Rozprawa doktorska Synteza innowacyjnych małocząsteczkowych modulatorów immunosupresyjnego szlaku adenozyny mgr Mateusz Świrski Promotor: dr hab. Dariusz Cież Promotor pomocniczy: dr Michał Gałęzowski Praca została wykonana w Zespole Chemii Związków Heterocyklicznych i Metaloorganicznych Wydział Chemii UJ Ryvu Therapeutics Kraków 2021 SPIS TREŚCI STRESZCZENIE ....................................................................................................................... 7 ABSTRACT ............................................................................................................................... 9 WYKAZ PUBLIKACJI I WYSTĄPIEŃ KONFERENCYJNYCH ........................................ 11 CEL PRACY ............................................................................................................................ 15 1 WSTĘP LITERATUROWY ................................................................................. 17 1.1 Immunoonkologia .................................................................................................. 17 1.2 Immunosupresyjna rola adenozyny ....................................................................... 18 1.3 Badania kliniczne................................................................................................... 20 1.4 Antagoniści receptora A2A ..................................................................................... 21 1.4.1 Ksantynowi antagoniści A2AR ............................................................................... 21 1.4.2 Nieksantynowi antagoniści A2AR .......................................................................... 24 1.5 Inhibitory CD73 ..................................................................................................... 41 1.5.1 Nukleotydowe inhibitory CD73 ............................................................................ 41 1.5.2 Nienukleotydowe inhibitory CD73........................................................................ 47 1.5.3 Inhibitory CD39 ..................................................................................................... 62 2 BADANIA WŁASNE ........................................................................................... 65 2.1 Synteza inhibitorów CD73 .................................................................................... 65 2.1.1 Modyfikacja salicylamidów................................................................................... 70 2.1.2 Makrocyklizacja salicylamidów ............................................................................ 84 2.1.3 Modyfikacja benzotiadiazyn .................................................................................. 90 2.2 Eksperyment HTS .................................................................................................. 97 2.3 Synteza antagonistów A2AR .................................................................................. 99 PODSUMOWANIE ............................................................................................................... 111 3 CZĘŚĆ PREPARATYWNA ............................................................................... 113 3.1 Synteza referencyjnych inhibitorów CD73 ......................................................... 113 3.2 Synteza salicylamidowych inhibitorów CD73 .................................................... 119 3.3 Synteza makrocyklicznych salicylamidów .......................................................... 141 3.4 Synteza benzotiadiazynowych inhibitorów CD73............................................... 145 3.5 Resynteza związków z HTS ................................................................................ 156 3.6 Synteza antagonistów A2AR ................................................................................ 159 4 LITERATURA .................................................................................................... 175 STRESZCZENIE Badania zrealizowane w ramach pracy doktorskiej dotyczą opracowania nowej generacji związków modulujących immunosupresyjny szlak adenozyny. Główny cel stanowiło odkrycie patentowalnych substancji o zastosowaniu terapeutycznym w immunoonkologii. Liczne artykuły naukowe wskazują, że adenozyna odgrywa kluczową rolę w unikaniu odpowiedzi immunologicznej przez nowotwory[1–4]. Osłabienie działania adenozyny w mikrośrodowisku guza można osiągnąć przez blokadę receptorów A2AR i A2BR lub inhibicję enzymów szlaku metabolicznego produkującego adenozynę: CD73 i CD39. Przeprowadzone badania skupiały się na projektowaniu i syntezie ligandów działających na wspomniane cele w oparciu o analizę literatury, dotychczasowe doświadczenie zgromadzone w Ryvu Therapeutics oraz wyniki eksperymentu HTS. Pierwsza część pracy dotyczyła opracowania nowych inhibitorów CD73 poprzez modyfikację znanych sulfonamidów opartych o układy salicylamidu lub benzotiadiazyny. Dla obu z nich wykonano szczegółową analizę SAR. Dla jednego z nowych ligandów otrzymano strukturę krystaliczną kompleksu z CD73. Najaktywniejsze substancje należały do nieznanego w literaturze chemotypu. Zakończeniem wątku związanego z inhibicją CD73 była synteza makrocyklicznego liganda, który niestety okazał się nieaktywny. Druga część projektu dotyczyła walidacji wyników eksperymentu HTS komercyjnej biblioteki substancji. Wykonano resyntezę ligandów, które dały pozytywne wyniki w HTS. Przeprowadzone doświadczenia wykazały, że rezultaty dla zakupionych związków były fałszywe ze względu na obecność zanieczyszczeń. Ostatnia część badań skupiała się na optymalizacji odkrytego w Ryvu antagonisty A2AR/A2BR. Wykonano systematyczną analizę SAR, która doprowadziła do syntezy cząsteczki selektywnej względem A1R. Potencjał terapeutyczny liganda potwierdzono w eksperymentach in vitro oraz in vivo. Substancja wykazała lepsze działanie w porównaniu do związków testowanych klinicznie. Opracowane związki ujęto w dwóch zgłoszeniach patentowych złożonych przez Ryvu. ABSTRACT Adenosine is the important messenger molecule that is involved in signal transmission in central nervous, cardiovascular and immune systems. The accumulation of extracellular adenosine in the tumor microenvironment is a critical mechanism exploited by tumors to escape immune surveillance. Multiple studies have contributed to establish CD73, CD39 and A2A/A2B receptors as the most relevant targets to hit in the aim of preventing adenosine-mediated suppression of anti-tumor immunity [1–4]. The main goal of the project was a discovery of novel small molecules which may be patented and used in immuno-oncology. The first part of the research was focused on a design of new CD73 inhibitors derived from structures of known salicylamides and benzothiadiazines. Detailed SAR analysis resulted in an identification of novel chemotype active against CD73. In order to understand the crucial interactions between the protein and the inhibitor, crystal structure of the complex of CD73 with the representative ligand from the new series was obtained. That part of the project was concluded by synthesis of the macrocyclic compound which unfortunately turned out to be inactive. The second part was focused on validation of results of HTS assay of the commercial library. Identified CD73 and CD39 inhibitors were resynthesised and tested against target proteins. Performed experiments proved that initial set of results was falsely positive due to presence of impurities in the purchased samples. The final stage of the project was devoted to development of a novel series of A2AR/A2BR antagonists based on the structure of compound discovered by Ryvu Therapeutics. Comprehensive SAR analysis led to synthesis of the antagonist with improved selectivity profile. Therapeutic potential of the compound was evaluated in vitro and in vivo. The experiments showed an improved pharmacological profile in comparison to the A2AR antagonists currently tested in clinical trials. Newly synthesized compounds were described in two patent applications filed by Ryvu Therapeutics. WYKAZ PUBLIKACJI I WYSTĄPIEŃ KONFERENCYJNYCH Wyniki przedstawione w niniejszej pracy doktorskiej zostały opisane w patentach: 1. Bobowska, A.; Gałęzowski, M.; Nowak, M.; Commandeur, C.; Szeremeta-Spisak, J.; Nowogródzki, M.; Obara, A.; Dziełak, A.; Łozińska, I.; Dudek, M.; Janiga, A.; Reus, J.; Wronowski, M.; Zastawna, M.; Radzimierski, A.; Świrski, M.; Zachmann, J.; Fabritius, C.-H.; Porter, R. A.; Fogt, J. Imidazo[1,2-a]pyrazine Modulators of the Adenosine A2a Receptor 2019, WO2019002606A1. 2. Bobowska, A.; Gałęzowski, M.; Szeremeta-Spisak, J.; Nowogródzki, M.; Obara, A.; Łozińska-Raj, I.; Dudek, M.; Janiga, A.; Reus, J.; Wronowski, M.; Zastawna, M.; Fabritius, C.-H.; Rajda, A.; Porter, R. A.; Wyrębek, P.; Świrski, M.; Stasi, L. Modulators of the Adenosine A2a Receptor 2020, WO2020128036A1. Dodatkowy dorobek autora nie wchodzący w zakres rozprawy doktorskiej: 1. Orzeł, Ł.; Rutkowska-Żbik, D.; Świrski, M.; Stochel, G. J. Coord. Chem. 2018, 71, 1837-1851; DOI: 10.1080/00958972.2018.1484915. Wykaz wystąpień konferencyjnych: 1. VI 2019 – XXXIX European School of Medicinal Chemistry (ESMEC); Urbino, Włochy, Prezentacja w formie posteru (nagrodzona przez Reaction Chemistry & Engineering): Novel Dual A2a A2b Adenosine Receptor Antagonists for Cancer Immunotherapy: In Vitro and In Vivo Characterization. WYKAZ SKRÓTÓW: 1,5-COD – 1,5-cyklooktadien AxR – receptory adenozynowe Ac – acetyl ACN – acetonitryl AcOH – kwas octowy ADME – absorpcja, dystrybucja, metabolizm, wydzielanie ADO – adenozyna AmPhos - (4-dimetyloaminofenylo)di-tert-butylofosfina API – aktywny składnik farmaceutyczny B2Pin2 – bis(pinakolato)diboran Bn – benzyl BOP – heksafluorofosforan (benzotriazol-1-yloksy)tris(dimetyloamino)fosfoniowy BSA – N,O-bis(trimetylosililo)acetamid Bu – butyl CDI – N, N'-karbonylodiimidazol CSI – Izocyjanian chlorosulfonylu DBU – 1,8-diazabicyklo [5.4.0]undek-7-en DCC – N,N′-dicykloheksylokarbodiimid DCE – 1,2-dichloroetan DCM – dichlorometan DHP – dihydropiran DIC – N,N′-diizopropylokarbodiimid DIPEA – N,N-diizopropyloetyloamina DMA – N,N-dimetyloacetamid DMAP – 4-dimetyloaminopirydyna DME – 1,2-dimetoksyetan DMF – N,N-dimetyloformamid DMSO – dimetylosulfotlenek DPPA – azydek difenylofosforylu EDC – chlorowodorek 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo) karbodiimidu Et – etyl EtOAc – octan etylu FCC – chromatografia flash HATU – heksafluorofosforan O-(7-azabenzotriazolo-1-ylo)-N,N,N',N'-tetrametylouroniowy HMDS –heksametylodisilazan HOBt – 1-hydroksybenzotriazol ICI – inhibitor punktów kontrolnych i-Pr – izopropyl t-Bu – tert-butyl LAH – glinowodorek litu LLE – wydajność lipofilowa mAb – przeciwciało monoklonalne m-CPBA – kwas m-chloronadbenzoesowy MDSC – mieloidalne komórki supresorowe Me – metyl Ms – mesyl MTBE – eter tert-butylowo-metylowy NBS – N-bromosukcynoimid NCS – N-chlorosukcynoimid NMP – N-metylo-2-pirolidon OTf – trifluorometanosulfonian dppf – 1,1'-bis(difenylofosfino)ferrocen dtbpf – 1,1′-bis(di-tert-butylofosfino) ferrocen Ph – fenyl dba – dibenzylidenoaceton PTP – pirazolo-triazolo-pirymidyna p-TsOH – kwas p-toluenosulfonowy PyBOP – heksafluorofosfonian (benzotriazol-1-iloksy) tripirolidynofosfoniowy RP-HPLC – HPLC w odwróconym układzie faz RT – temperatura pokojowa SAR – zależność struktura-aktywność TBAF –fluorek tetrabutyloamoniowy TBTU –tetrafluoroboran 2-(1H-benzotriazol-1-ilo)-1,1,3,3- tetrametylouroniowy TEA –trietyloamina TFA – kwas trifluorooctowy THF – tetrahydrofuran THP – tetrahydropiran TIPS – grupa tri(izopropylo)sililowa TMS – grupa trimetylosililowa Tos – tosyl XantPhos – 4,5-bis(difenylofosfino)-9,9-dimetyloksanten CEL PRACY Celem moich badań było opracowanie nowej generacji małocząsteczkowych ligandów o potencjalnym zastosowaniu terapeutycznym w immunoonkologii. Bazując na aktualnym stanie wiedzy i doświadczeniu Ryvu Therapeutics postanowiłem skupić się na syntezie związków działających na trzy cele związane z adenozyną. W ostatnich latach terapie wykorzystujące przeciwciała monoklonalne blokujące sygnały pochodzące z punktów kontrolnych układu odpornościowego zrewolucjonizowały leczenie nowotworów. Niestety w wielu przypadkach nowotwory wykazują odporność na wspomniane leki. Wynika stąd potrzeba poszukiwania innych mechanizmów hamowania ich rozwoju. Jednym z potencjalnych celów terapeutycznym jest modulacja immunosupresyjnego szlaku adenozyny. Liczne badania wskazują, że wysokie stężenie adenozyny w mikrośrodowisku guza odgrywa kluczową rolę w unikaniu odpowiedzi immunologicznej przez nowotwory[1–4]. Najbardziej obiecujące strategie terapeutyczne polegają na blokadzie receptorów: A2AR i A2BR lub inhibicji enzymów szlaku metabolicznego produkującego adenozynę: CD73 i CD39. Prowadzone są badania kliniczne leków oddziaływujących na wspomniane cele biologiczne jako monoterapie, w połączeniu z przeciwciałami monoklonalnymi lub chemioterapeutykami. Celem moich eksperymentów było odkrycie inhibitorów CD73 i CD39 o większym potencjale terapeutycznym niż obecnie testowane klinicznie nukleotydomimetyki lub przeciwciała monoklonalne. Większość badanych klinicznie antagonistów A2AR zaprojektowana została jako leki na schorzenia neurologiczne. Wynikają stąd liczne skutki uboczne związane z przekraczaniem bariery krew-mózg. Postanowiłem szczegółowo przebadać zależność pomiędzy strukturą i aktywnością dla odkrytego w Ryvu antagonisty A2AR, który pozbawiony był tego niepożądanego działania. 