peryferyjną lokalizację białka SaoC-GFP w obrębie komórki bakteryjnej.
7.6. Szczepy typu knockout
W toku badań nad operonem saoABC udało się otrzymać szczepy S. aureus RN4220 pozbawione genów saoA i saoC (szczepy typu knockout). Próby otrzymania szczepu z usuniętym genem saoB nie powiodły się. Z wykorzystaniem tych szczepów przeprowadzono badania opisane w kolejnych podrozdziałach.
Rys. 16. Weryfikacja genetyczna i fenotypowa otrzymanych szczepów S. aureus RN4220 ΔsaoA i RN4220 ΔsaoC. (A) Produkt PCR z wykorzystaniem starterów flankujących operon saoABC jest skrócony względem kontrolnego DNA genomowego S. aureus RN4220 (typ dziki), oznaczonego gwiazdką. (B) W przypadku starterów specyficznych dla usuniętych genów nie otrzymano produktu PCR w ogóle. (C) Wytypowane kolonie nie posiadały oporności na chloramfenikol warunkowanej genem obecnym w plazmidzie pKOR, co wskazuje na jego skuteczne usunięcie po rekombinacji z chromosomem bakteryjnym.
7.6.1. Szczepy Staphylococcus aureus RN4220 ΔsaoA i RN4220 ΔsaoC
Szczepy S. aureus RN4220 ΔsaoA i RN4220 ΔsaoC otrzymano z wykorzystaniem plazmidu pKOR (Bae i Schneewind 2006). Usunięcie poszczególnych genów jak również samego plazmidu pKOR po udanej rekombinacji z chromosomem bakteryjnym zostało dokładnie zweryfikowane. Zaobserwowano skrócenie produktu PCR z wykorzystaniem starterów flankujących operon saoABC (rys. 16A); brak sygnału od produktu reakcji PCR z wykorzystaniem starterów specyficznych dla usuniętych genów (rys. 16B); a otrzymane szczepy nie posiadały zdolności wzrostu na pożywkach z chloramfenikolem, na który oporność warunkuje gen obecny w plazmidzie pKOR (rys. 16C).
7.6.2. Dynamika wzrostu i wirulencja w modelu zarodka kurzego szczepów Staphylococcus aureus RN4220 ΔsaoA i RN4220 ΔsaoC
Monitorowanie wzrostu hodowli płynnej komórek szczepów S. aureus RN4220 ΔsaoA i RN4220 ΔsaoC nie wykazało żadnych różnic w jej dynamice w porównaniu ze szczepem wyjściowym typu dzikiego S. aureus RN4220 (rys. 17A). W kontekście badań nad wpływem warunków stresowych na ekspresję genów operonu saoABC (por. 7.4) przeprowadzono podobny eksperyment monitorując wzrost w pożywce o pH 5,0. Podobnie jak dla wzrostu w standardowej pożywce nie zaobserwowano różnic w dynamice wzrostu, który jednak był znacząco spowolniony w wyniku zakwaszenia środowiska. Analogiczne eksperymenty w przypadku braku preferencyjnego źródła węgla lub braku źródła aminokwasów byłyby nieuzasadnione, ze względu na fakt, że brak tak kluczowych składników w pożywce całkowicie blokuje wzrost hodowli.
Rys. 17. Porównanie szczepu typu dzikiego S. aureus RN4220 i dwóch szczepów typu knockout S. aureus RN4220 ΔsaoA i RN4220 ΔsaoC. (A) Pomiędzy wspominanymi trzema szczepami nie zaobserwowano różnicy w dynamice wzrostu w pełnej pożywce płynnej. Pola zacienione kolorami, odpowiadającymi kolorom krzywych wzrostu obrazują odchylenie standardowe. (B) Szczepy typu knockout wykazują jednak różnice w wirulencji w modelu zarodka kurzego. Niestety ze względu na duży rozrzut wyników dla szczepu typu dzikiego, statystycznie istotna jest tylko różnica pomiędzy oboma szczepami typu knockout (p < 0,050).
Charakteryzując szczepy S. aureus RN4220 ΔsaoA i RN4220 ΔsaoC nie zaobserwowano również różnic w rozmiarze strefy zahamowania dla zastosowanych 17 różnych antybiotyków.
Dodatkowym eksperymentem przeprowadzonym na szczepach S. aureus RN4220 ΔsaoA i RN4220 ΔsaoC było określenie stopnia wirulencji w modelu zarodka kurzego, który został opracowany w naszym zespole badawczym (Polakowska i in. 2012). Na podstawie dwóch niezależnych eksperymentów wykazano statystycznie istotne różnice w wirulencji między oboma szczepami, jednak ze względu na duży rozrzut wyników w przypadku typu dzikiego S. aureus RN4220, różnice między tym szczepem a dwoma szczepami typu knockout okazały się statystycznie nieistotne (rys. 17B).
7.7. Zmiany w proteomie indukowane aktywnością białka SaoC
Wykorzystując szczep S. aureus RN4220 ΔsaoC dokonano próby określenia wpływu kontrolowanej ekspresji genu saoC na proteom komórkowy.
Rys. 18. Dwa powtórzenia dwuwymiarowej różnicowej elektroforezy żelowej wykonane dla całkowitej puli białek z bakterii szczepu S. aureus RN4220 ΔsaoC hodowanych w obecności jonów kadmu i wyznakowanych dwoma różnymi barwnikami fluorescencyjnymi. W eksperymencie kontrolnym użyto plazmid pCN51 a we właściwym pCN51-saoC, umożliwiający kontrolowaną produkcję białka SaoC. Połączone sygnały z obu eksperymentów dają żółty obraz wskazujący na brak większych różnic pomiędzy porównywanymi proteomami.
W tym celu wprowadzono do wyżej wspomnianego szczepu pusty plazmid pCN51 (Charpentier i in. 2004) jako kontrolę lub plazmid pCN51-saoC, który z kolei umożliwiał kontrolowaną jonami kadmu ekspresję genu saoC. Wyizolowano całkowite białko z bakterii hodowanych w obecności jonów kadmu i wykorzystując metodę dwuwymiarowej różnicowej elektroforezy żelowej 2D-DIGE dokonano próby określenia różnic pomiędzy pulami białek. Eksperyment wykonano w trzech powtórzeniach ale do analizy użyto żele tylko z dwóch, ze względu dużą niespójność jednego z otrzymanych rozdziałów z pozostałymi. Otrzymane obrazy wykazywały bardzo duże podobieństwo (rys. 18). Udało się zidentyfikować 7 różnic, jednak tylko w trzech siła sygnału umożliwiała dalszą izolację i identyfikację białek. Ostatecznie udało się zidentyfikować zmiany w przypadku 2 białek. Pierwsze to białko SaoC, od którego sygnał pojawił się w następstwie indukcji jego produkcji jonami kadmu na matrycy genu obecnego w plazmidzie pCN51-saoC. Drugie to syntaza cysteinowa, której poziom spadł w wyniku indukcji produkcji białka SaoC.
8. DYSKUSJA
8.1. Międzygatunkowa analiza zmienności sekwencji operonu
saoABC
Dostępność sekwencji danego locus genomowego z odmiennych filogenetycznie jednostek jest niezwykle pomocna w jego wstępnej analizie. Sekwencje promotorowe rozpoznawane przez kompleks polimerazy RNA czy różnego rodzaju czynniki transkrypcyjne są zazwyczaj stosunkowo krótkie i w różnym stopniu odbiegają od uśrednionego na podstawie dużej populacji konsensusu. Wykrycie ich w pojedynczej sekwencji nie daje niepodważalnej pewności rzeczywistej obecności funkcjonalnego motywu. Jednak w przypadku znajomości homologicznych miejsc z różnych jednostek filogenetycznych już samo dopasowanie wielosekwencyjne może ukazać wysoce konserwatywne miejsca. Ten sposób postępowania sprawdza się bardzo dobrze właśnie w przypadku analizy sekwencji niekodujących, gdyż w ich obrębie tylko miejsca istotne w kontekście regulacji ekspresji genów wyłaniają się jako wysoce konserwatywne fragmenty. Określone w ten sposób fragmenty sekwencji można odnosić do znanych sekwencji konsensusowych różnych czynników zawiadujących transkrypcją genów.
W przypadku operonu saoABC należy zwrócić uwagę na odległości między jego genami umożliwiające potencjalnie istnienie dodatkowych elementów regulatorowych oraz na kilka istotnych miejsc, odnalezionych w sposób opisany w poprzednim akapicie w obrębie jego sekwencji niekodujących pochodzących z 17 gatunków z rodzaju Stapylococcus. Powyżej genu saoA znajduję się kaseta -10 podstawowej podjednostki σA (TATAAT, por. 4.4.1) oraz poprzedzający ją motyw bogaty w nukleotydy A i T, który może odpowiadać kasecie -35. Niemniej stopień konserwatywności w tym drugim przypadku nie jest duży. Co istotniejsze, poniżej miejsca wiązania podjednostki σA znajduje się miejsce wiązania gronkowcowej podjednostki σB GTTT-(n16)-GGGTA (por. 4.4.2), która, co omówiono we wstępie, pełni niezwykle istotne funkcje związane z regulacją ekspresji genów w różnych warunkach stresowych i występuję szeroko u przedstawicieli typu Firmicutes a u gronkowca złocistego powiązana jest również z modulacją ekspresji czynników wirulencji. Zwiększona ekspresja genu saoA w wyniku braku preferencyjnego źródła węgla, zwiększona ekspresja genów saoA i saoB będącego wynikiem głodu aminokwasowego i powiązanie funkcjonalne z aktywnością podjednostki σB wpisuje operon saoABC w szerszy kontekst mechanizmów regulatorowych gronkowca złocistego, odpowiedzialnych za modulowanie reakcji komórek bakteryjnych na warunki stresowe. Ponadto w dwóch pracach poświęconych regulonowi podjednostki σB wykazano, że gen saoA ulega zwiększonej transkrypcji (Gertz i in. 2000; Bischoff i in. 2004). W jednej z nich autor zbadał również metodą Northern Blot transkrypcję wybranych genów, w tym hipotetycznego genu nazywanego tutaj saoA. W badaniu tym sonda dla genu saoA dawała trzy sygnały, na wysokościach idealnie odpowiadających alternatywnym transkryptom obejmujących sam gen saoA, gen saoA i saoB oraz wszystkie trzy geny saoA, saoB i saoC jednocześnie (Gertz i in. 2000). Pozostaje to w zgodzie z obserwacjami tej pracy, gdzie z jednej strony wykazano obecność transkryptu całego operonu a z drugiej możliwość selektywnej indukcji ekspresji samego genu saoA lub pary genów saoA i saoB jednocześnie.
W obrębie sekwencji niekodującej powyżej genu saoB można odnaleźć tylko pojedynczy konserwatywny motyw rozszerzonej kasety -10 (TGCTATAAT), która stanowi autonomiczne miejsce wiązania podstawowej podjednostki σA (TGnTATAAT, por. 4.4.1). Jest to jedyny konserwatywny motyw istniejący w tej części operonu saoABC.