1 WSTĘP LITERATUROWY 1.1 Immunoonkologia Rak jest jedną z wiodących przyczyn śmierci na świecie. W 2020 roku odnotowano ok. 19 mln nowych przypadków zachorowań oraz prawie 10 mln zgonów wywołanych przez choroby nowotworowe[5]. System obronny organizmu wyposażony jest w mechanizmy umożliwiające zwalczanie komórek nowotworowych przez np. cytotoksyczne limfocyty T lub komórki NK. Niestety w wielu przypadkach są one niewystarczające do wyeliminowania choroby, ponieważ nowotwory w czasie rozwoju uzyskują autonomię dzięki tworzeniu licznych wyspecjalizowanych komórek oraz połączeń z organizmem gospodarza. W ten sposób nabywają zdolność wytwarzania własnych sygnałów wzrostowych, oporność na egzogenne inhibitory wzrostu oraz apoptozę, możliwość ucieczki spod nadzoru immunologicznego, czy nieograniczony potencjał replikacyjny[6]. Komórki nowotworu złośliwego mogą wpływać na otaczające je prawidłowe komórki śródbłonkowe, fibroblasty, makrofagi, granulocyty, komórki tuczne i naczynia krwionośne, tworząc z nimi tzw. mikrośrodowisko guza[7]. Bierze ono udział w dwóch związanych ze sobą procesach: hamowaniu odpowiedzi immunologicznej (immunosupresji) oraz w powstawaniu naczyń krwionośnych (angiogenezie)[8]. Nowotwory wykorzystują ścieżki immunosupresyjne, które są częścią standardowej aktywności układu odpornościowego utrzymującego homeostazę w organizmie np. podczas zapobiegania reakcji autoimmunologicznej w czasie infekcji lub kontuzji. Odpowiedzialne są za to m.in. limfocyty regulatorowe (Treg) oraz mieloidalne komórki supresorowe (MDSC), które występują w zwiększonej ilości w mikrośrodowisku guza[9]. Odkrycie mechanizmów wykorzystywanych przez nowotwory do unikania nadzoru układu odpornościowego umożliwiło opracowanie całkiem nowego podejścia do leczenia. Klasyczny arsenał walki z rakiem – chirurgia, radioterapia, chemioterapia, terapia celowana został rozszerzony o immunoterapię. Jest to terapia oparta na stymulacji układu immunologicznego do wytworzenia skutecznej i długotrwałej odpowiedzi antynowotworowej. W ostatniej dekadzie opracowano rewolucyjną strategię opartą na zahamowaniu aktywności negatywnych punktów kontrolnych układu odpornościowego. Pierwszym inhibitorem punktów kontrolnych (ICI) zarejestrowanym w 2011 roku do leczenia pacjentów w zaawansowanym stadium czerniaka był ipilimumab – przeciwciało monoklonalne (mAb) blokujące receptor CTLA-4. Cztery lata później do użytku dopuszczono inhibitory PD-1 – niwolumab i pembrolizumab, które znalazły zastosowanie w leczeniu chorych na raka płuc, szyjki macicy, nowotwory regionu głowy i szyi, czy chłoniaka Hodgkina[10]. Niestety wyżej wspomniane sposoby walki z chorobą są skuteczne tylko u niewielkiej części pacjentów poddanych leczeniu – prawie 70% osób nie wykazuje odpowiedzi na terapię ICI lub ulega jedynie chwilowej poprawie[10]. Występuje swoista oraz nieswoista odporność na immunoterapię[11,12]. Ponadto, blokada punktów kontrolnych stymuluje układ odpornościowy, co może doprowadzić do poważnych powikłań takich jak: zapalenie mięśnia sercowego, zaburzenia endokrynologiczne, czy nawet śmierć[13]. Dodatkowo obecnie dopuszczone strategie kliniczne wykorzystują przeciwciała monoklonalne, które w porównaniu z małymi cząsteczkami posiadają liczne wady. Po pierwsze, mAb nie można podawać doustnie, co jest znacznym utrudnieniem dla pacjentów. Po drugie, mAb wykazują bardzo długi biologiczny okres półtrwania (nawet kilka tygodni), dlatego po wstrzyknięciu do organizmu mogą wywoływać uciążliwe skutki uboczne[14]. W przeciwieństwie do mAb, małe cząsteczki są w stanie penetrować błony komórkowe i inne fizjologiczne przeszkody, takie jak bariera krew-mózg. Dzięki niewielkim rozmiarom i korzystnym parametrom fizykochemicznym, małe cząsteczki są bardziej predysponowane do aktywności w mikrośrodowisku guza. Ich biodostępność pozwala na większą kontrolę w czasie leczenia i minimalizowanie działań niepożądanych[15]. Ponadto koszty produkcji małocząsteczkowych substancji aktywnych są niższe. Nowa generacja immunoterapii (ok. 25% badań klinicznych) wykorzystuje synergistyczny efekt kombinacji leków biologicznych z małymi cząsteczkami aby zwiększyć odpowiedź terapeutyczną, a tym samym przeżywalność pacjentów[16]. Powyższe względy wskazują na potrzebę poszukiwania innowacyjnych małych cząsteczek, które będą działać na nowe cele terapeutyczne, aby pomóc większej populacji pacjentów. 1.2 Immunosupresyjna rola adenozyny Adenozyna 1.1 (ADO, Schemat 1.1) jest odkrytym w 1929 roku[17] endogennym nukleozydem purynowym wykazującym dużą aktywność biologiczną. Jako agonista czterech podtypów receptorów sprzężonych z białkami G (A1R, A2AR, A2BR, A3R) bierze udział w regulacji licznych procesów fizjologicznych m.in. układu immunologicznego, nerwowego, krwionośnego, wydalniczego i oddechowego[18]. Aktywacja A2AR i A2BR poprzez interakcję z białkami GS stymuluje aktywność cyklazy adenylowej i zwiększa wewnątrzkomórkowe stężenie cAMP. Natomiast podtypy A1R oraz A3R wykazują działanie przeciwstawne – przez sprzężenie z białkami Gi hamują cyklazę adenylową i produkcję cAMP[19]. W efekcie, aktywacja A2AR i A2BR w komórkach układu odpornościowego wywołuje silne efekty immunosupresyjne przez inhibicję ścieżek sygnalizacyjnych zależnych od cAMP[20]. Schemat 1.1. Ścieżka syntezy adenozyny z udziałem ektonukleotydaz CD39 i CD73. Adenozyna dzięki swoim immunosupresyjnym właściwościom jest protagonistą ucieczki nowotworów spod nadzoru układu odpornościowego[20]. W mikrośrodowisku guza, podczas procesów związanych z hipoksją i śmiercią komórek uwalniana jest duża ilość ATP 1.2, które w przeciwieństwie do adenozyny inicjuje antynowotworową odpowiedź immunologiczną. Zachodzi ona poprzez aktywację receptorów P2X oraz P2Y w komórkach układu odpornościowego[21]. W okolicznościach stanu zapalnego obecnego w guzie, dochodzi do nadekspresji dwóch enzymów: ektonukleotydazy CD39 oraz ektonukleotydazy CD73, które odpowiedzialne są za konwersję ATP do adenozyny[22]. W pierwszym etapie CD39 hydrolizuje ATP oraz ADP 1.3 do AMP 1.4. Następnie w wyniku działania CD73 usuwana jest ostatnia grupa fosforylowa i powstaje adenozyna. W efekcie nadmiernego rozkładu ATP wytwarzany jest ochronny płaszcz adenozynowy, który sprzyja rozwojowi guza[23]. Biorąc pod uwagę przeciwstawne działanie wspomnianych nukleozydów, stosunek ich stężeń istotnie wpływa na wystąpienie odpowiedzi antynowotworowej organizmu[24]. Liczne badania przedkliniczne wskazują, że blokada A2AR i A2BR lub zmniejszenie stężenia adenozyny w mikrośrodowisku guza przez inhibicję CD39 i CD73 mogą przywrócić antynowotworowe działanie układu odpornościowego oraz zwiększyć wydajność działania immunoterapii[1–4,25]. Wstępne rezultaty badań klinicznych prowadzonych z udziałem leków oddziałujących na wspomniane cele biologiczne również potwierdzają zasadność tej strategii terapeutycznej[26–28]. 1.3 Badania kliniczne W ostatnich latach znacząco wzrosła liczba badań klinicznych leków antynowotworowych działających na cele biologiczne będące elementami ścieżki syntezy adenozyny (Rysunek 1.1, na podstawie bazy ClinicalTrials.gov). Pierwsze badania dotyczyły selektywnych antagonistów A2AR oraz inhibitorów CD73 i zostały zainicjowane w 2015 r. Dopiero po trzech latach rozpoczęto ewaluację pozostałych celów. Eksperymenty skupiające się na antagonistach A2AR są najliczniejsze ze względu na wcześniejsze zainteresowanie tym receptorem w terapii schorzeń neurologicznych[29]. Teoretycznie ponowne wykorzystanie wstępnie przebadanych cząsteczek zwiększa szanse na wprowadzenie gotowego leku na rynek i obniża koszty testów klinicznych. W tym przypadku niesie to jednak konsekwencje poważnych działań niepożądanych, ponieważ związki chemiczne dedykowane do leczenia chorób układu nerwowego zwykle przekraczają barierę krew-mózg. W przeciwieństwie do małych cząsteczek stosowanych w badaniach celujących w receptory adenozynowe, inhibitory CD73 oraz CD39 które są obecnie ewaluowane klinicznie to w przeważającej większości mAb. Nowe małocząsteczkowe leki są także często testowane w połączeniu z zarejestrowanymi ICI, aby sprawdzić czy występuje efekt synergii. Cel biologiczny 0 5 10 15 20 2015 2016 2017 2018 2019 2020 2021 Liczba badań klinicznych A2AR A2AR/A2BR A2B CD73 CD39 Rysunek 1.1. Czas rozpoczęcia badań klinicznych dla poszczególnych celów. Ze względu na krótki okres trwania wspomnianych eksperymentów klinicznych, większość z nich pozostaje na początkowym etapie (Rysunek 1.2). Ilość dostępnych danych nie jest wystarczająca do całkowitego potwierdzenia skuteczności zastosowanych strategii terapeutycznych, jednak wstępne doniesienia konferencyjne wskazują na możliwość bezpiecznego leczenia różnorodnych typów nowotworów przez ograniczenie działania adenozyny w mikrośrodowisku guza[27,28,30,31]. Etap badań klinicznych 0 5 10 15 20 25 CD73 A2AR A2AR/A2BR CD39 A2B Liczba badań klinicznych Faza I Faza I/II Faza II Rysunek 1.2. Stopień zaawansowania badań klinicznych dla poszczególnych celów. 1.4 Antagoniści receptora A2A Początkowe prace nad antagonizmem A2AR dotyczyły poszukiwania leków na schorzenia neurologiczne, szczególnie chorobę Parkinsona. Większość otrzymanych związków nie dała statystycznie istotnych rezultatów badań klinicznych[29]. W związku z rosnącym w ostatnich latach zainteresowaniem immunosupresyjną rolą adenozyny, część wspomnianych substancji jest obecnie testowana klinicznie oraz przedklinicznie jako immunoterapeutyki. Zwyczajowy podział antagonistów A2AR wyróżnia cząsteczki bazujące na szkielecie ksantyny oraz pochodne nieksantynowe[32]. 1.4.1 Ksantynowi antagoniści A2AR Najpopularniejszy przedstawiciel tej grupy to kofeina (1.5, 1,3,7-trimetyloksantyna, Schemat 1.2), która występuje powszechnie w pożywieniu i jest najczęściej przyjmowaną substancją bioaktywną[33]. W zbiorze alkaloidów ksantynowych warto wyróżnić strukturalnie spokrewnione z kofeiną: paraksantynę 1.6, teobrominę 1.7 oraz teofilinę 1.8. Paraksantyna jest głównym metabolitem kofeiny u zwierząt. Alkiloksantyny pomimo nieskomplikowanej struktury były od dawna wykorzystywane w medycynie. Zainteresowanie ich właściwościami ciągle rośnie, na co dowodem może być liczba badań klinicznych prowadzonych z użyciem kofeiny – 1063 wyniki w bazie ClinicalTrials.gov (dostęp 13.06.2021). Schemat 1.2. Przykłady naturalnie występujących ksantyn. Alkaloidy ksantynowe 1.5-1.8 działają jako nieselektywni antagoniści receptorów adenozynowych (Tabela 1.1). Najsilniejszym z nich jest teofilina, która znalazła zastosowanie w leczeniu schorzeń układu oddechowego. Kofeina została wykorzystana przez grupę Sitkovsky’ego w modelowych badaniach immunosupresyjnych właściwości adenozyny[34]. Tabela 1.1. Powinowactwo wybranych alkiloksantyn do receptorów adenozynowych[35,36]. Związek Ki / µM A1R A2AR A2BR A3R 1.5 10.7 9.6 10.4 13.3 1.6 6.8 6.7 9.1 22.3 1.7 21 19.4 4.5 >100 1.8 105 >250 130 >100 1.9 9.6 0.012 1.8 >3 ISTRADEFILINA Struktura kofeiny stała się podstawą do tworzenia bardziej wyspecjalizowanych antagonistów A2AR. W celu zwiększenia aktywności oraz selektywności modyfikowano pozycje 1, 3, 7 oraz 8. Wprowadzenie podstawnika styrylowego związanego z C8 okazało się kluczowe dla uzyskania antagonistów wpływających głównie na A2AR[37]. Stąd też większość otrzymywanych później ksantynowych pochodnych zawiera ten fragment[32]. Najbardziej reprezentatywny przykład z tej grupy stanowi opracowana przez firmę Kyowa Hakko istradefilina (1.9, Schemat 1.3). Schemat 1.3. Struktura istradefiliny. Co ciekawe 1.9 jest jedyną ksantynową pochodną, która dotarła do stadium badań klinicznych. Została zarejestrowana jako lek w terapii choroby Parkinsona w Japonii w 2013 r. oraz USA w 2019 r.[38]. Niestety działanie na układ nerwowy może stanowić barierę w wykorzystaniu 8-styryloksantyn w immunoterapii. Związki z tej grupy są również inhibitorami MAO-B, co grozi wywoływaniem działań niepożądanych. Syntezę istradefiliny[39] (Schemat 1.4) rozpoczęto od nitrozowania 6-amino-1,3-dimetylouracylu 1.10 w pozycji 5. Następnie zredukowano grupę nitrozylową 1.11 w obecności amoniaku i ditionianu(III) sodu, dając związek 1.12. W kolejnym etapie, w reakcji 1.12 z chlorkiem kwasowym 1.13 zsyntezowano amid 1.14. Cyklizację 1.14 przeprowadzono z wysoką wydajnością przez ogrzewanie w obecności heksametylodisilazanu (HMDS) oraz siarczanu(VI) amonu. Ostatni etap polegał na regioselektywnym alkilowaniu pozycji N7 ksantyny 1.15 przy użyciu jodometanu oraz węglanu potasu. Schemat 1.4. Synteza istradefiliny. Rozwój tego chemotypu napotykał na liczne problemy wynikające z niskiej rozpuszczalności w wodzie oraz wrażliwości na światło (Schemat 1.5). Schemat 1.5. Niestabilność 8-styryloksantyn w obecności światła. Eksperymentalnie dowiedziono, że w rozcieńczonym roztworze 8-styryloksantyny ulegają izomeryzacji pod wpływem promieniowania widzialnego[40]. Ponadto zaobserwowano, że niestabilność występuje również w fazie stałej – naświetlanie katalizuje dimeryzację zachodzącą przez cykloaddycję [2+2] wiązania podwójnego grupy styrylowej[39]. Zarówno izomer-(Z) 1.16 jak i dimer 1.17 wykazują obniżone powinowactwo do A2AR. Otrzymano liczne ksantynowe pochodne[41–43], które miały rozwiązać problemy istradefiliny, jednak żadne z nich nie znalazły zastosowania w immunoterapii. 1.4.2 Nieksantynowi antagoniści A2AR W związku z suboptymalnymi właściwościami ksantynowych antagonistów A2AR, opracowano liczne niepurynowe związki heterocykliczne, aby poprawić parametry fizykochemiczne oraz zwiększyć selektywność względem pozostałych receptorów adenozynowych (Schemat 1.6). Niektóre ligandy pomimo niekorzystnych właściwości farmakologicznych zasługują na uwagę, ponieważ badania z ich udziałem były fundamentalne dla poznaniu struktury A2AR oraz identyfikacji oddziaływań kluczowych dla powinowactwa. Aktywność omawianych antagonistów przedstawiono poniżej (Tabela 1.2). Tabela 1.2. Powinowactwo wybranych ligandów do receptorów adenozynowych[32,44,45]. Związek Ki / nM A1R A2AR A2BR A3R 1.18 3.5 0.15 71 51 1.26 255 0.8 50 >10000 1.34 350 1.2 >10000 >10000 1.41 >1000 1.1 >1700 >1000 1.92 1350 5.0 700 1570 1.70 68 1.3 63 1005 1.79 192 3.5 1528 2455 1.101 2500 12 1000 5000 1.112 160 1.7 64 >10000 1.119 64 1.5 2.0 489 1.49* 192 0.71 575 >30000 *wartości IC50 / nM CGS-15943 Pionierska cząsteczka, CGS-15943 1.18 została odkryta w laboratoriach Ciba-Geigy[46] w 1987 r. Trójcykliczna struktura nadal nie zapewniała pożądanej rozpuszczalności, jednak posiadała wysoką aktywność wobec A2AR. Wadą związków tego typu była niska selektywność względem A1R. Schemat 1.6. Najistotniejsze przykłady nieksantynowych antagonistów receptora A2A. Optymalną syntezę[47] 1.18 (Schemat 1.7) rozpoczęto od przekształcenia łatwo dostępnego antranilonitrylu 1.19 w etylokarbaminian 1.20 poprzez ogrzewanie w obecności chloromrówczanu etylu. Atom chloru wprowadzono wykorzystując przegrupowanie Ortona[48]. Ta interesująca strategia polega na początkowym N-chlorowaniu 1.20 oraz następującym po nim przegrupowaniu, w którym powstaje produkt 1.21 z atomem chloru związanym w pozycji para do azotu. Reakcja 1.21 oraz hydrazydu 1.22 w wysokiej temperaturze, doprowadziła do trójcyklicznego związku 1.23. Należy zauważyć, że ten etap obejmował dwie cyklizacje, przy czym produkt pośredni 1.24 nie był izolowany, ponieważ ulegał spontanicznej annulacji do 1.23. Zasadowa hydroliza 1.23 do triazolu 1.25 wymagała drastycznych warunków, dlatego wykorzystano wysokowrzący układ rozpuszczalników woda-glikol etylenowy. Ostatni etap obejmował przekształcenie 1.25 w triazolochinazolinę 1.18 z użyciem nadmiaru cyjanamidu oraz rozcieńczonego kwasu siarkowego. Autorzy finezyjnie zaprojektowali ścieżkę, wykorzystując niską rozpuszczalność produktów – każdy ze związków otrzymano z wysoką wydajnością w multigramowej skali. Produkty oczyszczano przez strącanie bądź krystalizację. Schemat 1.7. Synteza CGS15943. ZM-241385 Kolejna cząsteczka, która odegrała historyczną rolę w powstaniu współczesnych antagonistów A2AR, to ZM-241385 1.26 opisana przez Zeneca Pharmaceuticals 8 lat po odkryciu 1.18[49]. Triazolotriazyna 1.26 silnie wiąże się zarówno z A2AR jak i A2BR. Co najważniejsze posłużyła do uzyskania pierwszej struktury krystalicznej kompleksu z A2AR[50], kładąc tym samym fundamenty pod prace nad kolejnymi generacjami antagonistów A2AR[51]. Związek ten był często wykorzystywany do testów biologicznych nad receptorami adenozynowymi[52,53]. Pomimo obiecujących wyników eksperymentów modelowych, 1.26 nie dotarł do stadium klinicznego ze względu na słabe właściwości farmakokinetyczne i bardzo małą biodostępność[54]. Schemat 1.8. Synteza ZM-241385. Syntezę 1.26 (Schemat 1.8)[55,56] rozpoczęto od reakcji hydrazydu 1.22 z S-metyloizotiomocznikiem 1.27 w temperaturze pokojowej. Produkt przejściowy 1.28 ulegał ilościowej cyklizacji do 1.29 podczas ogrzewania wodnego roztworu w reaktorze mikrofalowym. Układ triazolotriazyny utworzono w reakcji kondensacji 1.29 z 1.30 w wysokiej temperaturze, bez użycia rozpuszczalnika. Ostatnie dwa etapy syntezy obejmowały klasyczną sekwencję utleniania tioeteru 1.31 do sulfonu 1.32 i następującej po nim reakcji SNAr z udziałem tyraminy 1.33. Zaprojektowane w ten sposób podejście pozwalało na łatwe modyfikowanie kluczowego fragmentu cząsteczki podczas finalnego przekształcenia. SCH-58261 Odkrycie związków z grupy pirazolo-triazolo-pirymidyn (PTP) przyczyniło się do znaczącego postępu w zrozumieniu zależności pomiędzy strukturą, a aktywnością (SAR) antagonistów receptorów adenozynowych. Istotny reprezentant tego chemotypu – SCH-58261 1.34 został opracowany przez naukowców z Schering-Plough w 1994 r[57]. Substancję tę można rozpatrywać jako wywodzącą się z CGS-15943 – pierścień fenylowy zamieniono na N-podstawiony pirazol, a reszta szkieletu pozostała nienaruszona. Pomimo słabych parametrów farmakokinetycznych oraz rozpuszczalności[58], 1.34 wykazał właściwości antynowotworowe w eksperymentach przedklinicznych[59] oraz znalazł zastosowanie w badaniach radioizotopowych nad A2AR[60]. Ze względu na większą selektywność związków z podstawnikami w pozycji N7, konieczne było opracowanie wydajnej syntezy pożądanego izomeru[61] (Schemat 1.9). Schemat 1.9. Synteza SCH-58261. Przedstawiona ścieżka pozwalała uniknąć problematycznego rozdzielania regioizomerów alkilowanego pirazolu, jednak nie oferowała konwergencji pożądanej podczas badania SAR – każdy przykład wymagał 5-etapowej syntezy. Ogólny schemat otrzymywania PTP rozpoczynał się od cyklizacji odpowiedniej hydrazyny 1.35 z pochodną malononitrylu 1.36. Pirazol 1.37 przekształcano w iminoeter 1.38 przez ogrzewanie z ortomrówczanem trietylu. Następnie w reakcji z hydrazydem 1.22 powstawała PTP 1.39 pozbawiona grupy aminowej. Otwarcie pierścienia pirymidyny z utworzeniem pirazolo-triazolu 1.40 zachodziło w warunkach kwasowych. Ostatni etap polegał na kondensacji 1.40 z cyjanamidem. PRELADENANT W kolejnych latach kontynuowano rozwój związków z grupy PTP – powstały dziesiątki cząsteczek o różnorodnych strukturach. Ze względu na kilka dostępnych wektorów rozbudowy, możliwe było projektowanie selektywnych antagonistów nie tylko A2AR, ale również A3R[62,63]. W celu zwiększenia rozpuszczalności w wodzie, zmodyfikowano fragment alkilowy w pozycji N7, wprowadzając dodatkowy pierścień piperazyny. Tym samym cząsteczka mogła zostać przeprowadzona w dobrze rozpuszczalną formę soli. Dalsze modyfikacje w obrębie pierścienia fenylowego doprowadziły do opracowania optymalnego antagonisty – preladenantu 1.41. Związek ten wyjątkowo selektywnie wiąże się z A2AR, ma korzystny profil farmakokinetyczny i nadaje się do doustnego podania. Został poddany testom klinicznym jako lek neurologiczny w fazach I-III oraz jako immunoterapeutyk w fazie I, jednak w żadnym przypadku nie potwierdził swojej skuteczności[64]. Ścieżka syntezy 1.41 uległa znacznej modyfikacji w stosunku do 1.34 (Schemat 1.10)[65]. Naukowcy otrzymali główny fragment cząsteczki 1.42, który mógł być selektywnie podstawiany w pozycji N7, dając pożądane związki końcowe po efektywnej sekwencji dwóch przekształceń. Alkilowanie 1.42 z użyciem ditosylowej pochodnej glikolu etylenowego 1.43 prowadziło głównie do preferowanego izomeru 1.44. Ostatni etap polegał na substytucji nukleofilowej pozostałej grupy tosylowej przez fenylopiperazynę 1.45. Fenylopiperazyny przygotowywane były w reakcji Buchwalda-Hartwiga[66]. Opisany sposób umożliwił wydajne otrzymanie dużej biblioteki związków w krótkim czasie. Schemat 1.10. Modyfikacja głównego fragmentu PTP. Syntezę centralnego fragmentu PTP (Schemat 1.11) rozpoczęto od reakcji SNAr symetrycznej dichloropirymidyny 1.46 oraz hydrazydu 1.22. Otrzymany aldehyd 1.47 przekształcono w indazol 1.48 w kondensacji z hydrazyną. Ostatni etap przygotowania 1.42 polegał na cyklizacji 1.48 z udziałem N,O-bis(trimetylosililo)acetamidu (BSA) oraz następującym po niej przegrupowaniu Dimrotha. Schemat 1.11. Synteza centralnego fragmentu PTP. INUPADENANT Odkrycie inupadenantu 1.49 przez iTeos Therapeutics[67] jest wspaniałą kontynuacją sagi trójcyklicznych antagonistów A2AR rozpoczętej przez CGS-15943. Inupadenant to selektywny antagonista A2AR nie przekraczający bariery krew-mózg. Taka charakterystyka umożliwia podawanie go w większych dawkach bez wywoływania efektów ubocznych ze strony ośrodkowego układu nerwowego. Badacze wykazali, że cząsteczki opracowane pod kątem leczenia schorzeń neurologicznych tracą aktywność w wysokim stężeniu adenozyny występującym w mikrośrodowisku guza. Wyróżniającą cechą 1.49 jest zachowanie antagonistycznych właściwości w tych trudnych warunkach[45]. Działanie inupadenantu ewaluowane jest w I fazie badań klinicznych. Pierwsze wyniki są obiecujące i wskazują na duży potencjał terapeutyczny tego związku[68]. Struktura substancji opisanych w patentach opublikowanych przez iTeos wykazuje ogromne podobieństwo do cząsteczek z grupy PTP, a w szczególności preladenantu[69]. Wszystkie z nich zawierają pierścień furanu połączony z triazolem oraz łańcuch bispodstawionej piperazyny związany z N7. Główny element różnicujący stanowi budowa drugiego pięcioczłonowego pierścienia skondensowanego z pirymidyną oraz dekoracja terminalnej grupy fenylowej. Związki z tej grupy można określić jako tiazolo-triazolo-pirymidyny (TTP). Synteza 1.49 oraz innych przykładów z patentów przebiega konwergentnie w reakcji substytucji nukleofilowej z udziałem dwóch bloków budulcowych – alkilowanej TTP 1.50 oraz fenylopiperazyny 1.51 (Schemat 1.12). Opublikowana ścieżka nie jest optymalna, reprezentuje sposób otrzymywania związków na etapie badawczo-rozwojowym. Schemat 1.12. Finalny etap syntezy inupadenantu. Trzon cząsteczki 1.50 uzyskano w dziewięciu etapach, wychodząc z pirymidonu 1.52. Został on przekształcony do w pełni sfunkcjonalizowanej pirymidyny 1.53 w reakcji tiocyjanowania, w warunkach opisanych na początku XX wieku przez Kaufmanna[70]. Następnie przy użyciu fluorku tetrabutyloamoniowego (TBAF) przeprowadzono cyklizację 1.53 do aminotiazolu 1.54. Pierwsze dwa etapy należy uznać za optymalne, ponieważ wykonano je z dobrymi wydajnościami w kilogramowej skali. W trzecim kroku przekształcono 1.54 w sól diazoniową, po czym zhydrolizowano do docelowego oksotiazolu 1.55. Alkilowanie bromkiem 1.56 dało z przeciętną wydajnością alkilotiazol 1.57. Chloropirymidynę 1.58 uzyskano w wyniku ogrzewania 1.57 z trichlorkiem fosforylu. Reakcja SNAR pomiędzy 1.58, a hydrazydem 1.22 doprowadziła do produktu 1.59 o strukturze analogicznej do 1.48. Następnie zastosowano strategię cyklizacji identyczną jak w syntezie preladenantu. Zabezpieczoną TTP 1.60 poddano deprotekcji z tribromkiem boru. Mesylowanie alkoholu 1.61 doprowadziło do kluczowego związku 1.50 wykorzystywanego do otrzymania wielu przykładów z patentu. Schemat 1.13. Synteza głównego bloku budulcowego inupadenantu. Aminę 1.51 uzyskano w sześciu etapach wychodząc z fenolu 1.62 (Schemat 1.14). Schemat 1.14. Synteza piperazynowej części inupadenantu. Grupę hydroksylową 1.62 zabezpieczono z wysoką wydajnością przy użyciu bromku benzylu. Następnie w sprzęganiu Buchwalda-Hartwiga 1.63 wprowadzono piperazynę 1.64. Katalizowane palladem na węglu uwodornienie 1.65 doprowadziło do fenolu 1.66, który alkilowano chlorkiem 1.67 w reakcji Williamsona. Powstały tioeter 1.68 utleniono do 1.69 w układzie nadtlenek wodoru/kwas octowy i rozdzielono na enancjomery. Czysty optycznie produkt poddano finalnemu odbezpieczeniu do 1.51 w łagodnych warunkach z chlorkiem cyny(IV)[71]. VIPADENANT Vipadenant 1.70 to odkryty na początku XXI wieku[72] prototyp leku na chorobę Parkinsona, który