Najbardziej złożona sytuacja ma miejsce jednak w obrębie sekwencji powyżej genu saoC. Można w niej odnaleźć sekwencję, która przypomina budową motywy rozpoznawane przez alternatywne podjednostki σ, czyli zawiera krótkie sekwencje odpowiadające kasetom -35 oraz -10 rozdzielone kilkunastoma nukleotydami. Sekwencja domniemanej kasety -35 (CTTGAAA) idealnie pasuje do konsensusowej sekwencji podjednostki σ32 z E. coli i jej homologów pochodzących z innych gatunków (Erickson i in. 1987; Gvakharia i in. 2007), natomiast sekwencję domniemanej kasety -10 (GTTTAAACT) trudno jest przyporządkować znanym motywom alternatywnych podjednostek σ. Żaden z powyżej przytoczonych motywów nie jest przyporządkowany do żadnej alternatywnej podjednostki σ gronkowca złocistego. Biorąc pod uwagę fakt, że motywy rozpoznawane przez alternatywne podjednostki σ często znajdują się w ich własnych promotorach, motyw ten może być motywem rozpoznawanym przez samo białko SaoC. Poniżej omawianej sekwencji promotorowej występuje konserwatywny odcinek o długości około 25 nukleotydów, w obrębie którego występuje sekwencja palindromowa TGACGTTT-(n14)-AAACGTCA. Sekwencja TGACGTTT stanowi sekwencję CRE (element odpowiedzi na katabolity, ang. catabolite-responsive element) i może być wiązana przez czynniki transkrypcyjne aktywowane warunkami stresowymi (Wahab i in. 2000; Jang i Jung 2014). Jeszcze niżej występuje motyw TACATAAA, który wskazywany jest przez program BPROM (Solovyev i Salamov 2011) jako potencjalne miejsce wiązania białka CAP (CRP), które to miejsce jest również miejscem klasy CRE. W świetle danych na temat tego typu czynników transkrypcyjnych u bakterii gram dodatnich, stanowią one głównie represory transkrypcji, których aktywność moduluje w dużej mierze globalny metabolizm węgla (por. 4.1.1). Należy w tym miejscu ponownie zwrócić uwagę na fakt silnej indukcji ekspresji genu saoA w wyniku braku preferencyjnego źródła węgla jak i zwiększonej ekspresji genów saoA i saoB będącego wynikiem głodu aminokwasowego.
Poniżej genu saoC znajduje odcinek palindromowej sekwencji o długości 91 nukleotydów komplementarnej w 66%. W momencie powstawania transkryptu mRNA może on potencjalnie formować strukturę spinki do włosów i stanowić terminator transkrypcji.
Wszystkie przytoczone charakterystyki dotyczące położenia, otoczenia genowego, niekodujących sekwencji regulatorowych jak i transkrypcji genów saoA, saoB i saoC jednoznacznie wskazują, że stanowią one odrębną jednostkę strukturalno-funkcyjną, operon saoABC.
8.2. Ekspresja genów operonu saoABC w warunkach stresowych
Dla operonu saoABC można zaobserwować powtarzalny wzór zmian ekspresji jego genów w warunkach zakwaszenia i braku preferencyjnego źródła węgla, kiedy ulega zwiększeniu ekspresja genu saoA, czy głodu aminokwasowego, kiedy ulega zwiększeniu ekspresja zarówno genu saoA jak i genu saoB. Taki wzór zmienności ilości mRNA dla poszczególnych genów pozostaje w zgodzie z przytoczonym wcześniej faktem (por. 8.1) istnienia trzech alternatywnych transkryptów operonu saoABC, obejmujących wszystkie jego geny, geny saoA i saoB oraz sam gen saoA. Istnienie sekwencji promotorowych dla podjednostek σA i σB przed operonem oraz sekwencji wiążących represory transkrypcji przed genem saoC może sugerować, że operon ten podlega konstytutywnej ekspresji jako transkrypt obejmujący wszystkie geny, natomiast w warunkach stresowych ekspresja poszczególnych jego komponent może ulec zróżnicowaniu. Wyjaśniałoby to brak zwiększonej ekspresji genu saoC w badanych warunkach stresowych przy możliwości wzrostu ilości mRNA dla genów saoA i saoB.
W świetle tych danych trudno jednak formułować hipotezy dotyczące wzrostu ekspresji samego genu saoA, gdyż przynajmniej na poziomie organizacji operonu nie można zlokalizować żadnych konserwatywnych sekwencji, które w sposób oczywisty rozdzielałyby proces transkrypcji genu saoA i saoB. Można jednak przypuszczać, że istniejące między tymi genami miejsce wiązania dla podstawowej podjednostki σA w postaci rozszerzonej kasety -10 może spełniać tę rolę. Stres związany z zakwaszeniem może zatrzymywać transkrypcję z promotorów podjednostki σA a kompleks polimerazy RNA pomiędzy genem saoA i saoB może sterycznie blokować kontynuację transkrypcji z promotora podjednostki σB znajdującego się powyżej genu saoA ale poniżej głównego promotora dla podjednostki σA. Natomiast w warunkach głodu aminokwasowego, gdy transkrypcja z promotorów podstawowych może być wstrzymana poprzez represję podstawowej podjednostki σA uniemożliwiającą powstanie kompleksów polimerazy RNA z promotorami, geny saoA i saoB mogą ulegać transkrypcji z promotora podjednostki σB podczas gdy kontynuacja transkrypcji w obrębie genu saoC jest blokowana przez wiążące się powyżej tego genu represory.
Związek operonu saoABC z mechanizmem regulacji transkrypcji zapewnianym przez podjednostkę σB oraz zmienność ekspresji jego genów w warunkach zakwaszenia, braku preferencyjnego źródła węgla i głodu aminokwasowego może sugerować jego udział w ważnych procesach związanych z interakcją patogen-gospodarz. Rola podjednostki σB jest wiązana z przebiegiem patogenezy a nawet sugeruje się, że może ona mieć znaczenie szczególnie w kontekście takich interakcji. Natomiast przytoczone tutaj trzy warunki stresowe, składające się ogólnie na zakwaszenie i brak składników odżywczych, stanowią wyzwanie dla komórek bakteryjnych internalizowanych do wnętrza eukariotycznych komórek gospodarza. Komórki gronkowca złocistego są internalizowane nie tylko w procesie fagocytozy przez komórki układu odpornościowego ale dzięki białku wiążącym fibronektynę potrafią wywoływać proces internalizacji na drodze fagocytozy do komórek endotelium czy keratynocytów (Edwards i in. 2010; Fraunholz i Sinha 2012). Stanowi to mechanizm ucieczki przed układem odpornościowym i przyczynia się do przewlekłych i nawracających infekcji. Warto tutaj dodać, że w przypadku podjednostki σB wykazano jej szybką i krótkotrwałą aktywację będącą właśnie następstwem internalizacji do komórek ludzkiego nabłonka oskrzeli (Pförtner i in. 2014). Pozostaje to w zgodzie z wcześniejszym doniesieniem dotyczącym poziomu ekspresji genu podjednostki σB a nasileniem internalizacji do komórek osteoblastów (Nair i in. 2003).
8.3. Białko wiążące DNA: SaoC
Białko SaoC posiada kilka charakterystyk, które sugerują, że jest nieopisaną dotąd alternatywną podjednostką σ typu ECF. Zostały one szerzej opisane poniżej.
(1)
Białko SaoC posiada dwa potencjalne motywy HTH (helisa skręt helisa, ang. helix trun helix) wiążące DNA a profil konserwatywności sekwencji całego białka wskazuje, że jest to najprawdopodobniej białko dwudomenowe z bardzo konserwatywną domeną N-końcową i zmienną domeną C-końcową, przy czym posiadające również konserwatywny C-terminalny fragment cząsteczki. Znane podjednostki ECF są białkami dwudomenowymi, których domeny odpowiadają domenie 2 i 4 podstawowych podjednostek σ, które z kolei posiadają w sumie 4 domeny. Ponadto długość sekwencji białka SaoC (317 reszt aminokwasowych) nie wykracza poza zakres długości opisanych dotąd alternatywnych podjednostek σ (Staroń i in. 2009).
(2)
Białko SaoC posiada rzeczywistą zdolność wiązania DNA wykazaną w systemie ekspresyjnym pET w szczepie E. coli BL21(DE3). Białko to wiąże i chroni przed degradacją przez DNazę I krótki fragment DNA (ok. 20 -50 pz), który odpowiada rozmiarowi sekwencji promotorowych.
(3)
Białko SaoC podczas rozdziału w żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących (SDS-PAGE) migruje w nietypowy sposób dając sygnał w przedziale większych mas molekularnych, pomiędzy 45 a 66 kDa, niż ta którą się rzeczywiście charakteryzuje, czyli 35,3 kDa. Sugeruje się, że związane jest to z jego składem aminokwasowym, co obserwowano już w przypadku innych alternatywnych podjednostek σ (Gitt i in. 1985; Strickland i in. 1988; Deora i Misra 1996; Deora i in. 1997). Warto również zwrócić uwagę, że białka wiążące DNA należące do systemów jednokomponentowych, takich jak NrdR czy Fur, wykazują standardową szybkość migracji dla metody SDS-PAGE (wyniki własne).
(4)
Białko fuzyjne SaoC-GFP jest zlokalizowane peryferyjnie w obrębie komórki bakteryjnej. W przypadku wielu opisanych alternatywnych podjednostek σ są one związane przez czynniki anty-sigma, które będąc białkami transbłonowymi wiążą podjednostki σ przy błonie komórkowej.
(5)
Powyżej genu saoC występuje wysoce konserwatywna międzygatunkowo sekwencja, która budową odpowiada sekwencji promotorowej. Ponadto kaseta -35 tej potencjalnej sekwencji jest identyczna z sekwencją kasety -35 podjednostki σ32 E. coli i innych bakterii Gram ujemnych (Erickson i in. 1987; Gvakharia i in. 2007). Bardzo istotnm jest tutaj fakt, że przedstawiona sekwencja promotorowa nie jest dotychczas powiązana z żadną alternatywną podjednostką σ u gronkowca złocistego a obecność sekwencji konsensusowej dla danej podjednostki σ w jej własnym operonie nie jest zjawiskiem rzadkim (Wu 1996; Huang i in. 1998; Miller i in. 2012; Mascher 2013).
(6)
Geny operonu saoABC wykazują bardzo specyficzny wzór zmienności ekspresji w odpowiedzi na zewnątrzkomórkowe czynniki stresowe związane z zakwaszeniem, brakiem preferencyjnego źródła węgla czy głodem aminokwasowym.