odniósł porażkę w II fazie badań klinicznych ze względu na toksyczność[73]. Vipadenant jest nieselektywnym antagonistą A1R, A2AR oraz A2BR. Pomimo wcześniejszych problemów z toksycznością otrzymał drugą szansę – został udostępniony Bristol-Myers Squibb do przedklinicznych badań immunoonkologicznych. Ze względu na małą selektywność względem A1R, 1.70 może mniej skutecznie aktywować układ immunologiczny[74]. W 2018 r. opisano strukturę krystaliczną kompleksu 1.70 z A2AR, co umożliwiło dokładne zrozumienie sposobu wiązania antagonistów z rodziny triazolopirymidyn[75]. Toksyczność 1.70 jest potencjalnie związana z obecnością bogatej w elektrony aminy aromatycznej bądź pierścienia furanu. Aminy aromatyczne w cząsteczce leku mogą wywoływać niepożądane reakcje metaboliczne w związku z inhibicją cytochromu P450 (CYP450) lub tworzeniem adduktów z glutationem (GSH)[76]. Natomiast pierścienie furanu są podatne na utlenianie katalizowane przez CYP450. Powstałe reaktywne metabolity łatwo alkilują białka lub DNA[77]. Ścieżka syntezy 1.70 (Schemat 1.15) opracowana przez Vernalis umożliwia modyfikację podstawników w pozycjach N3 oraz C7 na ostatnich dwóch etapach[78]. Historyczny sposób otrzymywania triazolopirymidyny 1.74 pochodzi z 1962 r. i został wykorzystany w niezmienionej formie[79]. Pierwszy etap polegał na sprzęganiu diazoniowym pirymidyny 1.71 oraz chloroaniliny 1.72. Redukcja grupy azowej 1.73 przy użyciu cynku i kwasu octowego prowadziła do triaminopirymidyny 1.74. Główny blok budulcowy 1.75 powstał z dobrą wydajnością w reakcji cyklizacji 1.74 z azotynem izoamylu. W przeciwieństwie do wcześniej omawianych syntez, furan wprowadzono na końcowym etapie z użyciem bardziej współczesne reakcji – sprzęgania Stille’a ze związkiem cynoorganicznym 1.76. Modyfikacja N3 nie przebiegała selektywnie, ale preferowany produkt alkilowania 1.77 bromkiem benzylu 1.78 był dominujący. Sekwencję zakończyła redukcja grupy nitrowej przy użyciu chlorku cyny. Schemat 1.15. Synteza vipadenantu. CIFORADENANT Ciforadenant 1.79 opracowany przez Vernalis stanowi naturalną ewolucję vipadenantu[80]. Toksyczność cząsteczki została zmniejszona przez wyeliminowanie aniliny we fragmencie połączonym z N3 oraz wprowadzenie grupy metylowej w pierścieniu furanu. Nowy antagonista działa selektywnie na A2AR. Dodatkowo dzięki polarnemu fragmentowi tetrahydrofuranu poprawiona została rozpuszczalność. Związek jest obecnie w I fazie badań klinicznych jako terapia immunoonkologiczna. Sposób syntezy 1.79 uległ znacznemu ulepszeniu (Schemat 1.16, Schemat 1.17). Zaprezentowana w patentach ścieżka nie podaje wydajności lecz można przewidywać że są wysokie, ponieważ zaprojektowano ją aby dostarczać duże ilości aktywnego składnika farmaceutycznego (API) na potrzeby badań klinicznych[81,82]. Pierwsze pięć etapów obejmuje syntezę kluczowego bloku budulcowego 1.80. Na początku kwas dipikolinowy 1.81 został podwójnie zestryfikowany. Diester 1.82 poddano redukcji w łagodnych warunkach z utworzeniem diolu 1.83. Następnie przy użyciu chlorku tionylu otrzymano dichloropochodną 1.84. Wykorzystano ją w reakcji Delépine'a z urotropiną (HMTA). Pożądany substrat 1.80 powstał w wyniku kwasowej hydrolizy czwartorzędowej soli amoniowej 1.85. Schemat 1.16. Otrzymywanie pirydynowego fragmentu ciforadenantu. Konstrukcja docelowej cząsteczki zachodzi w czterech etapach. W pierwszym z nich wykonano reakcję SNAR ogrzewając 1.80 oraz pirymidynę 1.86 w wodnym roztworze trietanoloaminy. Cyklizacja powstałej triaminopirymidyny 1.87 z azotanem(III) sodu doprowadziła do triazolopirymidyny 1.88. W porównaniu z syntezą vipadenantu, ulepszono metodę wprowadzania furanu. Zrezygnowano z użycia toksycznego organocynowego substratu na rzecz sprzęgania Suzukiego 1.88 z estrem boronowym 1.89. Ostatnim etapem była reakcja Williamsona 1.90 z chiralnym alkoholem 1.91 przy użyciu wodorku sodu. Opisany sposób syntezy umożliwił izolację wszystkich produktów bez użycia technik chromatograficznych. Enancjomer 1.79 jest łatwo osiągalny przez zmianę substratu w finalnym przekształceniu. Schemat 1.17. Synteza ciforadenantu. TOZADENANT Tozadenant 1.92 został opracowany w laboratoriach Roche w 2005 r[83]. Posiada nieprzypominającą adeniny strukturę opartą na benzotiazolu, co wyróżnia go spośród pozostałych omawianych cząsteczek. Ponadto nie zawiera pierścienia furanu. Tozadenant podzielił nieszczęśliwy los preladenantu, odnosząc porażkę w III fazie badań klinicznych nad chorobę Parkinsona. Związek ten jest selektywnym antagonistą A2AR, który w modelowych eksperymentach wykazał synergistyczne działanie antynowotworowe w połączeniu z ICI[84]. Pomimo upływu 6 lat od publikacji obiecujących wyników, nie poddano go bardziej zaawansowanym testom w domenie immunoonkologii. Sposób syntezy 1.92 jest wydajny i nie wymaga skomplikowanych operacji oczyszczania (Schemat 1.18)[85]. Na początku fenylomorfolina 1.93 została regioselektywnie przekształcona w nitropochodną 1.94. Anilina 1.95 powstała w wyniku katalizowanego palladem uwodornienia 1.94. Kolejny etap polegał na utworzeniu zabezpieczonego tiomocznika 1.96 w reakcji trójskładnikowej. Następnie usunięto grupę benzoilową, niemalże ilościowo otrzymując tiomocznik 1.97. Benzotiazol 1.98 powstał w warunkach opisanych przez Hugershoffa[86]. Grupę aminową 1.98 przekształcono w karbaminian 1.99 w reakcji z chloromrówczanem fenylu. Ten kluczowy blok budulcowy mógł być użyty do jednoetapowej syntezy licznych antagonistów A2AR poprzez ogrzewanie z odpowiednimi aminami. Reakcja 1.99 z pochodną piperydyny 1.100 doprowadziło do powstania 1.92 z wysoką wydajnością. Schemat 1.18. Synteza tozadenantu. TAMINADENANT Następny selektywny antagonista A2AR, który nie zawiera w strukturze furanu to taminadenant 1.101, opracowany przez hiszpańską firmę biotechnologiczną Palobiofarma[87]. Obecnie prowadzone są z jego udziałem badania kliniczne II fazy. Prototypem 1.101 były opatentowane kilka lat wcześniej związki nieposiadające podstawnika w pozycji C5[88]. Badacze odkryli, że wprowadzenie w tym miejscu elektroujemnego ugrupowania znacząco poprawia aktywność substancji względem A2AR (25 razy w przypadku 1.101). W porównaniu z omawianymi wcześniej przykładami, taminadenant posiada bardzo nieskomplikowaną strukturę. Związek otrzymano w czterech etapach bez konieczności oczyszczania wyizolowanych produktów (Schemat 1.19). Syntezę rozpoczęto od utlenienia tioeteru w handlowo dostępnej pirymidynie 1.102. Pozycja C5 1.103 została bromowana z użyciem NBS, a powstały sulfotlenek 1.104 poddano regioselektywnej reakcji SNAR z pirazolem. Na końcu w podobnych warunkach do 1.105 przyłączono drugą cząsteczkę pirazolu. Dalsze badania wykazały, że w warunkach fizjologicznych w wyniku utleniania jednego z pierścieni pirazolu powstaje aktywny metabolit 1.106 (Schemat 1.20), który również działa antynowotworowo[89]. Schemat 1.19. Synteza taminadenantu. Sposób przygotowania 1.106 zaprezentowany w patencie jest bardzo podobny do omówionego powyżej. Zamieniono kolejność przekształceń – na początku wykonano bromowanie pozycji C5 1.102. Następnie do 1.107 podstawiono pirazol, a produkt 1.108 utleniono z bardzo słabą wydajnością do sulfotlenku 1.109. Drugą reakcję SNAR przeprowadzono z kwasem boronowym 1.110. Utlenianie 1.111 wodnym roztworem nadtlenku wodoru w środowisku zasadowym doprowadziło do pożądanego metabolitu 1.106. Zastosowanie kwasu boronowego jako zamaskowanego fenolu jest interesującą strategią, ponieważ 4-hydroksypirazol w przeciwieństwie do 1.110 nie jest łatwo dostępny. Poza tym reakcja z takim związkiem wymagałaby zabezpieczenia grupy hydroksylowej. Schemat 1.20. Sposób otrzymywania aktywnego metabolitu tamidenantu. IMARADENANT Historia imaradenantu jest pięknym przykładem zastosowania współczesnych technologii do projektowania leków. Naukowcy z Sosei Heptares w wyniku badań opartych na modelowaniu molekularnym i analizie struktur krystalicznych A2AR z ligandami odkryli serię selektywnych antagonistów będących pochodnymi 1,2,4-triazyny[51]. Dalsza optymalizacja doprowadziła do opracowania wiodącego związku 1.112 obecnie testowanego w II fazie badań klinicznych[90]. Imaradenant wykazuje świetną selektywność względem A3R i A1R oraz dużo mniejszą wobec A2BR, co sugeruje dualny mechanizm działania. Warto wspomnieć, że ścieżka syntetyczna (Schemat 1.21) opracowana podczas prac badawczo-rozwojowych jest nadal wykorzystywana do syntezy API w kilogramowej skali na potrzeby testów klinicznych. Chemicy procesowi podjęli zaawansowane próby optymalizacji ze względu na agresywne warunki bromowania, które uszkadzały tantalowe elementy reaktora, jednak nie osiągnęli satysfakcjonującego usprawnienia[91,92]. Kondensacja wodzianu fenyloglioksalu 1.113 z węglanem aminoguanidyny 1.114 to kluczowy etap, w którym regioselektywnie powstał główny fragment 1.112. Problematyczne bromowanie 1.115 doprowadziło do produktu 1.116, który został użyty w reakcji Suzukiego. Ester boronowy 1.117 otrzymano w interesującym przykładzie bezpośredniego borylowania pirydyny 1.118 poprzez aktywację wiązania C-H. Zastosowano katalizę irydem w warunkach opartych na pionierskiej pracy Miyaury[93]. Finalne sprzęganie przebiegło ze świetną wydajnością. Produkcja API wymaga ścisłej kontroli zanieczyszczeń metalami, przez co często koniecznym elementem syntez z udziałem katalizatorów metalicznych jest przeprowadzenie dodatkowego etapu oczyszczania. Najczęściej wykorzystuje się w tym celu modyfikowane żywice lub sfunkcjonalizowany żel krzemionkowy. Autorzy uniknęli dodatkowych komplikacji i kosztów związanych z ich stosowaniem dzięki optymalnemu procesowi krystalizacji 1.112. Schemat 1.21. Optymalna synteza imaradenantu. ETRUMADENANT Odkryty przez Arcus Biosciences etrumadenant jest wyjątkową cząsteczką, ponieważ wykazuje dualny antagonizm A2AR oraz A2BR na zbliżonym poziomie[94]. Reprezentuje alternatywne podejście w stosunku do wielu opisanych wcześniej antagonistów. W tamtych przypadkach dążono do minimalizacji interakcji z pozostałymi receptorami adenozynowymi. Jednakże zarówno A2AR jak i A2BR odgrywają istotną rolę w immunosupresji, więc profil działania 1.119 może okazać się skuteczniejszy[95]. Wyniki badań klinicznych I fazy z udziałem etrumadenantu były obiecujące[96], dlatego obecnie prowadzone są liczne testy na bardziej zaawansowanym stadium. Nadchodzące miesiące mogą pokazać, czy strategia obrana przez Arcus jest efektywna. Ścieżka syntezy 1.119 to świetny przykład zróźnicowanego podejścia do otrzymywania API na etapie badawczo-rozwojowym i produkcyjnym[97]. Początkowy sposób przygotowania 1.119 był wystarczająco wydajny do szybkiego dostarczenia produktu dobrej jakości na potrzeby badania SAR oraz wstępnej charakterystyki in vitro i in vivo. Wspólnym elementem obu sekwencji jest katalizowana jonami miedzi reakcja cykloaddycji[98] pomiędzy azydkiem 1.120 i alkinem 1.121 – ostatni etap zbieżnej syntezy (Schemat 1.22). Schemat 1.22. Finalny etap otrzymywania etrumadenantu Pierwotna metoda przygotowania 1.119 skupiała się na konwergentnym ujęciu zagadnienia. Odkrycie kandydata klinicznego wymaga syntezy setek molekuł, dlatego wykorzystywane są jak najbardziej zaawansowane substraty, które można kupić. W ten sposób traci się mniej czasu na testowanie hipotez stawianych w toku realizacji projektu. Najwięcej różnic widocznych jest w podejściu do przygotowania alkinu 1.121. Pierwszym, a zarazem najbardziej problematycznym etapem było sprzęganie Suzukiego pomiędzy dichloropirymidyną 1.122, a wyszukanym estrem boronowym 1.123. Przeciętna wydajność tego przekształcenia związana jest z powstawaniem bispodstawionego produktu ubocznego oraz skomplikowanym procesem oczyszczania. Ponadto 1.123 to drogi odczynnik. Kolejnym krokiem było sprzęganie Sonogashiry pomiędzy chloropirymidyną 1.124, a acetylenem zabezpieczonym grupą TMS. Pomimo wysokiej wydajności, skalowanie tej reakcji okazało się problematyczne z powodu labilności grupy zabezpieczającej. Odbezpieczenie alkinu 1.125 przeprowadzono z użyciem TBAF, który stanowi zagrożenie dla instalacji wykorzystywanych w wielkoskalowej syntezie. Schemat 1.23. Początkowy sposób otrzymywania alkinu 1.121. Optymalne podejście do przygotowania 1.121 wydłużyło ścieżkę o cztery etapy. Na początku wykonano reakcję Sandmayera łatwo dostępnej aniliny 1.126, tworząc nitryl 1.127. Następnie przekształcono go w odczynnik Grignarda przy użyciu chlorku izopropylomagnezowego i poddano addycji elektrofilowej do dwutlenku węgla. Utworzony kwas 1.128 przeprowadzono w chlorek kwasowy i wykorzystano w reakcji Claisena z malonianem etylowo-potasowym. Kondensacja powstałego β-ketoestru 1.129 z węglanem guanidyny doprowadziła regiospecyficznie do pirymidonu 1.130. Autorzy odkryli, że zastosowanie trifluoroetanolu jest kluczowe dla wydajnego przebiegu cyklizacji. Przy użyciu etanolu – rozpuszczalnika typowego dla tego typu reakcji, produkt powstawał w śladowych ilościach. Warunki są uniwersalne i mogą być stosowane z różnorodnymi β-ketoestrami[99]. Ogrzewanie 1.130 z trichlorkiem fosforylu w obecności soli tetraalkiloamoniowej umożliwiło uzyskanie pożądanej chloropirymidyny 1.124 bez problematycznego oddzielania produktu ubocznego. Dalsza optymalizacja obejmowała zmianę grupy zabezpieczającej w cząsteczce acetylenu na TIPS, co pozwoliło na użycie łagodniejszych warunków do deprotekcji produktu sprzęgania Sonogashiry 1.131. Schemat 1.24. Optymalna ścieżka syntezy alkinu 1.121. Dwuetapowa metoda przygotowania substratu do cykloaddycji 1.120 (Schemat 1.25) w obu podejściach przebiegała podobnie. Ester 1.132 poddano reakcji Grignarda z bromkiem metylomagnezowym. Otrzymany diol 1.133 w obecności azydku difenylofosforylu (DPPA) i DBU utworzył terminalny azydek 1.120. Jedyną różnicą w skali produkcyjnej była synteza 1.120 in situ, z pominięciem potencjalnie niebezpiecznej izolacji. Efektem optymalizacji całości ścieżki było znaczne obniżenie kosztów produkcji 1.119 dzięki opracowaniu regiospecyficznej metody uzyskania 1.121, uniknięciu katalizowanego palladem sprzęgania oraz związanego z nim chromatograficznego oczyszczania. Związek otrzymano z tanich, łatwo dostępnych substratów, a bezpieczeństwo i powtarzalność procesu uległy poprawie. Schemat 1.25. Sposób otrzymywania azydku 1.120. 