Przytoczone obserwacje stanowią silne oparcie hipotezy dotyczącej operonu saoABC jako operonu kodującego nie tylko potencjalny system regulacji transkrypcji genów, ale jako operonu kodującego nieopisany dotychczas system alternatywnej podjednostki σ gronkowca złocistego. Jej występowanie ogranicza się tylko do rodzaju Staphylococcus, co pozostaje w zgodzie z dotychczasowymi badaniami nad bakteryjnymi podjednostkami σ typu ECF, które mogą mieć różny filogenetyczny zakres występowania obejmujący całe typy, rodzaje lub ograniczając się tylko do pojedynczych gatunków (Wösten 1998; Staroń i in. 2009).
8.4. Szczepy Staphylococcus aureus RN4220 ΔsaoA i RN4220 ΔsaoC
Usunięcie badanego genu z genomu komórki bakteryjnej, czyli otrzymanie tak zwanego mutanta zerowego względem danego genu, potocznie zwanego również szczepem typu knockout, jest powszechnie stosowanym podejściem w ocenie istotności badanych elementów genetycznych dla metabolizmu komórki bakteryjnej. W toku prowadzonych badań udało się uzyskać dwa tego typu szczepy względem genu saoA i saoC.
Otrzymane szczepy nie różniły się jednak dynamiką wzrostu a wyniki dotyczące stopnia wirulencji w modelu zarodka kurzego nie pozwalają na zaproponowanie jednoznacznej interpretacji. Nie zaobserwowano również różnic w rozmiarze strefy zahamowania dla 17 różnych antybiotyków. Należy zwrócić uwagę na kilka istotnych faktów wynikających z badań alternatywnych podjednostek σ, które zestawiono poniżej.
Pierwszą kwestią wymagającą omówienia jest regulacja transkrypcji w odpowiedzi na ściśle określone warunki środowiska zewnętrznego, których nietrafny dobór eksperymentalny pociąga za sobą brak różnic w obserwowanym wzroście między szczepami typu dzikiego a szczepami typu konockout. Sytuacja taka miała miejsce zarówno w przypadku gronkowcowej podjednostki σB jak również podjednostki σS (Wu 1996; Kullik i in. 1998; Shaw i in. 2008; Miller i in. 2012) a także dla szczepu B. subtilis, w którym dokonano usunięcia genów aż siedmiu alternatywnych podjednostek sigma (Asai i in. 2008). Dla podjednostki σS między szczepem typu dzikiego a szczepem typu knockout nie zaobserwowano również różnic we wzroście w obecności wielu czynników stresowych (por. 4.4).
Kolejnym aspektem jest wirulencja. Przytaczana we wcześniejszych częściach tej pracy sugestia, że podjednostka σB może brać udział w regulacji bardzo subtelnych oddziaływań patogen-gospodarz znajduje swoje odzwierciedlenie w wynikach badań. W modelu szczurzym i mysim jedne grupy badawcze nie potrafiły wykazać różnic w stopniu zjadliwości szczepu typu dzikiego i typy knockout (Chan i in. 1998; Nicholas i in. 1999) a inna grupa stosując w modelu mysim zamiast iniekcji podskórnych zakażanie poprzez wszczepiony cewnik, co miało być modelem zakażeń pooperacyjnych, potrafiła wykazać obniżoną wirulencję szczepu typu knockout (Lorenz i in. 2008). Analizowane w tej pracy mutanty zerowe względem genu saoA i saoC nie wykazywały różnic w modelu zarodka kurzego. Wynika to najprawdopodobniej z trzech faktów. (1) Pierwszym jest opisana wcześniej sekwencja promotorowa dla podjednostki σB występująca powyżej operonu saoABC co może sugerować istotną zależność pomiędzy oboma systemami a szczep RN4220 posiada naturalnie upośledzony mechanizm aktywacji podjednostki σB (Wu 1996; Kullik i in. 1998). (2) Kolejnym faktem jest ludzkie pochodzenie szczepu typu dzikiego S. aureus RN4220, z którego udało się wyprowadzić szczepy typu knockout. Jest to istotne, gdyż model zarodka kurzego ma większą moc dyskryminacyjną dla szczepów pochodzenia drobiowego (Polakowska i in. 2012). Pierwotnie próbowano otrzymać mutanty zerowe dla drobiowego szczepu S. aureus CH91 jednak próby te zakończyły się niepowodzeniem.
(3) Ponadto model zarodka kurzego pozwala na obserwację znaczących różnic w wirulencji i bardziej subtelne różnice mogą być w tym modelu niewykrywalne (Polakowska i in. 2012).
Ostatnim istotnym faktem w kontekście braku obserwowanych różnic między szczepem typu dzikiego a szczepami S. aureus RN4220 ΔsaoA i RN4220 ΔsaoC jest wspomniane wyżej upośledzenie systemu transdukcji sygnału prowadzącej do aktywacji podjednostki σB. Szczep RN4220 posiada, naturalnie występującą w wąskim zakresie szczepów gronkowcowych, mutację prowadzącą do N-końcowego skrócenia ramki odczytu fosfatazy RsbU (Wu 1996; Kullik i in. 1998). Wiele badań wskazuje, że stanowi ona u gronkowca złocistego kluczowy element jedynej istniejącej drogi aktywacji podjednostki σB (por. 4.3.3). Fakt ten może stanowić wystarczające wyjaśnienie braku różnic we wzroście między szczepem typu dzikiego a szczepami S. aureus RN4220 ΔsaoA i RN4220 ΔsaoC w obecności całego spektrum antybiotyków o różnym mechanizmie działania. Szczególnie w świetle postulowanego w tej pracy związku między systemem regulacji ekspresji genów opartym o podjednostkę σB a ekspresją komponent operonu saoABC w warunkach stresowych.
Przy porównaniu szczepów typu dzikiego i mutantów zerowych względem alternatywnych podjednostek σ należałoby też wspomnieć o innej przeszkodzie. Jest nią nachodzenie na siebie regulonów różnych systemów regulacji ekspresji genów, co jest wykazane również w przypadku podjednostek ECF (Mascher i in. 2007; Staroń i in. 2009; Luo i Helmann 2009). Zjawisko to powoduje różnego stopnia kompensację funkcji celowo upośledzonego systemu i znacząco utrudnia badania stosujące opisywane tutaj podejście porównawcze.
8.5. Powiązanie operonu saoABC z układem toksyna-antytoksyna pemIKSa
Fakt oporności transkryptów genów saoB i saoC na endorybunukleolityczną aktywność interferazy mRNA PemKSa jest kolejnym przykładem, po alternatywnej podjednostce σB, integracji z innymi systemami regulatorowymi. System toksyna-antytoksyna pemIKSa posiada zdolność wprowadzania komórki bakteryjnej w stan matabolicznego uśpienia, w którym może przetrwać niekorzystne warunki. Realizowane jest to na drodze degradacji większości komórkowego mRNA. Tylko część transkryptów, ze względu na brak lub małą ilość sekwencji rozpoznawanych przez interferazę PemKSa, może ulegać translacji. Najprawdopodobniej są to transkrypty genów kluczowych dla komórki bakteryjnej w warunkach stresowych (Bukowski i in. 2013). Uzyskane wyniki wskazują, że dla genów saoB i saoC translacja może zachodzić w obecności aktywności interferazy PemKSa. Ponadto w obrębie genu saoC istnieje statystycznie istotne niedoreprezentowanie w sekwencje, UAUU, rozpoznawane przez interferazę PemKSa, (Bukowski i in. 2013). Sugeruje to istotność tych genów dla komórki bakteryjnej wystawionej na działanie niekorzystnych warunków. Warto tutaj również wskazać ponownie na fakt powiązania podjednostki σB i innego systemu toksyna-antytoksyna, systemu mazEFSa (Donegan i Cheung 2009).
8.6. Próby umiejscowienia funkcji operonu saoABC w globalnym systemie regulacji ekspresji genów
Próby analizy różnic w proteomie wywoływanych przez białko SaoC nie przyniosły pożądanych rezultatów. Pomimo wykazania różnic między proteomem S. aureus RN4220 ΔsaoC pCN51 i S. aureus RN4220 ΔsaoC pCN51-saoC metodą dwuwymiarowej elektroforezy 2D-DIGE w większości przypadków otrzymano zbyt niski sygnał niepozwalający na skuteczną i jednoznaczną identyfikację różnicujących białek. Zidentyfikowano tylko pojawienie się sygnału od samego białka SaoC, co świadczy o prawidłowym działaniu układu eksperymentalnego, oraz obniżenie sygnału pochodzącego od syntazy cysteinowej, które nawiązuje do zmian ekspresji genów operonu saoABC w wyniku głodu aminokwasowego. W świetle badań nad regulonami systemów regulacji ekspresji genów metodami elektroforezy żelowej, sytuacja identyfikacji niewielkiej ilości zmian w tego typu układach eksperymentalnych nie jest rzadkością (Gertz i in. 2000).
Mimo, że transkryptom nie odzwierciedla w sposób bezpośredni proteomu, metody wysokoprzepustowe skupiające się właśnie na zmianach w puli mRNA przynoszą lepsze rezultaty w tego typu badaniach niż metody proteomiczne (Bischoff i in. 2004; Pané-Farré i in. 2006). Przede wszystkim dotyczy to ilości identyfikacji potencjalnych składników regulonu badanego systemu regulacji ekspresji genów. W ostatnich latach gwałtownie rośnie powszechność metody wysokoprzepustowego sekwencjonowania transkryptomu metodą sekwencjonowania nowej generacji (RNA-Seq) pozwalającego na ilościową analizę zmian w puli komórkowego mRNA. Daje to szansę na ponowne kompleksowe podejście do analizy zmian, które wywoływane są w komórce przez wiążące DNA białko SaoC.
9. PODSUMOWANIE
Wyniki uzyskane w toku opisanych badań ukazały hipotetyczny operon trzech genów, operon saoABC, jako potencjalny, całkowicie nieznany dotąd system regulacji ekspresji genów specyficzny dla bakterii z rodzaju Staphylococcus. System związany z reakcją na niesprzyjające warunki środowiskowe, na których kombinację komórki bakteryjne są w szczególności wystawione w trakcie internalizacji do wnętrza komórek gospodarza.
Ukazana została zdolność białka SaoC do wiązania DNA. Wskazano na wiele przesłanek silnie sugerujących, że białko SaoC może być kolejną, w repertuarze trzech już znanych, gronkowcowych alternatywnych podjednostek sigma typu ECF polimerazy RNA. Obok (1) zdolności wiązania DNA i (2) dwóch potencjalnych motywów HTH z nim oddziałujących są to: (3) nietypowa migracja podczas elektroforezy SDS-PAGE,
(4) peryferyjna lokalizacja w obrębie komórki sugerująca związanie białka SaoC z błoną komórkową, (5) wysoce konserwatywny międzygatunkowo element poprzedzający gen saoC o strukturze promotora wiązanego przez podjednostki sigma bakteryjnej polimerazy RNA i sekwencji dotąd niepowiązanej z żadną znaną gronkowcową podjednostką sigma, (6) powtarzalny wzór zmian ekspresji genów operonu saoC w następstwie zaistnienia ściśle określonych warunków środowiska. Nie bez znaczenia pozostaje również powiązanie operonu saoABC z dobrze scharakteryzowanym układem toksyna-antytoksyna pemIKSa.
Opracowana charakterystyka operonu saoABC jest ciągle niepełna a wiele nasuwających się pytań ciągle wymaga odpowiedzi. Eksperymenty proteomiczne nie przyniosły oczekiwanych rezultatów, niemniej ciągle możliwym jest zastosowanie podejścia transkryptomicznego. Obecnie techniki sekwencjonowania nowej generacji (NGS, ang. next generation sequencing) dają dużą szansę na owocne zgłębienie wiedzy na temat miejsca operonu saoABC w metabolizmie gronkowca złocistego. Również kontynuacja pracy nad szczepami S. aureus RN4220 ΔsaoA i RN4220 ΔsaoC stanowi atrakcyjną ścieżkę badań, szczególnie w kontekście powiązania operonu saoABC z systemem alternatywnej podjednostki σB. Występująca w szczepie RN4220 naturalna mutacja genu fosfatazy RsbU, kluczowej komponenty związanej z przekazem sygnału do podjednostki σB, mogła być czynnikiem utrudniającym opisane w tej pracy badania.
Z drugiej strony może stanowić wyjściowy model doświadczalny w pracach nad zależnościami pomiędzy podjednostką σB i operonem saoABC.
Wyniki badań zawarte w pracy poszerzają obecną wiedzę na temat gronkowca złocistego. Jednak przede wszystkim są rozpoczęciem zupełnie nowej ścieżki badań nad fizjologią i patogenezą tego drobnoustroju związanej z całkowicie dotąd nieznanym operonem wykazującym powiązania ze znanymi mechanizmami ekspresji genów jak również bezpośrednie powiązania z reakcją na stresowe czynniki środowiskowe powszechnie pojawiające się w efekcie oddziaływania patogen-gospodarz.
10. BIBLIOGRAFIA
Achberger EC, Whiteley HR. The role of the delta peptide of the Bacillus subtilis RNA polymerase in promoter selection. The Journal of Biological Chemistry 1981; 256(14): 7424–32.
Ades SE. Control of the alternative sigma factor sigmaE in Escherichia coli. Current Opinion in Microbiology 2004; 7(2): 157–62.
Ades SE, Connolly LE, Alba BM, Gross CA. The Escherichia coli sigma(E)-dependent extracytoplasmic stress response is controlled by the regulated proteolysis of an anti-sigma factor. Genes and Development 1999; 13(18): 2449–61.
Alba BM, Leeds JA, Onufryk C, Lu CZ, Gross CA. DegS and YaeL participate sequentially in the cleavage of RseA to activate the sigma(E)-dependent extracytoplasmic stress response. Genes and Development 2002; 16(16): 2156–68.
Alban A, David SO, Bjorkesten L, Andersson C, Sloge E, Lewis S, Currie I. A novel experimental design for comparative two-dimensional gel analysis: twodimensional difference gel electrophoresis incorporating a pooled internal standard. Proteomics 2003; 3(1): 36–44.
Alm E, Huang K, Arkin A. The evolution of two-component systems in bacteria reveals different strategies for niche adaptation. PLoS Computational Biology 2006; 2(11): e143.
Arnason S, Thors VS, Guðnason T, Kristinsson KG, Haraldsson A. Bacteraemia in children in Iceland 1994-2005. Acta Paediatrica 2010; 99(10): 1531–5.
Asai K, Ishiwata K, Matsuzaki K, Sadaie Y. A viable Bacillus subtilis strain without functional extracytoplasmic function sigma genes. Journal of Bacteriology 2008; 190(7): 2633–6.
Bae T, Schneewind O. Allelic replacement in Staphylococcus aureus with inducible counter-selection. Plasmid 2006; 55(1): 58–63.
Bagg A, Neilands JB. Mapping of a mutation affecting regulation of iron uptake systems in Escherichia coli K-12. Journal of Bacteriology 1985; 161(1): 450–3.
Bagg A, Neilands JB. Ferric uptake regulation protein acts as a repressor, employing iron (II) as a cofactor to bind the operator of an iron transport operon in Escherichia coli. Biochemistry 1987a; 26(17): 5471–7.
Bagg A, Neilands JB. Molecular mechanism of regulation of siderophore-mediated iron assimilation. Microbiological Reviews 1987b; 51(4): 509–18.
Basheer R, Iordanescu S. The Staphylococcus aureus chromosomal gene plaC, identified by mutations amplifying plasmid pT181, encodes a sigma factor. Nucleic Acids Research 1991; 19(18): 4921–4.
Benson AK, Haldenwang WG. Bacillus subtilis sigmaB is regulated by a binding protein (RsbW) that blocks its association with core RNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1993; 90(6): 2330–4.
Benson DA, Cavanaugh M, Clark K, Karsch-Mizrachi I, Lipman DJ, Ostell J, Sayers EW. GenBank. Nucleic Acids Research 2013; 41(Database issue): D36–42.
Binnie C, Lampe M, Losick R. Gene encoding the sigma 37 species of RNA polymerase sigma factor from Bacillus subtilis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1986; 83(16): 5943–7.
Bischoff M, Dunman P, Kormanec J, Macapagal D, Murphy E, Mounts W, Berger-ba B, Projan S. Microarray-based analysis of the Staphylococcus aureus sigmaB regulon. Journal of Bacteriology 2004; 186(13): 4085–4099.
Boylan SA, Rutherford A, Thomas SM, Price CW. Activation of Bacillus subtilis transcription factor sigma B by a regulatory pathway responsive to stationaryphase signals. Journal of Bacteriology 1992; 174(11): 3695–706.
Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 1976; 72: 248–54.
Bradley AJ, Leach KA, Breen JE, Green LE, Green MJ. Survey of the incidence and aetiology of mastitis on dairy farms in England and Wales. The Veterinary Record 2007; 160(8): 253–7.
Braun V, Mahren S. Transmembrane transcriptional control (surface signalling) of the Escherichia coli Fec type. FEMS Microbiology Reviews 2005; 29(4): 673–84.
Brody MS, Stewart V, Price CW. Bypass suppression analysis maps the signalling pathway within a multidomain protein: the RsbP energy stress phosphatase 2C from Bacillus subtilis. Molecular Microbiology 2009; 72(5): 1221–34.
Bukowski M, Rojowska A, Wladyka B. Prokaryotic toxin-antitoxin systems--the role in bacterial physiology and application in molecular biology. Acta Biochimica Polonica 2011; 58(1): 1–9.
Bukowski M, Lyzen R, Helbin WM, Bonar E, Szalewska-Palasz A, Wegrzyn G, Dubin G, Dubin A, Wladyka B. A regulatory role for Staphylococcus aureus toxinantitoxin system PemIKSa. Nature Communications 2013; 4(May): 2012.
Bukowski M, Polakowska K, Ilczyszyn WM, Sitarska A, Nytko K, Kosecka M, Miedzobrodzki J, Dubin A, Wladyka B. Species determination within Staphylococcus genus by extended PCR-restriction fragment length polymorphism of saoC gene. FEMS Microbiology Letters 2015; 362(1): 1–11.
Butcher BG, Helmann JD. Identification of Bacillus subtilis sigma-dependent genes that provide intrinsic resistance to antimicrobial compounds produced by Bacilli. Molecular Microbiology 2006; 60(3): 765–82.
Calvo RA, Kearns DB. FlgM Is Secreted by the flagellar export apparatus in bacillus subtilis. Journal of Bacteriology 2015; 197(1): 81–91.
Campbell EA, Tupy JL, Gruber TM, Wang S, Sharp MM, Gross CA, Darst SA. Crystal structure of Escherichia coli sigmaE with the cytoplasmic domain of its anti-sigma RseA. Molecular Cell 2003; 11(4): 1067–78.
Cao M, Wang T, Ye R, Helmann JD. Antibiotics that inhibit cell wall biosynthesis induce expression of the Bacillus subtilis sigma(W) and sigma(M) regulons. Molecular Microbiology 2002; 45(5): 1267–76.
Cezairliyan BO, Sauer RT. Inhibition of regulated proteolysis by RseB. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2007; 104(10): 3771–6.
Chaba R, Grigorova IL, Flynn JM, Baker TA, Gross CA. Design principles of the proteolytic cascade governing the sigmaE-mediated envelope stress response in Escherichia coli: keys to graded, buffered, and rapid signal transduction. Genes and Development 2007; 21(1): 124–36.
Chan PF, Foster SJ, Ingham E, Clements MO. The Staphylococcus aureus alternative sigma factor sigma B controls the environmental stress response but not starvation survival or pathogenicity in a mouse abscess model. Journal of Bacteriology 1998; 180(23): 6082–6089.
Charpentier E, Anton AI, Barry P, Alfonso B, Fang Y, Novick RP. Novel cassette-based shuttle vector system for gram-positive bacteria. Applied and Environmental Microbiology 2004; 70(10): 6076–85.
Cheung AL, Koomey JM, Butler CA, Projan SJ, Fischetti VA. Regulation of exoprotein expression in Staphylococcus aureus by a locus (sar) distinct from agr. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1992; 89(14): 6462–6.
Cheung AL, Projan SJ. Cloning and sequencing of sarA of Staphylococcus aureus, a gene required for the expression of agr. Journal of Bacteriology 1994; 176(13): 4168–72.
Cheung AL, Ying P. Regulation of alpha-and beta-hemolysins by the sar locus of Staphylococcus aureus. Journal of Bacteriology 1994; 176(3): 580–5.
Cheung AL, Chien YT, Bayer AS. Hyperproduction of alpha-hemolysin in a sigB mutant is associated with elevated SarA expression in Staphylococcus aureus. Infection and Immunity 1999; 67(3): 1331–7.
Cheung AL, Yang SJ, Bayer AS, Xiong YQ. Disparity in the in vitro versus in vivo regulation of fibronectin-binding proteins by 2 global regulators, saeRS and sigB, in Staphylococcus aureus. The Journal of Infectious Diseases 2009; 200(9): 1371–
4.
Chien Y, Cheung AL. Molecular interactions between two global regulators, sar and agr, in Staphylococcus aureus. The Journal of Biological Chemistry 1998; 273(5): 2645–52.
Claverys JP, Martin B, Polard P. The genetic transformation machinery: composition, localization, and mechanism. FEMS Microbiology Reviews 2009; 33(3): 643–
656.
Collinet B, Yuzawa H, Chen T, Herrera C, Missiakas D. RseB binding to the periplasmic domain of RseA modulates the RseA:sigmaE interaction in the cytoplasm and the availability of sigmaE.RNA polymerase. The Journal of Ciological Chemistry 2000; 275(43): 33898–904.