1.5 Inhibitory CD73 W przeciwieństwie do antagonistów receptorów adenozynowych, większość testowanych klinicznie inhibitorów CD73 to mAb. Biorąc pod uwagę możliwość synergetycznej terapii oraz wspomniane wcześniej negatywne aspekty użycia mAb, istotne jest poszukiwanie małych cząsteczek, które mogłyby zostać lekami immunoonkologicznymi. Dzięki zaangażowaniu licznych grup badawczych ze środowiska uniwersyteckiego i przemysłowego, w ostatniej dekadzie znacznie wzrosło zrozumienie struktury CD73 oraz wymogów, które muszą spełniać cząsteczki hamujące działanie tego białka. Ektonukleotydaza CD73 zawiera dwa jony cynku jako kofaktory i jest klasyfikowana jako metalofosfataza[100]. Wynika stąd istotny element budowy jej małocząsteczkowych inhibitorów – ugrupowanie wiążące cynk[101]. Opisane do tej pory substancje ograniczające działanie CD73 zawierają takie grupy funkcyjne jak: fosforan, kwas sulfonowy, sulfonamid, kwas karboksylowy, czy kwas hydroksamowy. Wysoka kwasowość sulfonianów i fosforanów sprawia, że w warunkach fizjologicznych występują w formie zjonizowanej. Jest to znaczące utrudnienie dla przekraczania barier biologicznych i ogólnej biodostępności takich cząsteczek. Ze względu na budowę znane inhibitory CD73 można podzielić na dwa typy: nukleotydy oraz nienukleotydy. 1.5.1 Nukleotydowe inhibitory CD73 Opracowane do tej pory małocząsteczkowe związki to w większości nukleotydomimetyki wywodzące się z optymalizacji naturalnie występujących cząsteczek. Pionierskie badania opisujące ATP 1.2 jako silny inhibitor CD73 opublikowano w 1966 r[102]. Cztery lata później odkryto, że ADP 1.3 oraz AMPCP 1.134 (Schemat 1.26) jeszcze mocniej hamują działanie enzymu[103]. Schemat 1.26. Pierwsze odkryte inhibitory CD73. Jedyny element różnicujący ADP oraz AMPCP, to struktura mostka łączącego dwa atomy fosforu. Grupa metylenobisfosfonianowa w 1.134 jest znacznie odporniejsza na enzymatyczną hydrolizę niż difosforan, jednak związki tego typu są nadal wrażliwe na metaboliczny rozkład wiązania P-O-C5’ oraz depurynację. Drugi proces niesie ze sobą niepożądane konsekwencje, ponieważ odłączona cząsteczka adenozyny może wywoływać efekty immunosupresyjne poprzez aktywację receptorów A2AR i A2BR. Nowa generacja nukleotydomimetyków posiada znacznie większą aktywność oraz stabilność (Schemat 1.27). Potencjalna niestabilność metaboliczna oraz silnie kwasowy charakter sprawiają, że wykorzystanie substancji z tej grupy jako leków jest trudniejsze. Pełna dysocjacja cząsteczek w warunkach fizjologicznych bardzo zmniejsza biodostępność, ogranicza możliwość doustnego podania lub wymusza użycie wyszukanych formulacji. W ostatnim dziesięcioleciu liczne badania doprowadziły do optymalizacji struktur naturalnych ligandów, a opracowane inhibitory mają szanse stać się skutecznymi immunoterapeutykami. Aktywności najistotniejszych związków zebrano poniżej (Tabela 1.3). Tabela 1.3. Aktywność wybranych inhibitorów CD73[104]. Związek Aktywność / nM 1.134# 88.4 1.135# 5.93 1.136# 2.21 1.137# 0.381 1.139# 0.005 1.138# 7.96 1.140* 2.6 1.141* 0.25 1.143* <10 1.142* <100 1.144* 9.0 * wartość IC50, # wartość Ki Schemat 1.27. Nukleotydowe inhibitory CD73. Punkt wyjścia dla wszystkich przedstawionych powyżej nukleotydów stanowiło AMPCP. Sposób w jaki 1.134 wiąże się z enzymem (Schemat 1.28) jest charakterystyczny dla wielu inhibitorów tego typu. Rybozowy fragment liganda tworzy sieć wiązań wodorowych z pobliskimi resztami kwasu asparaginowego i asparaginy, natomiast część adenozynowa zakotwiczona jest oddziaływaniami π pomiędzy dwoma resztami fenyloalaninowymi. Grupa bisfosfonianowa oddziałuje jonowo z cynkowym centrum katalitycznym enzymu[104]. Schemat 1.28. Schemat oddziaływań pomiędzy 1.134 i miejscem aktywnym CD73. Struktury powyższych nukleotydów są do siebie bardzo zbliżone. Ogólny zarys budowy to reszta kwasowa związana z pozycją C5’ części cukrowej (zwykle rybozy lub arabinozy) oraz zasadowa grupa heterocykliczna połączona wiązaniem glikozydowym. Najczęstsze modyfikacje obejmują fragment adeninowy oraz ugrupowanie kwasowe. Pionierskie badania SAR 1.134 wykonała grupa Müllera[105–107]. Bardzo istotne okazało się wprowadzenie atomu chloru w pozycji C2 części zasadowej 1.135, dzięki czemu inhibitory stały się znacznie aktywniejsze. Warto zauważyć, że ten motyw powtarza się we wszystkich przedstawionych związkach, niezależnie czy zawierają adeninę, czy jej pochodną. Modyfikacja grupy aminowej przy C6 w 1.136 oraz 1.137 wpłynęła na poprawę selektywności oraz stabilności. Rozbudowane sterycznie, hydrofobowe podstawniki sprawdziły się znacznie lepiej (benzyl > fenyl > etyl > metyl > H). Zamiana bicyklicznego układu heterocyklicznego na pochodną uracylu w 1.138 doprowadziła do pogorszenia aktywności. Na fundamentach położonych przez Müllera i współpracowników, Arcus Biosciences opracował pierwszy małocząsteczkowy inhibitor CD73, który dotarł do stadium badań klinicznych (1.139)[108]. Na uwagę zasługuje wymiana adeniny na azaindazol oraz rozbudowa grupy benzylowej, dzięki czemu związek stał się wyjątkowo aktywny i stabiliny. Wszystkie bisfosfonianowe analogi 1.134 skazane są na słabe wchłanianie z układu pokarmowego ze względu na silną jonizację. Liczne grupy wprowadziły modyfikacje reszty kwasowej nukleotydu, aby umożliwić doustne podanie substancji. Arcus zsyntezował serię metylenofosfonowych nukleotydomimetyków, z których najaktywniejszy reprezentant to 1.140[109]. We fragmencie purynowym zastosowano inny bioizoster adeniny niż w 1.139 z powodu odmiennej orientacji cząsteczki w centrum katalitycznym CD73. Bezpośrednią ewolucją 1.140 jest otrzymany przez Oric Pharmaceuticals związek 1.141 z dodatkowymi podstawnikami w pozycji α reszty fosfonianowej. Naukowcy odkryli, że wprowadzenie funkcjonalizacji w tym miejscu znacznie poprawia aktywność dzięki utworzeniu nowego oddziaływania z resztą argininową[110]. Podobne podejście zastosowali badacze z Boehringer Ingelheim, którzy umieścili w tej pozycji ugrupowanie estrowe (1.142). Poza tym zamiast adeniny wykorzystali triazolopirymidynę[111]. Peloton Therapeutics opatentowało interesującą cząsteczkę 1.143 zawierającą pirolopirymidynę jako bioizoster puryny oraz sulfon w miejscu atomu tlenu przy C5’[112]. Inhibitor 1.144 oparty na pierścieniu arabinozy został opisany przez Calithera Biosciences[113]. Warto zwrócić uwagę na zamianę reszty fosforanowej na mocno rozbudowaną pochodną kwasu malonowego. Cząsteczka jest testowana przedklinicznie w doustnej formulacji. Sposób syntezy nukleotydomimetyków warto rozpatrzyć na najbardziej reprezentatywnym przykładzie 1.139[114]. Pozostałe związki otrzymywane są zwykle wg analogicznego schematu. Najpierw budowany jest szkielet nukleozydowy, po czym na finalnym etapie wprowadza się resztę kwasową (Schemat 1.29). Schemat 1.29. Synteza 1.139. W przypadku 1.139 reakcja glikozydowania okazała się problematyczna ze względu na powstawanie dwóch regioizomerów produktu. Selektywną modyfikację N1 pirazolopirydyny 1.145 przeprowadzono w dwóch etapach. Na początku zabezpieczono substrat przy użyciu HMDS w obecności siarczanu(VI) amonu jako katalizatora. Następnie regioselektywnie alkilowano peracetylowaną β-D-rybozą 1.146 w obecności TMSOTf. Niestety w takich warunkach powstawała niewielka ilość niepożądanego anomeru, co wymusiło oczyszczanie chromatograficzne. Glikozyd 1.147 poddano reakcji SNAr z benzylaminą 1.148, a następnie odbezpieczono przy użyciu metanolowego roztworu amoniaku. Po przekształceniu uwolnionych grup hydroksylowych w acetonid, fosfonylowano pozycję C5’ nukleozydu 1.149. Finalna deprotekcja przebiegała samoczynnie w kwaśnym środowisku utworzonym po dodaniu wody. Syntezę azaindazolu 1.145 początkowo przeprowadzano w pięciu etapach (Schemat 1.30)[115]. Reakcja fenylohydrazyny 1.150 z akrylanem 1.151 prowadziła do zabezpieczonego pirazolu 1.152, który ulegał kondensacji z malonianem dietylu. Powstały ketoester 1.153 poddawano dekarboskylacji w zasadowych warunkach. Utworzona pirazolopirydyna 1.154 była przekształcana w bardzo wysokiej temperaturze w dichloropochodną 1.155, którą odbezpieczano ogrzewając w TFA. Opisana metoda stwarzała problemy na ostatnich dwóch etapach, ze względu na brak powtarzalności wysokotemperaturowego chlorowania oraz tworzenie polimerycznego zanieczyszczania podczas deprotekcji. Schemat 1.30. Początkowy sposób syntezy 1.145. Drugi sposób znacząco skrócił ścieżkę syntetyczną, jednak nie zapobiegł trudnościom związanym z oczyszczaniem odbezpieczonego produktu. Autorzy ulepszyli opisaną w literaturze cyklizację[116], skracając tym samym o trzy etapy drogę do 1.155 (Schemat 1.31). Schemat 1.31. Alternatywna metoda otrzymywania 1.145. Dalsza optymalizacja doprowadziła do alternatywnego podejścia (Schemat 1.32). Wykorzystano dostępny handlowo monochlorowany substrat 1.156, który przekształcono w N-tlenek 1.157. Do chlorowania poza standardowo stosowanym chlorkiem fosforylu, użyto dodatkowego źródła chloru w postaci soli tetraalkiloamoniowej. Umożliwiło to uzyskanie pełnej konwersji i wyeliminowanie dimerycznego produktu ubocznego. Nowa metoda pozwoliła na syntezę 1.145 w skali nawet 30 kg. Schemat 1.32. Optymalna synteza 1.145. 1.5.2 Nienukleotydowe inhibitory CD73 Odkrycie stabilnych i bardzo aktywnych nukleotydomimetyków było ogromnym sukcesem, który ma szansę odmienić życie ludzi dotkniętych chorobami nowotworowymi. Z podobieństwem związków do naturalnego substratu CD73 wiążą się jednak wspomniane wcześniej ograniczenia. Wynika stąd potrzeba poszukiwania nienukleotydowych, małocząsteczkowych inhibitorów CD73. Usunięcie silnie kwasowych oraz podatnych na rozkład metaboliczny ugrupowań umożliwiłoby poprawę biodostępności i profilu ADME potencjalnych leków. Opisano liczne małe cząsteczki hamujące działanie CD73, jednak wiele z nich działa nieselektywnie bądź posiada elementy strukturalne wykluczające wykorzystanie ich jako substancji leczniczych. Przykład mogą stanowić flawonoidy: kwercetyna[117] 1.158, bajkalina[118] 1.159 oraz jej pochodna[119] 1.160 (Schemat 1.33), które wykazały obiecujące właściwości antynowotworowe w testach in vitro, jednak nie nadawałyby się do podania ludziom. Schemat 1.33. Flawonoidy hamujące działanie CD73. Kolejnym nieselektywnym inhibitorem ektonukleotydaz jest suramina[120] 1.161 (Schemat 1.34), która była stosowana od początku XX wieku jako lek przeciwpierwotniakowy. Dalsze ograniczenia suraminy to silna toksyczność oraz bardzo słabe właściwości farmakokinetyczne. Niemniej aktywność 1.161 wskazuje na kluczową rolę grup sulfonianowych w wiązaniu z CD73. Dalsze badania pozwoliły na odkrycie kwasu 1.162, który stanowi interesujący przykład tej klasy związków[121]. Zaletami 1.162 są mała masa cząsteczkowa oraz trzy grupy funkcyjne tworzące istotne oddziaływania z enzymem. Dokowanie liganda do struktury krystalicznej CD73 wykazało znaczne podobieństwa w sposobie wiązania 1.162 oraz AMPCP. Grupa sulfonowa oddziałuje z jonami cynku w centrum katalitycznym, analogicznie do reszty fosforanowej naturalnego substratu. Dodatkowo grupa hydroksylowa wchodzi w interakcję z resztą argininową, a grupa aminowa zaangażowana jest w wiązanie wodorowe z kwasem asparaginowym. Schemat 1.34. Inhibitory CD73 posiadające grupę sulfonianową. Barwniki antrachinonowe nieselektywnie hamują działanie ektonukleotydaz, co zainspirowało naukowców do zbadania SAR i opracowania inhibitora o węższym spektrum działania[122]. Zsyntezowano 17 selektywnych ligandów, z których najsilniejszy był 1.163 zawierający podstawnik antracenowy. Usunięcie grupy sulfonianowej powodowało utratę aktywności. Związki te nie nadają się jednak do zastosowania leczniczego, ze względu na całkowitą jonizację w warunkach fizjologicznych oraz słabe parametry ADME. Bardzo interesującą strategią uniknięcia wad kwasów sulfonowych jest zastosowanie ich bioizosterów – sulfonamidów. Wirtualne badania przesiewowe wykonane przez Ripphausena i współpracowników doprowadziły do wykrycia serii sulfonamidów selektywnie działających na CD73[123]. Najaktywniejsza substancja 1.164 (Schemat 1.35) wiązała się z cynkowym centrum katalitycznym dzięki grupie sulfonamidowej, oraz podobnie jak AMPCP oddziaływała częścią heterocykliczną z resztami fenyloalaninowymi w kieszeni hydrofobowej białka. Właściwości sulfonamidów potwierdza artykuł opisujący związki oparte na motywie chromanonu, z których najaktywniejsza jest enamina 1.165[124]. Opublikowany w 2021 r. patent zawiera 38 przykładów pirymidynowych sulfonamidów, które hamowały działanie CD73[125]. Najsilniejszy inhibitor 1.166 zawiera zaskakująco wysoką liczbę atomów fluoru. Dzięki komputerowej selekcji z biblioteki zawierającej 16 milionów związków wyodrębniono cztery pochodne kwasu hydroksamowego, będących inhibitorami CD73[101]. Największą aktywność wykazywał dipodstawiony triazol 1.167. Kwasy hydroksamowe posiadają silne powinowactwo do cynku, są słabo kwaśne i dobrze rozpuszczalne w wodzie. Odkrycie inhibitorów CD73 będących sulfonamidami lub pochodnymi kwasu hydroksamowego, stworzyło fundamenty dla opracowania nowej generacji małocząsteczkowych immunoterapeutyków, które zostaną przedstawione w dalszej części tekstu. Schemat 1.35. Inhibitory CD73 zawierające inne grupy wiążące cynk. Wirtualne badania przesiewowe umożliwiły także identyfikację zbioru związków naturalnych o budowie przypominającej flawonoidy[126]. Najsilniejszy z nich 1.168 (Schemat 1.36) występuje w ekstrakcie z pospolitego grzyba – czyrenia ogniowego[127]. Dokowanie molekularne wykazało, że tricykliczny układ charakterystyczny dla tej rodziny substancji, imituje adeninę obecną w nukleotydowych inhibitorach CD73. Schemat 1.36. Naturalny inhibitor CD73 wyizolowany z czyrenia ogniowego. Do wiązania z CD73 zdolne są również cząsteczki nie posiadające ugrupowania chelatującego jony cynku. Na uwagę zasługują pirazolopirydyna[128] 1.169, spirocykliczna pochodna indolinonu[129] 1.170, oraz nieskomplikowany amid[130] 1.171 (Schemat 1.37). Schemat 1.37. Inhibitory nie zawierające ugrupowania wiążącego jony cynku. Pierwszy ze związków zsyntezowany został w ciekawej reakcji typu domino pomiędzy kromonem 1.172 i aminopirazolem 1.173 w obecności kwasu fosforowego (Schemat 1.38)[128]. Proponowany przez autorów mechanizm powstawania 1.169 rozpoczyna się od protonowania grupy karbonylowej 1.172, co prowadzi do aktywacji centrum elektrofilowego przy C2. Następnie 1.173 bierze udział w regioselektywnej addycji typu Michaela, po której pierścień kromonu ulega otwarciu. W wyniku kondensacji grup aminowej i karbonylowej powstaje docelowy układ pirazolo[3,4-b]pirydyny. Związek 1.170 otrzymano z wysoką wydajnością w trójkomponentowej reakcji pomiędzy izatyną 1.174, malononitrylem 1.175 oraz aminopirazolem 1.176 (Schemat 1.39). Substancje stapiano bez rozpuszczalnika. Wykorzystanie różnorodnie podstawionych pirazoli i izatyn umożliwiło szybkie zbudowanie biblioteki ligandów i analizę SAR. Schemat 1.38. Proponowany mechanizm reakcji domino prowadzącej do 1.168. Schemat 1.39. Multikomponentowa reakcja prowadząca do 1.170. Biorąc pod uwagę rozmiar, 4-aminopirydyna 1.171 wykazała zaskakująco duże powinowactwo do CD73. Synteza tego związku oraz analogów ograniczała się do klasycznego sprzęgania amidowego 1.177 z pochodnymi kwasu benzoesowego 1.178 (Schemat 1.40). Schemat 1.40. Sprzęganie amidowe prowadzące do 1.171. Pod względem aktywności opisane wcześniej związki nie mogą konkurować z nukleotydami imitującymi AMP. W ostatnich latach powstała jednak nowa generacja ligandów, które są nanomolarnymi inhibitorami CD73 (Schemat 1.41). Schemat 1.41. Najsilniejsze nienukleotydowe inhibitory CD73. Wyniki pomiarów aktywności dla przedstawionych substancji zebrano poniżej (Tabela 1.4). Tabela 1.4. Aktywność nienukleotydowych inhibitorów CD73[101,104,125,126,129–132]. Związek IC50 / µM 1.158 45.3 1.162 1.32 1.163* 0.15 1.164 1.90 1.165 0.287 1.166 50.1 1.167 6.2 1.168 6.72 1.169 0.32 1.170 0.15 1.171 0.25 1.179 0.028 1.194 0.012 1.207 0.015 1.215 0.072 1.227 0.004 *wartość Ki / µM PIRYDAZYNY – ELI LILLY Najważniejszy przedstawiciel nienukleotydowych związków to opracowana przez Eli Lilly pochodna pirydazyny 1.179 (Schemat 1.41), która testowana jest w I fazie badań klinicznych[133]. Żadna inna cząsteczka omawianego typu nie dotarła do tak zaawansowanego stadium rozwoju. W jednym z opisanych w patencie testów wykazano, że aktywność 1.179 wzrasta wraz z zawartością AMP w eskperymencie. Zachowanie takiego trendu in vivo byłoby korzystne, ponieważ stężenie AMP w mikrośrodowisku guza będzie rosnąć w efekcie inhibicji CD73. Na uwagę zasługuje również niewielki rozmiar 1.179 w porównaniu z konkurencyjnymi cząsteczkami o nanomolarnej aktywności. Zabezpieczony związek 1.179 otrzymano konwergentnie w reakcji Suzukiego pomiędzy centralnym biarylowym fragmentem 1.180 oraz chiralnym kwasem boronowym 1.181 (Schemat 1.42)[134]. Finalną demetylację przeprowadzono przez łagodne ogrzewanie 1.182 w wodnym roztworze kwasu solnego. Schemat 1.42. Finalny etap syntezy 1.179. Substrat 1.180 przygotowano w regioselektywnym sprzęganiu Suzukiego pomiędzy kwasem boronowym 1.183 oraz dichloropirydazyną 1.184 (Schemat 1.43). Schemat 1.43. Sposób otrzymywania biarylowego fragmentu 1.179. Najdłuższy, a zarazem najbardziej interesujący ciąg przekształceń prowadził do chiralnego kwasu boronowego 1.181 (Schemat 1.44). Naukowcy zaprojektowali ścieżkę w oparciu o łatwo dostępny aminokwas, unikając tym samym kosztownego rozdziału mieszaniny enanjomerów. Siedmioetapową syntezę wykonano w kilkuset gramowej skali. Na początku D-walinę 1.185 przekształcono z retencją konfiguracji w chloropochodną 1.186, stosując zmodyfikowane warunki Sandmayera. Alkohol 1.187 powstał w wyniku redukcji 1.186 przy użyciu LAH. Następnie w obecności wodorotlenku potasu utworzono chiralny epoksyd 1.188. Kluczowy etap polegał na diastereoselektywnej reakcji Hornera-Wadswortha-Emmonsa pomiędzy 1.188, a estrem fosfonowym 1.189 z ilościową wydajnością. Autorzy wykorzystali warunki opracowane podczas realizowanego w przeszłości projektu[135]. Zasadowa hydroliza cyklopropanu 1.190 doprowadziła do kwasu 1.191, który w sprzęganiu z 1.192 przekształcono w redoks-aktywny ester 1.193. Został on użyty do przygotowania 1.181 w dekarboksylatywnym sprzęganiu, katalizowanym przez izonikotynian etylu[136]. Schemat 1.44. Stereoselektywna ścieżka syntezy 1.181. BENZOTRIAZOLE – ARCUS BIOSCIENCES Arcus Biosciences nie ograniczył swoich badań wyłącznie do nukleotydowych inhibitorów CD73. Niezwykle aktywna pochodna benzotriazolu 1.194 (Schemat 1.41) została odkryta w efekcie metodycznej optymalizacji struktury 1.195 zidentyfikowanej w wysokowydajnych badaniach przesiewowych (Schemat 1.45)[137]. Z biblioteki 200 tysięcy związków wytypowano 9 hamujących działanie CD73. Spośród nich 1.195 był najbardziej obiecujący. Eksploracja SAR polegała na systematycznej wymianie każdego z pierścieni. Monitorowano wpływ modyfikacji nie tylko na aktywność, lecz również na stabilność chemiczną i metaboliczną. Schemat 1.45. Struktura wyjściowego związku. Ewaluacja setek cząsteczek doprowadziła do odkrycia optymalnej struktury 1.194. Ogólny sposób otrzymywania ligandów typu 1.196 na zaawansowanym etapie projektu polegał na kondensacji różnorodnych chlorowodorków arylo- lub benzylohydrazyn z głównym blokiem budulcowym 1.197 (Schemat 1.46)[138]. Schemat 1.46. Finalna kondensacja prowadząca do pochodnych 1.194. Reprezentatywną ścieżkę syntezy benzotriazolu 1.197 przedstawiono poniżej (Schemat 1.47). Związki z atomem chloru lub wodoru w miejscu fluoru przygotowywano analogicznie. Na początku wykonywano reakcję SNAR pomiędzy o-fluoronitrobenzenem 1.198 i aminoindazolem 1.199. Redukcja 1.200 przy użyciu chlorku cyny oraz następująca po niej cyklizacja prowadziły do benzotriazolu 1.201. Indazol wymagał zabezpieczenia przed kolejnymi przekształceniami, dlatego wprowadzano grupę THP. W sprzęganiu Suzukiego bromku arylowego 1.202 oraz izoprenylowego estru boronowego 1.203 powstawał alken 1.204. W następnym kroku wykonywano utleniające rozszczepienie 1.204 w warunkach Lemieux–Johnsona, stosując osmian(VI) potasu jako katalizator zamiast mniej praktycznego czterotlenku osmu. Winylogowy amid 1.197 uzyskiwano przez ogrzewanie aromatycznego ketonu 1.205 z dimetyloacetalem dimetyloformamidu (DMF-DMA). Konwergentny charakter ostatniego etapu umożliwił szybkie wygenerowanie serii analogów dla związków zawierających różne podstawniki w centralnym układzie benzotriazolu. Finalna modyfikacja cząsteczki 1.194 polegała na zamianie indazolu na benzimidazolon (1.206, Schemat 1.48). Synteza przebiegała analogicznie do zaprezentowanej dla pochodnych indazolu. Podstawienie znacznie poprawiło stabilność metaboliczną oraz obniżyło zdolność do inhibicji cytochromów, kosztem prawie czterokrotnego spadku aktywności. Wieloparametrowa optymalizacja struktury wiodącej to topos chemii leków. Dla docelowego związku istotna jest nie tylko zdolność hamowania działania celu biologicznego mierzona in vitro, lecz również stabilność i biodostępność in vivo. Biorąc pod uwagę znaczną ekspertyzę Arcus Biosciences w projektowaniu cząsteczek modulujących ścieżkę syntezy adenozyny, można mieć nadzieję, że odkryte substancje zostaną poddane dalszym ulepszeniom. Schemat 1.47. Sposób otrzymywania 1.197. Schemat 1.48. Inhibitor CD73, o optymalnym profilu działania. BENZOTIADIAZYNY – GSK Najciekawsze przykłady związków zawierających grupę sulfonamidową zostały opracowane przez GSK. Pierwszy patent opisywał 187 pochodnych benzotiadiazyny (Schemat 1.49), z których najsilniejsza była 1.207 (Schemat 1.41)[139]. Najczęściej modyfikowano fragment aryloaminowy przy C3, wykorzystując podstawione halogenami aniliny lub heteroaromatyczne aminy. Praktycznie wszystkie substancje zawierały grupę hydroksylową w miejscu R2 oraz niepodstawiony azot N4. Pozycje R3 i R5 w niektórych przypadkach posiadały chlor lub fluor, ale zazwyczaj pozostawały niepodstawione. W 89% przykładów wykorzystano halogen jako R4. Wyniki pomiaru aktywności podano jedynie dla wybranych związków, co utrudnia dokładną analizę SAR. Schemat 1.49. Benzotiadiazynowe inhibitory CD73. Szczegółowy sposób syntezy ligandów tego typu przedstawiono na przykładzie 1.207 (Schemat 1.50). Dla poszczególnych grup związków przygotowywano odpowiednio podstawione benzotiadiazyny 1.208, które modyfikowano w reakcji SNAr z aminami aromatycznymi. Schemat 1.50. Ścieżka syntezy benzotiadiazyn. Pierwszy etap polegał na utworzeniu centralnego fragmentu w wyniku reakcji izocyjanianu chlorosulfonylu (CSI) 1.209 z aniliną 1.210. Jest to niezwykle interesujący odczynnik uznawany za najbardziej reaktywny izocyjanian[140]. W omawianym przekształceniu wykorzystano obecność dwóch centrów elektrofilowych w cząsteczce CSI: w grupach sulfonylowej oraz izocyjanianowej. W niskiej temperaturze selektywnie powstawał mocznik, który po ogrzaniu w obecności chlorku glinu cyklizował w reakcji Friedla-Craftsa. Następnie poprzez ogrzewanie z bromkiem fosforylu przekształcono 1.211 w bromek 1.212. Elektrofilowe chlorowanie pozycji R4 wykonano w łagodnych warunkach z użyciem N-chlorosukcynoimidu (NCS). W pełni sfunkcjonalizowaną benzotiadiazynę 1.213 odbezpieczono przy pomocy tribromku boru. Finalny etap polegał na ogrzewaniu aminy 1.214 z 1.208. Produkty pośrednie izolowano przez strącanie wodą. Jedynie finalne związki wymagały oczyszczania metodą preparatywnej wysokosprawnej chromatografii cieczowej (RP-HPLC). SALICYLAMIDY – GSK Patent opublikowany trzy miesiące później opisuje 194 związki zawierające dwa charakterystyczne ugrupowania – sulfonamid oraz układ salicylamidu (Schemat 1.51)[132]. Najaktywniejszym przedstawicielem jest 1.215 (Schemat 1.41). Pozycja pomiędzy sulfonamidem, a benzamidem we wszystkich przykładach pozostaje niepodstawiona. Najczęściej modyfikowano część aminową