Cybulski L, Larrieux N, Mendoza D De. Allosteric Activation of Bacterial Response Regulators : the Role of the Cognate Histidine Kinase Beyond Phosphorylation. mBio 2014; 5(6): e02105-14.
Delumeau O, Lewis RJ, Yudkin MD. Protein-protein interactions that regulate the energy stress activation of sigma(B) in Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology 2002; 184(20): 5583–9.
Deora R, Misra TK. Purification and characterization of DNA dependent RNA polymerase from Staphylococcus aureus. Biochemical and Biophysical Research Communications 1995; 208(2): 610–6.
Deora R, Misra TK. Characterization of the primary sigma factor of Staphylococcus aureus. Journal of Biological Chemistry 1996; 271(36): 21828–34.
Deora R, Tseng T, Misra TK. Alternative transcription factor sigmaSB of Staphylococcus aureus: characterization and role in transcription of the global regulatory locus sar. Journal of Bacteriology 1997; 179(20): 6355–9.
Dodd IB, Egan JB. Improved detection of helix-turn-helix DNA-binding motifs in protein sequences. Nucleic Acids Research 1990; 18(17): 5019–26.
Donegan NP, Cheung AL. Regulation of the mazEF toxin-antitoxin module in Staphylococcus aureus and its impact on sigB expression. Journal of Bacteriology 2009; 191(8): 2795–805.
Downie L, Armiento R, Subhi R, Kelly J, Clifford V, Duke T. Community-acquired neonatal and infant sepsis in developing countries: efficacy of WHO’s currently recommended antibiotics--systematic review and meta-analysis. Archives of Disease in Childhood 2013; 98(2): 146–54.
Dufour A, Haldenwang WG. Interactions between a Bacillus subtilis anti-sigma factor (RsbW) and its antagonist (RsbV). Journal of Bacteriology 1994; 176(7): 1813–
20.
Duncan ML, Kalman SS, Thomas SM, Price CW. Gene encoding the 37,000-dalton minor sigma factor of Bacillus subtilis RNA polymerase: isolation, nucleotide sequence, chromosomal locus, and cryptic function. Journal of Bacteriology 1987; 169(2): 771–8.
Edwards AM, Potts JR, Josefsson E, Massey RC. Staphylococcus aureus host cell invasion and virulence in sepsis is facilitated by the multiple repeats within FnBPA. PLoS Pathogens 2010; 6(6): e1000964.
Ellermeier CD, Losick R. Evidence for a novel protease governing regulated intramembrane proteolysis and resistance to antimicrobial peptides in Bacillus subtilis. Genes and Development 2006; 20(14): 1911–22.
Erickson JW, Vaughn V, Walter WA, Neidhardt FC, Gross CA. Regulation of the promoters and transcripts of rpoH, the Escherichia coli heat shock regulatory gene. Genes and Development 1987; 1(5): 419–432.
Ericsson Unnerstad H, Lindberg A, Persson Waller K, Ekman T, Artursson K, Nilsson-Ost M, Bengtsson B. Microbial aetiology of acute clinical mastitis and agentspecific risk factors. Veterinary Microbiology 2009; 137(1-2): 90–7.
Eron L, Block R. Mechanism of initiation and repression of in vitro transcription of the lac operon of Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1971; 68(8): 1828–32.
Everse J, Hsia N. The toxicities of native and modified hemoglobins. Free Radical Biology and Medicine 1997; 22(6): 1075–99.
Fagerlund A, Granum PE, Håvarstein LS. Staphylococcus aureus competence genes: mapping of the SigH, ComK1 and ComK2 regulons by transcriptome sequencing. Molecular Microbiology 2014; 94(3): 557–79.
Faria C, Vaz-Moreira I, Serapicos E, Nunes OC, Manaia CM. Antibiotic resistance in coagulase negative staphylococci isolated from wastewater and drinking water. The Science of the Total Environment 2009; 407(12): 3876–82.
Fluit AC, Carpaij N, Majoor EAM, Bonten MJM, Willems RJL. Shared reservoir of ccrB gene sequences between coagulase-negative staphylococci and methicillinresistant Staphylococcus aureus. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2013; 68(8): 1707–13.
Flynn JM, Levchenko I, Sauer RT, Baker TA. Modulating substrate choice: the SspB adaptor delivers a regulator of the extracytoplasmic-stress response to the AAA+ protease ClpXP for degradation. Genes and Development 2004; 18(18): 2292–
301.
Fraunholz M, Sinha B. Intracellular Staphylococcus aureus: live-in and let die. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology 2012; 2: 43.
Friedman DB, Stauff DL, Pishchany G, Whitwell CW, Torres VJ, Skaar EP. Staphylococcus aureus redirects central metabolism to increase iron availability. PLoS Pathogens 2006; 2(8): e87.
Galibert F, Finan TM, Long SR, Puhler A, Abola P, Ampe F, Barloy-Hubler F, Barnett MJ, Becker A, Boistard P, Bothe G, Boutry M, Bowser L, Buhrmester J, Cadieu E, Capela D, Chain P, Cowie A, Davis RW, Dreano S, Federspiel NA, Fisher RF, Gloux S, Godrie T, Goffeau A, Golding B, Gouzy J, Gurjal M, Hernandez-Lucas I, Hong A, Huizar L, Hyman RW, Jones T, Kahn D, Kahn ML, Kalman S, Keating DH, Kiss E, Komp C, Lelaure V, Masuy D, Palm C, Peck MC, Pohl TM, Portetelle D, Purnelle B, Ramsperger U, Surzycki R, Thebault P, Vandenbol M, Vorholter FJ, Weidner S, Wells DH, Wong K, Yeh KC, Batut J. The composite genome of the legume symbiont Sinorhizobium meliloti. Science (New York, N.Y.) 2001; 293(5530): 668–72.
Gardete S, Wu SW, Gill S, Tomasz A. Role of VraSR in antibiotic resistance and antibiotic-induced stress response in Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2006; 50(10): 3424–34.
George Cisar EA, Geisinger E, Muir TW, Novick RP. Symmetric signalling within asymmetric dimers of the Staphylococcus aureus receptor histidine kinase AgrC. Molecular Microbiology 2009; 74(1): 44–57.
Gertz S, Engelmann S, Schmid R, Ziebandt AK, Tischer K, Scharf C, Hacker J, Hecker
M. Characterization of the sigma(B) regulon in Staphylococcus aureus. Journal of Bacteriology 2000.
Gitt MA, Wang LF, Doi RH. A strong sequence homology exists between the major RNA polymerase sigma factors of Bacillus subtilis and Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry 1985; 260(12): 7178–85.
Gómez-Santos N, Pérez J, Sánchez-Sutil MC, Moraleda-Muñoz A, Muñoz-Dorado J. CorE from Myxococcus xanthus is a copper-dependent RNA polymerase sigma factor. PLoS Genetics 2011; 7(6): e1002106.
Grilli J, Bassetti B, Maslov S, Cosentino Lagomarsino M. Joint scaling laws in functional and evolutionary categories in prokaryotic genomes. Nucleic Acids research 2012; 40(2): 530–40.
Grinberg I, Shteinberg T, Hassan AQ, Aharonowitz Y, Borovok I, Cohen G. Functional analysis of the Streptomyces coelicolor NrdR ATP-cone domain: role in nucleotide binding, oligomerization, and DNA interactions. Journal of Bacteriology 2009; 191(4): 1169–79.
Grossman AD. Genetic networks controlling the initiation of sporulation and the development of genetic competence in Bacillus subtilis. Annual Review of Genetics 1995; 29: 477–508.
Gruber TM, Bryant DA. Molecular systematic studies of eubacteria, using sigma70-type sigma factors of group 1 and group 2. Journal of Bacteriology 1997; 179(5): 1734–47.
Gudiol C, Bodro M, Simonetti A, Tubau F, González-Barca E, Cisnal M, Domingo-Domenech E, Jiménez L, Carratalà J. Changing aetiology, clinical features, antimicrobial resistance, and outcomes of bloodstream infection in neutropenic cancer patients. Clinical microbiology and infection : the official publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases 2013; 19(5): 474–9.
Gvakharia BO, Permina EA, Gelfand MS, Bottomley PJ, Sayavedra-Soto LA, Arp DJ. Global transcriptional response of Nitrosomonas europaea to chloroform and chloromethane. Applied and Environmental Microbiology 2007; 73(10): 3440–5.
Haldenwang WG, Losick R. A modified RNA polymerase transcribes a cloned gene under sporulation control in Bacillus subtilis. Nature 1979; 282(5736): 256–60.
Haldenwang WG, Banner CD, Ollington JF, Losick R, Hoch JA, O’Connor MB, Sonenshein AL. Mapping a cloned gene under sporulation control by inserttion of a drug resistance marker into the Bacillus subtilis chromosome. Journal of Bacteriology 1980; 142(1): 90–8.
Haldenwang WG, Losick R. Novel RNA polymerase sigma factor from Bacillus subtilis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1980; 77(12): 7000–4.
Hamburger V, Hamilton HL. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists 1992; 195(4): 231–72.
Hanahan D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology 1983; 166(4): 557–80.
Hantke K. Regulation of ferric iron transport in Escherichia coli K12: isolation of a constitutive mutant. Molecular and General Genetics : MGG 1981; 182(2): 288–
92.
Hantke K. Cloning of the repressor protein gene of iron-regulated systems in Escherichia coli K12. Molecular and General Genetics : MGG 1984; 197(2): 337–
41.
Heinrich J, Wiegert T. YpdC determines site-1 degradation in regulated intramembrane proteolysis of the RsiW anti-sigma factor of Bacillus subtilis. Molecular Microbiology 2006; 62(2): 566–79.
Heinrich J, Hein K, Wiegert T. Two proteolytic modules are involved in regulated intramembrane proteolysis of Bacillus subtilis RsiW. Molecular Microbiology 2009; 74(6): 1412–26.
Helmann JD, Chamberlin MJ. Structure and function of bacterial sigma factors. Annual Review of Biochemistry 1988; 57: 839–72.
Helmann JD. Compilation and analysis of Bacillus subtilis sigma A-dependent promoter sequences: evidence for extended contact between RNA polymerase and upstream promoter DNA. Nucleic Acids Research 1995; 23(13): 2351–60.
Helmann JD. Deciphering a complex genetic regulatory network: the Bacillus subtilis sigmaW protein and intrinsic resistance to antimicrobial compounds. Science Progress 2006; 89(Pt 3-4): 243–66.
Hiron A, Falord M, Valle J, Débarbouillé M, Msadek T. Bacitracin and nisin resistance in Staphylococcus aureus: a novel pathway involving the BraS/BraR twocomponent system (SA2417/SA2418) and both the BraD/BraE and VraD/VraE ABC transporters. Molecular Microbiology 2011; 81(3): 602–22.
Ho TD, Ellermeier CD. Extra cytoplasmic function σ factor activation. Current Opinion in Microbiology 2012; 15(2): 182–8.