sulfonamidu, w tym miejscu preferowane były bicykliczne związki heterocykliczne (53% związków zawiera indol, benzimidazol lub indazol). Najwięcej substancji to pochodne indolu z różnorodnymi podstawnikami. Pozycja R1 jest zdominowana przez alkilo- lub benzyloaminy, natomiast najpowszechniejszą dekorację R2 stanowi chlor. Jedynie dwa przykłady posiadają oba podstawniki jednocześnie. Schemat 1.51. Salicylamidowe inhibitory CD73. Sposób syntezy zaprezentowano na przykładzie najaktywniejszego liganda 1.215 (Schemat 1.52). Zastosowano klasyczne, wysokowydajne reakcje. Schemat otrzymywania był analogiczny dla wszystkich związków końcowych. W pierwszym etapie wykonano estryfikację Fischera kwasu chlorosalicylowego 1.216. Ilościowo powstały ester 1.217 poddano amonolizie poprzez ogrzewanie w metanolowym roztworze amoniaku. Salicylamid 1.218 w reakcji aromatycznej substytucji elektrofilowej (SEAr) z kwasem chlorosulfonowym w obecności chlorku tionylu przekształcono w chlorek sulfonowy 1.219. Wszystkie etapy przeprowadzano bez oczyszczania. Schemat 1.52. Ścieżka syntezy salicylamidowych inhibitorów CD73. Reakcja 1.219 z różnorodnymi aminami prowadziła do docelowych sulfonamidów. W przypadku 1.215 wykorzystano pochodną indolu 1.220, którą przygotowano z 1.221 poprzez redukcję grupy nitrowej. Niewielka wydajność ostatniej transformacji związana jest z oczyszczaniem metodą RP-HPLC. Warto zwrócić uwagę na w pełni podstawiony związek 1.222 oraz zawierający etanoloaminę 1.223 (Schemat 1.53). Autorzy nie podali dla nich wyników aktywności biologicznej, jednak są istotne ze względu na duże podobieństwo do najsilniejszych substancji opisanych w trzecim patencie wydanym przez GSK. Schemat 1.53. Przykłady nawiązujące do makrocyklicznych sulfonamidów. MAKROCYKLE – GSK Imponującą kontynuacją historii salicylamidów odkrytych przez GSK, jest opublikowany w 2019 r. patent opisujący 62 makrocykliczne inhibitory CD73[141]. Większość cząsteczek zawiera 16-członowy pierścień z różnorodnymi łącznikami związanymi jednym końcem z grupą sulfonamidową, a drugim z sąsiadującą z nią aminą (1.224, Schemat 1.54). Schemat 1.54. Makrocykliczne salicylamidy. Najpopularniejszym fragmentem połączonym z sulfonamidem (X) jest różnie podstawiony 3-metylobenzen (1.225), który występuje w 68% przypadków. W 9 przykładach w tej pozycji znajduje się układ indolu. Najbardziej preferowany łącznik P-Z-Y to dialkilowy eter obecny w 24% związków (1.226). Tylko 5 substancji zawiera podstawnik R2, w tym najaktywniejszy reprezentant 1.227 (Schemat 1.41). W oparciu o benzylowy fragment P (1.228) zaprojektowano 14 substancji. Ograniczenie swobody rotacji jest powszechnie stosowaną strategią prowadzącą do zwiększenia aktywności cząsteczek. Aby związać się z białkiem ligand musi przyjąć odpowiednią konformację wymuszoną przez strukturę miejsca aktywnego. Gdy liczba możliwych stanów jest ograniczona, maleje koszt entropowy wiązania. Makrocykle pomimo ograniczonej rotacji, nie są całkowicie sztywne. Odpowiednia budowa łącznika pozwala na stabilizację liganda w konformacji dopasowanej do interakcji z białkiem i znacznie poprawia aktywności w porównaniu z acykliczną cząsteczką[142]. Do syntezy 1.227 oraz analogów wykorzystano metodologię opracowaną w poprzednim patencie (Schemat 1.55). Kwas salicylowy 1.229 uzyskano z kwasu benzoesowego 1.230 w reakcji SNAr. Estryfikacja Fischera i następująca po niej amonoliza estru 1.231 doprowadziła do benzamidu 1.232. Wprowadzenie grupy sulfonowej wymagało drastycznych warunków ze względu na obecność fluoru. Powstały chlorek sulfonowy 1.233 mógł być modyfikowany z użyciem różnorodnych grup, które na koniec spajano w finalny łańcuch. Omówione podejście umożliwia konwergentną konstrukcję makrocykli. Modyfikację 1.233 rozpoczęto od reakcji z zawierającą fragment łącznika pochodną indolu 1.234 (Schemat 1.56). Sulfonamid 1.235 w reakcji SNAr z aminą 1.236 utworzył substrat do makrocyklizacji 1.237. Schemat 1.55. Synteza chlorku sulfonowego 1.233. Metateza z wykorzystaniem nowoczesnego katalizatora doprowadziła do mieszaniny olefin 1.238., która nie była rozdzielana. Docelowy produkt 1.227 powstał po katalizowanym palladem uwodornieniu. Schemat 1.56. Otrzymywanie makrocyklu 1.227. Podobnie jak w przypadku poprzednich patentów, aktywności podano jedynie dla wybranych związków. Autorzy nie opisują wyników testów in vivo, co uniemożliwia szczegółową ewaluację substancji. Pomimo upływu dwóch lat od ostatniej publikacji, nie pojawiły się żadne doniesienia literaturowe lub konferencyjne wskazujące na kontynuację badań nad tą serią inhibitorów. Biorąc pod uwagę działalność konkurencyjnych grup badawczych, można stwierdzić że GSK prawdopodobnie porzuciło projekt. 1.5.3 Inhibitory CD39 Inhibicja CD39 jest alternatywnym podejściem do obniżenia stężenia adenozyny w mikrośrodowisku guza. Zasadność tej strategii wynika z dualnej roli CD39 w immunosupresji. Poprzez katalizowanie konwersji ATP do AMP, enzym nie tylko dostarcza substratu do syntezy adenozyny, lecz również obniża stężenie immunostymulującego ATP. W porównaniu do CD73 poznano niewiele selektywnych małocząsteczkowych inhibitorów CD39. Jedynymi substancjami testowanymi kliniczne są mAb. Opisane do tej pory cząsteczki można podzielić na nukleotydomimetyki oraz związki nienukleotydowe. Najpopularniejszy nukleotydowy inhibitor CD39 to odkryty w 1995 r. ARL67156 1.239 (Schemat 1.57)[143]. Cząsteczka miała znaleźć zastosowanie jako narzędzie do badania ektonukleotydaz i receptorów purynowych. Związek jest analogiem ATP o zwiększonej odporności na hydrolizę, dzięki wprowadzeniu grupy dibromometylenowej w miejsce atomu tlenu reszty fosforanowej. Co ciekawe, dopiero w 2020 r. zbadano SAR 1.239, co doprowadziło do odkrycia nowych substancji o podobnej charakterystyce (1.240, 1.241)[144]. Dalsze eksperymenty wykazały brak stabilności metabolicznej związku wyjściowego i analogów. Do tej grupy należy także pochodna AMP 1.242[145]. Wspomniane wcześniej suramina oraz pochodne antrachinonowych barwników (1.243) również słabo działają na CD39. Kolejnym przedstawicielem nienukleotydowych inhibitorów jest iminowa pochodna tryptaminy 1.244[146], która podobnie jak nukleotydy nie byłaby stabilna metabolicznie. W 2021 r. odkryto dualną inhibicję CD73 i CD39 przez kwas elagowy 1.245[147]. Wykazano także, że nieorganiczne kompleksy metali zwane polioksometalanami nieselektywnie hamują działanie CD39[148]. Polioksometalany okazały się przydatne w modelowych badaniach biologicznych, jednak nie mają zastosowania farmakologicznego ze względu na działanie uboczne na przewodnictwo synaptyczne[149]. Aktywności wspomnianych substancji przedstawiono poniżej (Tabela 1.5). Pomimo znacznego wkładu omówionych związków w zrozumieniu biologii CD39, nadal nie istnieje obiecujący kandydat o potencjale terapeutycznym. Schemat 1.57. Przykłady inhibitorów CD39. Tabela 1.5. Aktywność inhibitorów CD39[144,147]. Związek Ki / µM 1.239 11.0 1.240 1.13 1.241 1.51 1.242 0.8 1.243 0.33 1.244 0.021 1.245* 0.50 *wartość IC50 / µM 2 BADANIA WŁASNE Przytoczony we wstępie przegląd literatury naukowej i patentowej uzasadnia potrzebę poszukiwania nowych, małocząsteczkowych substancji, które modulowałyby immunosupresyjny szlak adenozyny. Obiecujące wyniki początkowych stadiów badań klinicznych z udziałem inhibitorów CD73 i antagonistów A2AR/A2BR motywują do projektowania doskonalszych immunoterapeutyków. Opracowanie substancji z tej kategorii wiąże się z pracą na fundamentach naukowych zbudowanych przez pionierów i skupia się na udoskonalaniu charakterystyki produktu leczniczego (tzw. strategia best-in-class). Z omówionej literatury wynika, że nadal nie odkryto silnych i selektywnych inhibitorów CD39, które byłby małymi cząsteczkami. Jedyne skuteczne substancje to mAb, posiadające liczne, omówione wcześniej wady. Badania w tej domenie niosą ze sobą zdecydowanie większe ryzyko (strategia. first-in-class). Analiza wspomnianych źródeł i profil firmy Ryvu Therapeutics, która opracowuje innowacyjne terapie onkologiczne, zainspirowały mnie do realizacji projektu związanego z wszystkimi trzema celami biologicznymi: A2AR, CD73 i CD39. Takie podejście oferowało bardzo korzystny bilans ryzyka: jedna trzecia zasobów została poświęcona na działalność o mniejszej szansie powodzenia, a dwie trzecie na eksplorację lepiej poznanego obszaru. Głównym celem mojej pracy wdrożeniowej była synteza i charakterystyka nowych związków, zaprojektowanych w oparciu o poszukiwania literaturowe, analizę wyników HTS i dotychczasowe doświadczenie zgromadzone w Ryvu. Odkryte substancje miały przyczynić się do opracowania terapii immunoonkologicznej przez Ryvu. 2.1 Synteza inhibitorów CD73 W części badawczej poświęconej inhibicji CD73 zdecydowałem się na syntezę nienukleotydowych cząsteczek, ze względu na ich korzystniejszy profil farmakologiczny w porównaniu z nukleotydomimetykami[104]. Pracę eksperymentalną rozpocząłem od syntezy wybranych przykładów opisanych we wstępie literaturowym jako referencyjnych inhibitorów CD73 (Schemat 2.1). Wybrałem związki z trzech źródeł: dwóch patentów GSK[132,139] oraz artykułu o wirtualnych badaniach przesiewowych[123]. Postanowiłem również przygotować dwie substancje nie zawierające grupy sulfonamidowej[128,130]. Synteza związków z literatury przebiegła zgodnie z wcześniej zaprezentowanymi schematami (Schemat 1.38, Schemat 1.40, Schemat 1.50, Schemat 1.52). Schemat 2.1. Referencyjne inhibitory CD73. Produkty zostały poddane testom aktywności biologicznej, których wyniki przedstawiłem poniżej (Tabela 2.1). Najbardziej zaskakującym rezultatem był brak inhibicji CD73 przez 1.169 oraz 1.171. Publikacje opisujące oba związki posiadają wspólnych autorów, co może wskazywać na błędną metodologię pomiaru IC50. Pochodna kumaryny 1.164 hamowała działanie CD73, jednak znacznie słabiej niż podano w artykule. Natomiast wyniki uzyskane dla sulfonamidów opracowanych przez GSK są spójne z danymi zawartymi w patentach. Aktywności dla wybranych substancji obrazują SAR dla benzotiadiazyn oraz salicylamidów. Benzotiadiazyny działają silniej niż acykliczne sulfonamidy, Jednak jest to związane z wyższą lipofilowością. Wartości efektywności lipofilowej LLE (LLE = pIC50 – cLogP) dla wszystkich salicylamidów są wyższe od najaktywniejszej benzotiadiazyny 2.1. Atom chloru w pozycji R4 dwukrotnie poprawia aktywność 2.2 względem 2.3, co wyjaśnia dlaczego występuje w 74% przykładów podanych w patencie. Obecność grupy hydroksylowej w pozycji R2 jest kluczowa dla wysokiej aktywności, czego dowód stanowi prawie dwukrotny spadek LLE dla 2.4. Salicylamid 1.215 jest najsilniejszym przedstawicielem serii. Porównanie 2.5 oraz 2.6 obrazuje, że orientacja podstawnika anilinowego jest istotna. Różnice pomiędzy sulfonamidami związanymi z indolem 2.5, indazolem 2.7 oraz benzimidazolem 2.8 są niewielkie i ściśle związane z lipofilowością fragmentu anilinowego. Pozbawiony pierścienia heterocyklicznego 2.9 wykazał najmniejszą aktywność. Tabela 2.1. Aktywność referencyjnych inhibitorów CD73. Związek IC50 / µM LLE 2.1 0.72 3.30 2.2 1.81 2.53 2.3 3.57 2.84 2.4 35.19 1.55 1.215 2.69 4.36 2.5 3.85 3.66 2.6 6.18 3.45 2.7 4.05 4.41 2.8 3.36 4.94 2.9 8.24 3.58 1.164 116.44 1.92 1.169 >400 - 1.171 >400 - Powyższa analiza wytyczyła dalszy kierunek moich badań – postanowiłem zająć się opracowaniem nowych, patentowalnych związków poprzez modyfikację 2.1 oraz 2.5. Podstawą do projektowania inhibitorów stała się struktura krystaliczna 2.5 związanego z CD73, którą uzyskano w Ryvu (Rysunek 2.1). Należy zwrócić uwagę na kluczowe wiązania wodorowe pomiędzy: indolem i Pro-416; grupą amidową i Ser-48 oraz sulfonamidem, a Ile-91 i Gln-523. Część arylowa indolu oddziałuje elektrostatycznie z kationem Lys-50. Poza tym fragment salicylamidowy zaangażowany jest w sieć oddziaływań z cząsteczkami wody. Krystalizacja dla przedstawicieli benzotiadiazyn nie powiodła się, dlatego dział chemii obliczeniowej Ryvu wykonał dokowanie molekularne ligandów do struktury krystalicznej CD73. Jako modelową cząsteczkę wybrałem 2.2 ( Rysunek 2.2). Rysunek 2.1. Oddziaływania w strukturze krystalicznej kompleksu 2.5 z CD73. Wśród najważniejszych interakcji 2.2 z CD73 można wyróżnić: wiązania wodorowe grup hydroksylowej i aminowej z Asp-506, wiązanie wodorowe grupy sulfonamidowej z Arg-354 oraz oddziaływania π pomiędzy Phe-417 i Phe-500, a fragmentem anilinowym. Rysunek 2.2. Najważniejsze oddziaływania pomiędzy 2.2, a CD73. Nowe inhibitory zostały zaprojektowane tak, aby zachować zobrazowane powyżej kluczowe oddziaływania, a zarazem posiadać unikalną budowę. W pierwszym etapie skupiłem się na modyfikacji serii salicylamidów, które wydawały się bardziej obiecujące z