Hong HJ, Paget MSB, Buttner MJ. A signal transduction system in Streptomyces coelicolor that activates the expression of a putative cell wall glycan operon in response to vancomycin and other cell wall-specific antibiotics. Molecular Microbiology 2002; 44(5): 1199–1211.
Huang X, Fredrick KL, Helmann JD. Promoter recognition by Bacillus subtilis sigmaW: autoregulation and partial overlap with the sigmaX regulon. Journal of Bacteriology 1998; 180(15): 3765–70.
Huoi C, Vanhems P, Nicolle MC, Michallet M, Bénet T. Incidence of hospital-acquired pneumonia, bacteraemia and urinary tract infections in patients with haematological malignancies, 2004-2010: a surveillance-based study. PloS One 2013; 8(3): e58121.
Jang MK, Jung MH. ATF3 represses PPARγ expression and inhibits adipocyte differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications 2014; 454(1): 58–64.
Jogler C, Waldmann J, Huang X, Jogler M, Glöckner FO, Mascher T, Kolter R. Identification of proteins likely to be involved in morphogenesis, cell division, and signal transduction in Planctomycetes by comparative genomics. Journal of Bacteriology 2012; 194(23): 6419–30.
Johnston C, Campo N, Bergé MJ, Polard P, Claverys J-P. Streptococcus pneumoniae, le transformiste. Trends in Microbiology 2014; 22(3): 113–9.
Kalman S, Duncan ML, Thomas SM, Price CW. Similar organization of the sigB and spoIIA operons encoding alternate sigma factors of Bacillus subtilis RNA polymerase. Journal of Bacteriology 1990; 172(10): 5575–85.
Kanehara K, Ito K, Akiyama Y. YaeL (EcfE) activates the sigma(E) pathway of stress response through a site-2 cleavage of anti-sigma(E), RseA. Genes and Development 2002; 16(16): 2147–55.
Kanehara K, Ito K, Akiyama Y. YaeL proteolysis of RseA is controlled by the PDZ domain of YaeL and a Gln-rich region of RseA. The EMBO Journal 2003; 22(23): 6389–98.
Kanoksil M, Jatapai A, Peacock SJ, Limmathurotsakul D. Epidemiology, microbiology and mortality associated with community-acquired bacteremia in northeast Thailand: a multicenter surveillance study. PloS One 2013; 8(1): e54714.
Keilty S, Rosenberg M. Constitutive function of a positively regulated promoter reveals new sequences essential for activity. The Journal of Biological Chemistry 1987; 262(13): 6389–95.
Kibenge FS, Robertson MD, Wilcox GE, Pass DA. Bacterial and viral agents associated with tenosynovitis in broiler breeders in Western Australia. Avian Pathology : journal of the W.V.P.A 1982; 11(3): 351–9.
Kim DY, Kwon E, Choi J, Hwang HY, Kim KK. Structural basis for the negative regulation of bacterial stress response by RseB. Protein Science : a publication of the Protein Society 2010; 19(6): 1258–63.
Kingston AW, Subramanian C, Rock CO, Helmann JD. A σW-dependent stress response in Bacillus subtilis that reduces membrane fluidity. Molecular Microbiology 2011; 81(1): 69–79.
Kleerebezem M, Quadri LE, Kuipers OP, de Vos WM. Quorum sensing by peptide pheromones and two-component signal-transduction systems in Gram-positive bacteria. Molecular Microbiology 1997; 24(5): 895–904.
Kolb A, Busby S, Buc H, Garges S, Adhya S. Transcriptional regulation by cAMP and its receptor protein. Annual Review of Biochemistry 1993a; 62: 749–95.
Kolb A, Igarashi K, Ishihama A, Lavigne M, Buckle M, Buc H. E. coli RNA polymerase, deleted in the C-terminal part of its alpha-subunit, interacts differently with the cAMP-CRP complex at the lacP1 and at the galP1 promoter. Nucleic Acids Research 1993b; 21(2): 319–26.
Konstantinidis KT, Tiedje JM. Trends between gene content and genome size in prokaryotic species with larger genomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2004; 101(9): 3160–5.
Van der Kooi-Pol MM, Reilman E, Sibbald MJJB, Veenstra-Kyuchukova YK, Kouwen TRHM, Buist G, van Dijl JM. Requirement of signal peptidase ComC and thioldisulfide oxidoreductase DsbA for optimal cell surface display of pseudopilin ComGC in Staphylococcus aureus. Applied and Environmental Microbiology 2012; 78(19): 7124–7.
Koretke KK, Lupas AN, Warren P V, Rosenberg M, Brown JR. Evolution of twocomponent signal transduction. Molecular Biology and Evolution 2000; 17(12): 1956–70.
Kruppa M, Krom BP, Chauhan N, Bambach AV, Cihlar RL, Calderone RA. The twocomponent signal transduction protein Chk1p regulates quorum sensing in Candida albicans. Eukaryotic Cell 2004; 3(4): 1062–5.
Kullik I, Giachino P. The alternative sigma factor sigmaB in Staphylococcus aureus: regulation of the sigB operon in response to growth phase and heat shock. Archives of Microbiology 1997; 167(2/3): 151–9.
Kullik I, Giachino P, Fuchs T. Deletion of the alternative sigma factor sigmaB in Staphylococcus aureus reveals its function as a global regulator of virulence genes. Journal of Bacteriology 1998; 180(18): 4814–20.
Kumar A, Malloch RA, Fujita N, Smillie DA, Ishihama A, Hayward RS. The minus 35recognition region of Escherichia coli sigma 70 is inessential for initiation of transcription at an “extended minus 10” promoter. Journal of Molecular Biology 1993; 232(2): 406–18.
Kuroda M, Kuroda H, Oshima T, Takeuchi F, Mori H, Hiramatsu K. Two-component system VraSR positively modulates the regulation of cell-wall biosynthesis pathway in Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology 2004; 49(3): 807–
821.
Kutsukake K. Excretion of the anti-sigma factor through a flagellar substructure couples flagellar gene expression with flagellar assembly in Salmonella typhimurium. Molecular and General Genetics : MGG 1994; 243(6): 605–12.
Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970; 227(5259): 680–5.
Lampe M, Binnie C, Schmidt R, Losick R. Cloned gene encoding the delta subunit of Bacillus subtilis RNA polymerase. Gene 1988; 67(1): 13–9.
Larkin MA, Blackshields G, Brown NP, Chenna R, McGettigan PA, McWilliam H, Valentin F, Wallace IM, Wilm A, Lopez R, Thompson JD, Gibson TJ, Higgins DG. Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics 2007; 23(21): 2947–8.
Laurenceau R, Péhau-Arnaudet G, Baconnais S, Gault J, Malosse C, Dujeancourt A, Campo N, Chamot-Rooke J, Le Cam E, Claverys J-P, Fronzes R. A type IV pilus mediates DNA binding during natural transformation in Streptococcus pneumoniae. PLoS Pathogens 2013; 9(6): e1003473.
Levinger O, Bikels-Goshen T, Landau E, Fichman M, Shapira R. Epigallocatechin gallate induces upregulation of the two-component VraSR system by evoking a cell wall stress response in Staphylococcus aureus. Applied and Environmental Microbiology 2012; 78(22): 7954–9.
Lewis M, Chang G, Horton NC, Kercher MA, Pace HC, Schumacher MA, Brennan RG, Lu P. Crystal structure of the lactose operon repressor and its complexes with DNA and inducer. Science 1996; 271(5253): 1247–54.
Li M, Lai Y, Villaruz AE, Cha DJ, Sturdevant DE, Otto M. Gram-positive threecomponent antimicrobial peptide-sensing system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2007.
Li W, Stevenson CEM, Burton N, Jakimowicz P, Paget MSB, Buttner MJ, Lawson DM, Kleanthous C. Identification and structure of the anti-sigma factor-binding domain of the disulphide-stress regulated sigma factor sigma(R) from Streptomyces coelicolor. Journal of Molecular Biology 2002; 323(2): 225–36.
Lina G, Jarraud S, Ji G, Pedraza A, Novick RP, Ea U. Transmembrane topology and histidine protein kinase activity of AgrC, the agr signal receptor in Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology 1998; 28: 655–662.
Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods San Diego Calif 2001; 25(4): 402–408.
Lonetto M, Gribskov M, Gross CA. The sigma 70 family: sequence conservation and evolutionary relationships. Journal of Bacteriology 1992; 174(12): 3843–9.
Lorenz U, Hüttinger C, Schäfer T, Ziebuhr W, Thiede A, Hacker J, Engelmann S, Hecker M, Ohlsen K. The alternative sigma factor sigma B of Staphylococcus aureus modulates virulence in experimental central venous catheter-related infections. Microbes and Infection 2008; 10(3): 217–23.
De Lorenzo V, Wee S, Herrero M, Neilands JB. Operator sequences of the aerobactin operon of plasmid ColV-K30 binding the ferric uptake regulation (fur) repressor. Journal of Bacteriology 1987; 169(6): 2624–30.
Lowder BV, Guinane CM, Ben Zakour NL, Weinert LA, Conway-Morris A, Cartwright RA, Simpson AJ, Rambaut A, Nübel U, Fitzgerald JR. Recent human-to-poultry host jump, adaptation, and pandemic spread of Staphylococcus aureus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2009; 106(46): 19545–50.
Lowder BV, Fitzgerald JR. Human origin for avian pathogenic Staphylococcus aureus. Virulence 2010; 1(4): 283–4.
Luo Y, Helmann JD. Extracytoplasmic function sigma factors with overlapping promoter specificity regulate sublancin production in Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology 2009; 191(15): 4951–8.
Luthander J, Bennet R, Giske CG, Nilsson A, Eriksson M. Age and risk factors influence the microbial aetiology of bloodstream infection in children. Acta Paediatrica 2013; 102(2): 182–6.
Lyon GJ, Novick RP. Peptide signaling in Staphylococcus aureus and other Grampositive bacteria. Peptides 2004; 25(9): 1389–403.
Marijuán PC, Navarro J, del Moral R. On prokaryotic intelligence: strategies for sensing the environment. Bio Systems 2010; 99(2): 94–103.
Mascher T, Hachmann AB, Helmann JD. Regulatory overlap and functional redundancy among Bacillus subtilis extracytoplasmic function sigma factors. Journal of Bacteriology 2007; 189(19): 6919–27.
Mascher T. Signaling diversity and evolution of extracytoplasmic function (ECF) σ factors. Current Opinion in Microbiology 2013; 16(2): 148–155.
Mazmanian SK, Skaar EP, Gaspar AH, Humayun M, Gornicki P, Jelenska J, Joachmiak A, Missiakas DM, Schneewind O. Passage of heme-iron across the envelope of Staphylococcus aureus. Science 2003; 299(5608): 906–9.
McKethan BL, Spiro S. Cooperative and allosterically controlled nucleotide binding regulates the DNA binding activity of NrdR. Molecular Microbiology 2013; 90(2): 278–89.
Mecsas J, Rouviere PE, Erickson JW, Donohue TJ, Gross CA. The activity of sigma E, an Escherichia coli heat-inducible sigma-factor, is modulated by expression of outer membrane proteins. Genes and Development 1993; 7(12B): 2618–28.
Miller HK, Carroll RK, Burda WN, Krute CN, Davenport JE, Shaw LN. The extracytoplasmic function sigma factor σS protects against both intracellular and extracytoplasmic stresses in Staphylococcus aureus. Journal of Bacteriology 2012; 194(16): 4342–54.
Minden JS, Dowd SR, Meyer HE, Stühler K. Difference gel electrophoresis. Electrophoresis 2009; 30 Suppl 1: S156–61.
Missiakas D, Mayer MP, Lemaire M, Georgopoulos C, Raina S. Modulation of the Escherichia coli sigmaE (RpoE) heat-shock transcription-factor activity by the RseA, RseB and RseC proteins. Molecular Microbiology 1997; 24(2): 355–71.
Missiakas D, Raina S. The extracytoplasmic function sigma factors : role and regulation. Molecular Microbiology 1998; 28: 1059–1066.
Mitra S, Zubay G, Landy A. Evidence for the preferential binding of the catabolite gene activator protein (CAP) to DNA containing the promoter. Biochemical and Biophysical Research Communications 1975; 67(3): 857–863.
Mkrtchyan HV, Russell CA, Wang N, Cutler RR. Could public restrooms be an environment for bacterial resistomes? PloS One 2013; 8(1): e54223.
Morikawa K, Inose Y, Okamura H, Maruyama A, Hayashi H, Takeyasu K, Ohta T. A new staphylococcal sigma factor in the conserved gene cassette: functional significance and implication for the evolutionary processes. Genes to Cells 2003; 8(8): 699–712.
Morikawa K, Takemura AJ, Inose Y, Tsai M, Nguyen Thi LT, Ohta T, Msadek T. Expression of a cryptic secondary sigma factor gene unveils natural competence for DNA transformation in Staphylococcus aureus. PLoS Pathogens 2012; 8(11): e1003003.
Nair D, Memmi G, Hernandez D, Bard J, Beaume M, Gill S, Francois P, Cheung AL. Whole-genome sequencing of Staphylococcus aureus strain RN4220, a key laboratory strain used in virulence research, identifies mutations that affect not only virulence factors but also the fitness of the strain. Journal of Bacteriology 2011; 193(9): 2332–5.
Nair SP, Bischoff M, Senn MM, Berger-Bächi B. The σB regulon influences internalization of Staphylococcus aureus by osteoblasts. Infection and Immunity 2003; 71(7): 4167–4170.
Narasimhan G, Bu C, Gao Y, Wang X, Xu N, Mathee K. Mining protein sequences for motifs. Journal of Computational Biology 2002; 9(5): 707–20.
Nicholas RO, Li T, McDevitt D, Marra A, Sucoloski S, Demarsh PL, Gentry DR. Isolation and characterization of a sigB deletion mutant of Staphylococcus aureus. Infection and Immunity 1999; 67(7): 3667–9.
Van Nimwegen E. Scaling laws in the functional content of genomes. Trends in Genetics : TIG 2003; 19(9): 479–84.
Ninfa AJ, Magasanik B. Covalent modification of the glnG product, NRI, by the glnL product, NRII, regulates the transcription of the glnALG operon in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1986; 83(16): 5909–13.
Nixon BT, Ronson CW, Ausubel FM. Two-component regulatory systems responsive to environmental stimuli share strongly conserved domains with the nitrogen assimilation regulatory genes ntrB and ntrC. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1986; 83(20): 7850–4.
Novick RP, Geisinger E. Quorum sensing in staphylococci. Annual Review of Genetics 2008; 42: 541–64.
Ogura M, Hashimoto H, Tanaka T. Med, a cell-surface localized protein regulating a competence transcription factor gene, comK, in Bacillus subtilis. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 2002a; 66(4): 892–6.
Ogura M, Yamaguchi H, Kobayashi K, Ogasawara N, Fujita Y, Tanaka T. Wholegenome analysis of genes regulated by the Bacillus subtilis competence transcription factor ComK. Journal of Bacteriology 2002b; 184(9): 2344–51.
Ortiz de Orué Lucana D, Groves MR. The three-component signalling system HbpS-SenS-SenR as an example of a redox sensing pathway in bacteria. Amino Acids 2009; 37(3): 479–86.
Paget MS, Leibovitz E, Buttner MJ. A putative two-component signal transduction system regulates sigmaE, a sigma factor required for normal cell wall integrity in Streptomyces coelicolor A3(2). Molecular Microbiology 1999; 33(1): 97–107.
Pané-Farré J, Jonas B, Förstner K, Engelmann S, Hecker M. The sigmaB regulon in Staphylococcus aureus and its regulation. International Journal of Medical Microbiology : IJMM 2006; 296(4-5): 237–58.
Pané-Farré J, Jonas B, Hardwick SW, Gronau K, Lewis RJ, Hecker M, Engelmann S. Role of RsbU in controlling SigB activity in Staphylococcus aureus following alkaline stress. Journal of Bacteriology 2009; 191(8): 2561–73.
Parkinson JS, Kofoid EC. Communication modules in bacterial signaling proteins. Annual Review of Genetics 1992; 26: 71–112.
Pátek M, Eikmanns BJ, Pátek J, Sahm H. Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif. Microbiology 1996; 142(Pt 5): 1297–309.
Peng H, Novick RP, Kreiswirth B, Kornblum J, Schlievert P. Cloning, Characterization, and sequencing of an accessory gene regulator (agr) in Staphylococcus aureus. Journal of Bacteriology 1988; 170(9).
Pero J, Nelson J, Fox TD. Highly asymmetric transcription by RNA polymerase containing phage-SP01-induced polypeptides and a new host protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1975; 72(4): 1589–93.
Pförtner H, Burian MS, Michalik S, Depke M, Hildebrandt P, Dhople VM, Pané-Farré J, Hecker M, Schmidt F, Völker U. Activation of the alternative sigma factor SigB of Staphylococcus aureus following internalization by epithelial cells -an in vivo proteomics perspective. International Journal of Medical Microbiology : IJMM 2014; 304(2): 177–87.
Pietiäinen M, Gardemeister M, Mecklin M, Leskelä S, Sarvas M, Kontinen VP. Cationic antimicrobial peptides elicit a complex stress response in Bacillus subtilis that involves ECF-type sigma factors and two-component signal transduction systems. Microbiology 2005; 151(Pt 5): 1577–92.
Pietiäinen M, François P, Hyyryläinen H-L, Tangomo M, Sass V, Sahl H-G, Schrenzel J, Kontinen VP. Transcriptome analysis of the responses of Staphylococcus aureus to antimicrobial peptides and characterization of the roles of vraDE and vraSR in antimicrobial resistance. BMC Genomics 2009; 10: 429.
Polakowska K, Lis MW, Helbin WM, Dubin G, Dubin A, Niedziolka JW, Miedzobrodzki J, Wladyka B. The virulence of Staphylococcus aureus correlates with strain genotype in a chicken embryo model but not a nematode model. Microbes and Infection; 14(14): 1352–62.
Pragman AA, Yarwood JM, Tripp TJ, Schlievert PM. Characterization of virulence factor regulation by SrrAB, a two-component system in Staphylococcus aureus. Journal of Bacteriology 2004; 186: 2430–2438.
Prax M, Lee CY, Bertram R. An update on the molecular genetics toolbox for staphylococci. Microbiology 2013; 159(Pt 3): 421–35.
Rabatinová A, Šanderová H, Jirát Matějčková J, Korelusová J, Sojka L, Barvík I,Papoušková V, Sklenár V, Žídek L, Krásný L. The δ subunit of RNA polymerase is required for rapid changes in gene expression and competitive fitness of the cell. Journal of Bacteriology 2013; 195(11): 2603–11.
Rao L, Karls RK, Betley MJ. In vitro transcription of pathogenesis-related genes by purified RNA polymerase from Staphylococcus aureus. Journal of Bacteriology 1995; 177(10): 2609–14.
Recsei P, Kreiswirth B, O’Reilly M, Schlievert P, Gruss A, Novick RP. Regulation of exoprotein gene expression in Staphylococcus aureus by agar. Molecular and General Genetics : MGG 1986; 202(1): 58–61.
Roberts MC, Soge OO, Horst JA, Ly KA, Milgrom P. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus from dental school clinic surfaces and students. American Journal of Infection Control 2011; 39(8): 628–32.
Rodionov DA, Gelfand MS. Identification of a bacterial regulatory system for ribonucleotide reductases by phylogenetic profiling. Trends in Genetics : TIG 2005; 21(7): 385–9.
Sass P, Jansen A, Szekat C, Sass V, Sahl HG, Bierbaum G. The lantibiotic mersacidin is a strong inducer of the cell wall stress response of Staphylococcus aureus. BMC Microbiology 2008; 8: 186.
Schägger H, von Jagow G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Analytical Biochemistry 1987; 166(2): 368–79.
Schöbel S, Zellmeier S, Schumann W, Wiegert T. The Bacillus subtilis sigmaW antisigma factor RsiW is degraded by intramembrane proteolysis through YluC. Molecular Microbiology 2004; 52(4): 1091–105.
Sekine S, Tagami S, Yokoyama S. Structural basis of transcription by bacterial and eukaryotic RNA polymerases. Current Opinion in Structural Biology 2012; 22(1): 110–8.
Senn MM, Giachino P, Homerova D, Steinhuber A, Strassner J, Kormanec J, Flu U, Berger-ba B, Bischoff M. Molecular analysis and organization of the sigmaB operon in Staphylococcus aureus. Journal of Bacteriology 2005; 187(23): 8006– 8019.
Shaw LN, Lindholm C, Prajsnar TK, Miller HK, Brown MC, Golonka E, Stewart GC, Tarkowski A, Potempa J. Identification and characterization of sigma, a novel component of the Staphylococcus aureus stress and virulence responses. PloS One 2008; 3(12): e3844.
Shevchenko A, Wilm M, Vorm O, Mann M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Analytical Chemistry 1996; 68(5): 850–8.
Sievers F, Wilm A, Dineen D, Gibson TJ, Karplus K, Li W, Lopez R, McWilliam H, Remmert M, Söding J, Thompson JD, Higgins DG. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Molecular Systems Biology 2011; 7(1): 539.
Van Sinderen D, Luttinger A, Kong L, Dubnau D, Venema G, Hamoen L. comK encodes the competence transcription factor, the key regulatory protein for competence development in Bacillus subtilis. Molecular Microbiology 1995; 15(3): 455–62.
Skaar EP, Schneewind O. Iron-regulated surface determinants (Isd) of Staphylococcus aureus: stealing iron from heme. Microbes and Infection; 6(4): 390–7.
Solovyev V, Salamov A. Automatic annotation of microbial genomes and metagenomic sequences. In R. Li, ed. Metagenomics and its Applications in Agriculture, Biomedicine and Environmental Studies. 2011; Nova Science Publishers, pp. 61–
78.
Soltesz L, Mardh P. Lethal effect of Staphylococcus aureus in embryoneted hen’s eggs inhibited by coagulase-negative Staphylococci. In P. A. Mardh and K. H. Schleifer, eds. Coagulase-negative Staphylococci. 1987; Almqvist and Wiksell International, pp. 75–83.
Staal M, Meysman FJR, Stal LJ. Temperature excludes N2-fixing heterocystous cyanobacteria in the tropical oceans. Nature 2003; 425(6957): 504–7.
Staroń A, Sofia HJ, Dietrich S, Ulrich LE, Liesegang H, Mascher T. The third pillar of bacterial signal transduction: classification of the extracytoplasmic function (ECF) sigma factor protein family. Molecular Microbiology 2009; 74(3): 557–81.
Stock J, Da Re S. Signal transduction: Response regulators on and off. Current Biology 2000; 10(11): R420–R424.
Strickland MS, Thompson NE, Burgess RR. Structure and function of the sigma-70 subunit of Escherichia coli RNA polymerase. Monoclonal antibodies: localization of epitopes by peptide mapping and effects on transcription. Biochemistry 1988; 27(15): 5755–62.
Suntharalingam P, Senadheera MD, Mair RW, Lévesque CM, Cvitkovitch DG. The LiaFSR system regulates the cell envelope stress response in Streptococcus mutans. Journal of Bacteriology 2009; 191(9): 2973–84.
Timms JF, Cramer R. Difference gel electrophoresis. Proteomics 2008; 8(23-24): 4886–
97.
Torres VJ, Pishchany G, Humayun M, Schneewind O, Skaar EP. Staphylococcus aureus IsdB is a hemoglobin receptor required for heme iron utilization. Journal of Bacteriology 2006; 188(24): 8421–9.
Torres VJ, Stauff DL, Pishchany G, Bezbradica JS, Gordy LE, Iturregui J, Anderson KL, Dunman PM, Joyce S, Skaar EP. A Staphylococcus aureus regulatory system that responds to host heme and modulates virulence. Cell Host and Microbe 2007; 1(2): 109–19.
Troxell B, Hassan HM. Transcriptional regulation by Ferric Uptake Regulator (Fur) in pathogenic bacteria. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology 2013; 3(October): 59.
Turner MS, Helmann JD. Mutations in multidrug efflux homologs, sugar isomerases, and antimicrobial biosynthesis genes differentially elevate activity of the sigma(X) and sigma(W) factors in Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology 2000; 182(18): 5202–10.
Uhlemann AC, Knox J, Miller M, Hafer C, Vasquez G, Ryan M, Vavagiakis P, Shi Q, Lowy FD. The environment as an unrecognized reservoir for communityassociated methicillin resistant Staphylococcus aureus USA300: a case-control study. PloS One 2011; 6(7): e22407.
Ulrich LE, Koonin EV, Zhulin IB. One-component systems dominate signal transduction in prokaryotes. Trends in Microbiology 2005; 13(2): 52–6.
Vijay K, Brody MS, Fredlund E, Price CW. A PP2C phosphatase containing a PAS domain is required to convey signals of energy stress to the sigmaB transcription factor of Bacillus subtilis. Molecular Microbiology 2000; 35(1): 180–8.
Voelker U, Dufour A, Haldenwang WG. The Bacillus subtilis rsbU gene product is necessary for RsbX-dependent regulation of sigma B. Journal of Bacteriology 1995a; 177(1): 114–22.
Voelker U, Voelker A, Maul B, Hecker M, Dufour A, Haldenwang WG. Separate mechanisms activate sigma B of Bacillus subtilis in response to environmental and metabolic stresses. Journal of Bacteriology 1995b; 177(13): 3771–80.
Voelker U, Voelker A, Haldenwang WG. Reactivation of the Bacillus subtilis anti-sigma B antagonist, RsbV, by stress-or starvation-induced phosphatase activities. Journal of Bacteriology 1996a; 178(18): 5456–63.
Voelker U, Voelker A, Haldenwang WG. The yeast two-hybrid system detects interactions between Bacillus subtilis sigmaB regulators. Journal of Bacteriology 1996b; 178(23): 7020–3.
Wahab NA, Parker S, Sraer JD, Mason RM. The decorin high glucose response element and mechanism of its activation in human mesangial cells. Journal of the American Society of Nephrology : JASN 2000; 11(9): 1607–19.
Walsh NP, Alba BM, Bose B, Gross CA, Sauer RT. OMP peptide signals initiate the envelope-stress response by activating DegS protease via relief of inhibition mediated by its PDZ domain. Cell 2003; 113(1): 61–71.
Wecke T, Halang P, Staroń A, Dufour YS, Donohue TJ, Mascher T. Extracytoplasmic function σ factors of the widely distributed group ECF41 contain a fused regulatory domain. Microbiology Open 2012; 1(2): 194–213.
Weiss A, Ibarra JA, Paoletti J, Carroll RK, Shaw LN. The δ subunit of RNA polymerase guides promoter selectivity and virulence in Staphylococcus aureus. Infection and Immunity 2014; 82(4): 1424–35.
Wiegert T, Homuth G, Versteeg S, Schumann W. Alkaline shock induces the Bacillus subtilis sigma(W) regulon. Molecular microbiology 2001; 41(1): 59–71.
Wilken C, Kitzing K, Kurzbauer R, Ehrmann M, Clausen T. Crystal structure of the DegS stress sensor: How a PDZ domain recognizes misfolded protein and activates a protease. Cell 2004; 117(4): 483–94.
Wilks JC, Kitko RD, Cleeton SH, Lee GE, Ugwu CS, Jones BD, BonDurant SS, Slonczewski JL. Acid and base stress and transcriptomic responses in Bacillus subtilis. Applied and Environmental Microbiology 2009; 75(4): 981–90.
Wise AA, Price CW. Four additional genes in the sigB operon of Bacillus subtilis that control activity of the general stress factor sigma B in response to environmental signals. Journal of Bacteriology 1995; 177(1): 123–33.
Wösten MM. Eubacterial sigma-factors. FEMS Microbiology Reviews 1998; 22(3): 127–50.
Wu S. Sigma-B, a putative operon encoding alternate sigma factor of Staphylococcus aureus RNA polymerase : molecular cloning and DNA sequencing. Journal of Bacteriology 1996.
Yarwood JM, Cormick JKMC, Schlievert PM. Identification of a novel two-component regulatory system that acts in global regulation of virulence factors of Staphylococcus aureus. 2001; 183(4): 1113–1123.
Yin S, Daum RS, Boyle-Vavra S. VraSR two-component regulatory system and its role in induction of pbp2 and vraSR expression by cell wall antimicrobials in Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2006; 50(1): 336–43.
Yoshimura M, Asai K, Sadaie Y, Yoshikawa H. Interaction of Bacillus subtilis extracytoplasmic function (ECF) sigma factors with the N-terminal regions of their potential anti-sigma factors. Microbiology 2004; 150(Pt 3): 591–9.
Zellmeier S, Schumann W, Wiegert T. Involvement of Clp protease activity in modulating the Bacillus subtilissigmaw stress response. Molecular Microbiology 2006; 61(6): 1569–82.
Zeng L, Das S, Burne RA. Genetic analysis of the functions and interactions of components of the LevQRST signal transduction complex of Streptococcus mutans. PloS One 2011; 6(2): e17335.
Zhu L, Inoue K, Yoshizumi S, Kobayashi H, Zhang Y, Ouyang M, Kato F, Sugai M, Inouye M. Staphylococcus aureus MazF specifically cleaves a pentad sequence, UACAU, which is unusually abundant in the mRNA for pathogenic adhesive factor SraP. Journal of Bacteriology 2009; 191(10): 3248–55.
11. ZASOBY INTERNETOWE I PROGRAMY
11.1. Bazy danych
GenBank – wersja 205.0, baza danych wszystkich publicznie dostępnych sekwencji DNA genów, National Center for Biotechnology Information (Benson i in. 2013), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank,
Protein Data Bank – wersja December 2014, baza danych eksperymentalnie określonych struktur przestrzennych białek, kwasów nukleinowych i biologicznie aktywnych struktur, Research Collaboratory for Structural Bioinformatics, 2014, http://www.pdb.org,
UniProtKB – wersja 2015_01, baza danych sekwencji białkowych wraz z rozbudowanym systemem informacji na ich temat, UniProt Consortium, 2015, http://www.uniprot.org.
11.2. Programy
BLAST+ – wersja 2.2.30, program do wyszukiwania lokalnego podobieństwa sekwencji białek i kwasów nukleinowych umożliwiający porzeszukiwanie sekwencji bazy danych GenBank, National Center for Biotechnology Information, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov,
BPROM – program do wyszukiwania miejsc promotorowych w genomach bakterii, http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=bprom,
CLC MainWorkbench – wersja 7.0.2, wielozadaniowy program do zarządzania, przetwarzania i podstawowej analizy sekwencji biologicznych, CLC Bio, 2014.
ClustalO – wersja 1.2.1, narzędzie do konstruowania dopasowań wielosekwencyjnych (Sievers i in. 2011), http://www.clustal.org/,
ClustalW – wersja 2.0, narzędzie do konstruowania dopasowań wielosekwencyjnych (Larkin i in. 2007), http://www.clustal.org/,
GYM – wersja 2.0, program do wyszukiwania motywów HTH w sekwencjach białkowych (Narasimhan i in. 2002),
Helix-turn-Helix Motif Prediction – program do wyszukiwania motywów HTH w sekwencjach białkowych (Dodd i Egan 1990), https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_hth.html
IPython – wersja 2.7.3, tekstowa konsola do języka python o rozszerzonych funkcjach wraz z graficzym interfejscem IPython Notebook, http://www.ipython.org/,
PyMol – wersja 1.4.1, program do wizualizacji modeli przestrzenych białek, DeLano Scientific LLC, 2014, http://www.pymol.org.
11.3. Biblioteki dedykowane do biologii obliczeniowej
Biopython – wersja 1.58, biblioteka dla języka python implementująca wiele podstawowych algorytmów przetwarzania i analizy sekwencji biologicznych oraz umożliwiających zdalne korzystanie m.in. z bazy GenBank oraz narzędzi takich jak NCBI Blast, http://www.biopython.org/,
matplotlib – wersja 1.1.1rc, biblioteka dla języka python służąca przetwarzaniu danych na potrzeby przygotowania wysokiej jakości wykresów, http://www.matplotlib.org/,
numpy – wersja 1.6.1, obszerna biblioteka dla języka python przeznaczona do naukowego przetwarzania danych, http://www.numpy.org/.