powodu uzyskanej struktury krystalicznej oraz wyższych wartości LLE. 2.1.1 Modyfikacja salicylamidów Jako związek modelowy wybrałem 2.7, ze względu na zbliżoną aktywność do 2.5 oraz bardziej preferowane właściwości indazolu. Strategia opracowania nowych inhibitorów CD73 bazujących na 2.7 obejmowała modyfikacje trzech głównych części cząsteczki: sulfonamidu (C), salicylamidu (A), oraz pierścienia fenylowego (B), który łączył obie grupy funkcyjne (Schemat 2.2). Schemat 2.2. Główne kierunki modyfikacji serii salicylamidów. Na początku zająłem się zmianami części C, w celu określenia minimalnego aktywnego fragmentu związku. Wszystkie cząsteczki otrzymałem w katalizowanej DMAP jednoetapowej reakcji z chlorkiem sulfonowym 2.10 (Schemat 2.3). Schemat 2.3. Wstępne modyfikacje części sulfonamidowej wraz z wydajnościami. Niska wydajność niektórych przekształceń związana była z powstawaniem produktu ubocznego typu 2.11 i oczyszczaniem metodą RP-HPLC. Związki 2.12, 2.13 oraz 2.14 miały wykazać, czy sulfonamid pozbawiony fragmentu arylowego zachowa aktywność. Następne przykłady, to pochodne 2.9: niepodstawiona grupą metoksylową 2.15 oraz metylowana 2.16. Jedynym związkiem, który hamował działanie CD73 był 2.15 (IC50 = 15.35 µM, LLE = 3.16). Ostatnie substancje z tej serii, to sulfonylobenzamid 2.17, sulfonian fenylu 2.18 oraz pochodna pirazolu 2.19. Żadna z nich nie wykazała aktywności. Kolejne modyfikacje, które wykonałem oparte były na obiecujących wynikach dokowania molekularnego do struktury krystalicznej 2.5 (Rysunek 2.3). W patencie nie opisano żadnych alkilowych sulfonamidów. Każda z substancji pomimo znacznych różnic strukturalnych, zachowywała jedno oddziaływanie widoczne dla 2.5. Sulfonamidy zawierające indolinę 2.20 oraz fenyloazetydynę 2.21, pomimo przesunięcia pierścienia fenylowego wykazały oddziaływanie kation-π z Lys-50. Pochodna piperydyny 2.22 dzięki obecności grupy karboksylowej tworzyła mostek solny z Lys-50. Natomiast dokowanie imidazolidynonu 2.23 ukazało wiązanie wodorowe z Pro-416. Wszystkie substancje otrzymałem w reakcjach odpowiednich nukleofili z 2.10. Niestety żadna z nich nie wykazała aktywności, co wskazuje na dużą konserwatywność interakcji tworzonych z białkiem przez aminową część sulfonamidu. Rysunek 2.3. Najważniejsze oddziaływania pomiędzy CD73, a ligandami 2.20-2.23. Sposób syntezy aminy 2.24 potrzebnej do przygotowania 2.21 opisano w literaturze (Schemat 2.4)[150]. Styren 2.25 oraz CSI uległy spontanicznej cykloaddycji [2+2] w temperaturze pokojowej z utworzeniem produktu pośredniego 2.26, którego nie izolowałem. Redukcja laktamu 2.27 przy użyciu LAH, doprowadziła do pożądanej aminy 2.24. Schemat 2.4. Cykloaddycja styrenu i CSI prowadząca do 2-fenyloazetydyny. Ostatnie zmiany, które wprowadziłem w części C polegały na syntezie izomerycznego związku 2.28 oraz benzamidu w miejscu sulfonamidu 2.29 (Schemat 2.5). Przykład 2.28 wybrałem jako bezpośredni analog 2.9. Także w tym przypadku żadna z substancji nie hamowała działania CD73. Schemat 2.5. Modyfikacja połączenia sulfonamidowego. W obliczu nieskutecznej modyfikacji fragmentu sulfonamidowego, skupiłem się na metodycznym poszukiwaniu bioizosterów zastrzeżonej w patencie części A. Rozpocząłem od syntezy związków posiadających w miejscu grupy amidowej inny donor wiązania wodorowego. Wyniki dokowania wskazywały na występowanie oddziaływania z Ser-48 (analogicznie do 2.5) lub alternatywnego z Glu-42. Potrzebne chlorki sulfonowe i sulfonamidy przygotowałem w takich samych warunkach jak poprzednio. Pierwsza grupa związków zawierała układ 2-aminofenolu 2.30, który otrzymałem poprzez redukcję grupy nitrowej w 2.31 (Schemat 2.6, Schemat 2.7). Jednoetapowa derywatyzacja 2.30 doprowadziła do: acetamidu 2.32, sulfonamidu 2.33, sulfamidu 2.34 oraz mocznika 2.35 (Schemat 2.7). Struktury przedstawiłem poniżej (Schemat 2.8). Schemat 2.6. Synteza 2.30. Schemat 2.7. Sposób otrzymywania pochodnych 2-aminofenolu. Schemat 2.8. Modyfikacje grupy amidowej. Kolejne związki wywodzą się z kwasu salicylowego 2.36. Amid 2.37 przygotowałem w reakcji chlorku kwasowego z metyloaminą (Schemat 2.9), natomiast alkohol 2.38 był produktem redukcji estru 2.39 (Schemat 2.10). Schemat 2.9. Synteza amidu 2.37. Schemat 2.10. Synteza alkoholu 2.38. Następna seria bioizosterów powstała z nitrylu 2.40 (Schemat 2.11). W katalizowanej palladem redukcji utworzyłem aminę 2.41. Reakcja 2.40 z chlorowodorkiem hydroksyloaminy doprowadziła do amidoksymu 2.42, natomiast tetrazol 2.43 otrzymałem w wyniku cykloaddycji 2.40 z azydkiem sodu. Schemat 2.11. Przygotowanie pochodnych 2.40. Dalsze modyfikacje dotyczyły grupy karbonylowej salicylamidu. W wyniku ogrzewania 2.6 z odczynnikiem Lawessona powstał tioamid 2.44 (Schemat 2.12). Synteza amidyny 2.45 wymagała większego nakładu pracy. Na początku nitryl 2.46 poddałem reakcji SNAr z oksymem acetonu. Ogrzewanie 2.47 w kwaśnym środowisku umożliwiło cyklizację, w której powstał interesujący związek pośredni 2.48. Docelową amidynę 2.45 uzyskałem poprzez redukcję pierścienia aminoizoksazolu 2.48. Schemat 2.12. Modyfikacje grupy karbonylowej salicylamidu. Ostatnie dwa przykłady to pochodne pirazolu, które przygotowałem w reakcji Suzukiego zabezpieczonego fenolu 2.49 z kwasami boronowymi 1.110 i 2.50 (Schemat 2.13). Odbezpieczenie związków 2.51 oraz 2.52 przy użyciu tribromku boru dało odpowiednio 2.53 i 2.54. Schemat 2.13. Wprowadzanie pierścienia pirazolu w reakcji Suzukiego. Dla cząsteczek, które otrzymałem wykonano pomiary IC50, sprawdzono też działanie związku pośredniego 2.48. Wyniki dla aktywnych ligandów zebrałem poniżej (Tabela 2.2). Wprowadzone modyfikacje znacząco pogorszyły działanie substancji w porównaniu do 2.7. Biorąc pod uwagę różnorodność przetestowanych podstawników, postanowiłem pozostawić grupę amidową i sprawdzić czy jest możliwa zamiana fenolu na inne ugrupowanie bez konsekwencji dla powinowactwa do CD73. Tabela 2.2. Aktywne bioizostery amidu. Związek IC50 / µM LLE 2.7 4.05 4.41 2.44 6.1 2.57 2.42 47.2 3.93 2.43 52.4 3.52 2.40 100 2.66 2.45 100 3.88 2.54 102 2.64 Na początku dokonałem ewaluacji dostępnych handlowo bioizosterów fenolu 2.55-2.58 (Schemat 2.14). Żaden z nich nie wykazał aktywności. Schemat 2.14. Komercyjne pochodne salicylamidu. Następnie przygotowałem alkohol benzylowy 2.59, który powstał w wyniku amonolizy ftalidu 2.60 (Schemat 2.15). Natomiast reakcja SNAR wodnego roztworu amoniaku z fluorobenzamidem 2.61 doprowadziła do aniliny 2.62. W obu przypadkach sulfonamidy otrzymałem z komercyjnych chlorków sulfonowych. W testach biologicznych zarówno 2.59 jak i 2.62 nie wykazały żadnego powinowactwa do CD73. Na podstawie dotychczas uzyskanych wyników uznałem, że szanse na udaną modyfikację tego fragmentu cząsteczki są niewielkie. Schemat 2.15. Sposób przygotowania analogów fenolu. Ostatnia seria zmian w części A salicylamidu bazowała na optymistycznych wynikach dokowania molekularnego. Zgodnie z nimi pochodne indazolu 2.63 oraz benzimidazolu 2.64 zachowują wszystkie oddziaływania widoczne w strukturze krystalicznej 2.5 (Rysunek 2.4). Rysunek 2.4. Modelowy sposób wiązania 2.63 oraz 2.64 z CD73. Ze względu na drastyczne warunki chlorosulfonowania, synteza obu związków wymagała zastosowania nowego sposobu przygotowania chlorków sulfonowych. Na podstawie przeglądu literatury opracowałem ścieżkę syntetyczną, w której kluczowym etapem było utlenianiu tioeteru do chlorku sulfonowego przy użyciu NCS[151] (Schemat 2.16). Pierwsze przekształcenie polegało na katalizowanym palladem sprzęganiu merkaptanu benzylu 2.65 z bromoindazolem 2.66[152]. W kolejnym etapie z kwasu 2.67 utworzyłem amid 2.68 stosując TBTU i eterowy roztwór amoniaku. Utleniające chlorowanie sulfidu doprowadziło do pożądanego chlorku sulfonowego 2.69, który reagował w standardowych warunkach z aminą 1.199. Synteza 2.63 potwierdziła skuteczność nowej metodologii, która mogła posłużyć do otrzymywania sulfonamidów o bardziej skomplikowanej budowie. Schemat 2.16. Synteza 2.63. Przygotowanie benzimidazolu 2.64 rozpocząłem od cyklizacji o-fenylenodiaminy 2.70 z ortomrówczanem metylu (Schemat 2.17). W następnym kroku wykonałem sprzęganie 2.71 z 2.65 w takich samych warunkach jak dla indazolu 2.66. Przekształcenie sulfidu 2.72 w chlorek sulfonowy przy użyciu opracowanej wcześniej metody nie powiodło się, prawdopodobnie ze względu na większą zasadowość benzimidazolu. Optymalizacja tego etapu polegała na wykorzystaniu wodnego roztworu chlorku amonu i acetonitrylu zamiast rozcieńczonego kwasu octowego[153]. Dodatkowo pirydynowy roztwór 1.199 dodałem bezpośrednio do mieszaniny reakcyjnej po osiągnięciu pełnej konwersji tworzenia chlorku sulfonowego. W ten sposób z dobrą wydajnością otrzymałem sulfonamid 2.73, który przekształciłem w reakcji z amoniakiem w docelowy produkt 2.64. Schemat 2.17. Otrzymywanie 2.64. Ponadto postanowiłem zsyntezować indazol 2.74 z grupą amidową w pozycji C3 (Schemat 2.18) oraz pochodną ftalazyny 2.75 (Schemat 2.19). Indazol przygotowałem w sekwencji analogicznej do powyższych, wychodząc z estru 2.76. Utlenianie sulfidu 2.77 z dobrą wydajnością doprowadziło do chlorku sulfonowego 2.78, który przekształciłem w sulfonamid 2.79. Ostatni etap polegał na amonolizie. Opracowane warunki sprzęgania z 2.65 okazały się optymalne. Reakcja przebiegała z dobrą wydajnością w obecności niezabezpieczonych amin heterocyklicznych, czy wolnego kwasu. Schemat 2.18. Sposób przygotowania 2.74. Ligand 2.75 zsyntezowałem w reakcji kondensacji estru ftalowego 2.80 z hydrazyną. Sulfonamid 2.80 otrzymałem w standardowych warunkach z komercyjnego chlorku sulfonowego. Schemat 2.19. Metoda otrzymywania ftalazyny 2.75. Wszystkie związki z ostatniej serii okazały się nieaktywne. Zgromadzone wyniki wskazują na bardzo istotną rolę układu salicylamidu w inhibicji CD73. Może to być związane z tworzeniem wewnątrzcząsteczkowego wiązania wodorowego, które jest charakterystyczne dla ugrupowań tego typu[154]. Analiza widma 1H NMR zmierzonego dla 2.7, potwierdziła duże zaangażowanie grupy hydroksylowej w oddziaływanie z amidową grupą karbonylową – fenolowy proton (δ 13.37 ppm) był niezwykle mocno przesunięty w dół pola (Rysunek 2.5). Zdecydowałem się pozostawić część salicylamidową bez zmian. Rysunek 2.5. Widmo 1H NMR 2.7 (DMSO-d6). Do modyfikacji pozostała mi jedynie część B, czyli wolne pozycje C3, C4, C6 pierścienia fenylowego, będącego łącznikiem pomiędzy salicylamidowym i sulfonamidowym farmakoforem. Priorytetem była wymiana benzenu na pirydynę, co pozwoliłoby na uzyskanie swobody patentowej. Dodatkowo chciałem zbadać wpływ nieobecnych w patencie podstawników w pozycji C6. Dokowanie molekularne zaprojektowanych ligandów nie wskazało nowych interakcji, jednak potwierdziło zachowanie oddziaływań widocznych dla 2.5. Nowe związki przedstawiłem poniżej (Schemat 2.20). Schemat 2.20. Modyfikacje pierścienia fenylowego. Heterocykliczne pochodne sulfonamidów 2.81-2.84 otrzymałem z odpowiednich halogenków arylowych stosując opisaną wcześniej metodę utleniania tioeterów. Pirydynę 2.85 przygotowałem ze względu na interesujące właściwości podstawnika difluorometylowego, który może być rozpatrywany jako lipofilowy bioizoster grupy hydroksylowej[155]. Dostępność chlorku sulfonowego umożliwiła szybką ewaluację tej hipotezy. Punktem wyjścia dla syntezy 2.86 było przekształcenie nikotynianu 2.87 w chlorek sulfonowy 2.88 (Schemat 2.21). Następnie utworzyłem sulfonamid 2.89 stosując TEA w układzie DMA/dioksan, ponieważ chlor przy C2 ulegał reakcjom ubocznym w klasycznych warunkach z pirydyną. W reakcji z metanolanem sodu wprowadziłem zabezpieczoną grupę hydroksylową. Ester 2.90 poddałem amonolizie, a powstały amid 2.91 odbezpieczyłem poprzez ogrzewanie w roztworze kwasu solnego. Związek 2.92 przygotowałem z uzyskanego wcześniej 2.89 w reakcji amonolizy. Schemat 2.21. Synteza 2.86. Syntezę 2.93 rozpocząłem od przekształcenia komercyjnego chlorku sulfonowego 2.94 w sulfonamid 2.95 (Schemat 2.22). Amonoliza 2.95 przebiegła z bardzo niską konwersją, ze względu na zatłoczenie steryczne wokół grupy karboksylowej. Dużą niespodziankę stanowiło powstanie 2.96 jako jedynego produktu. Strukturę potwierdziłem wykonując widmo NOESY, które wykazało korelację pomiędzy grupą metoksylową, a protonem przy C3 (Rysunek 2.6). Postanowiłem uzyskać 2.93 w inny sposób, przy okazji potwierdzając budowę 2.96 ortogonalną metodą. Punkt wyjścia dla drugiej ścieżki stanowiła pochodna kwasu salicylowego 2.97, którą przekształciłem w chlorek kwasowy, a następnie w amid 2.98. W reakcji chlorosulfonowania regioselektywnie powstał chlorek sulfonowy 2.99. Sulfonamid 2.96 utworzyłem z bardzo wysoką wydajnością. Widma 1H NMR 2.96 uzyskanego różnymi metodami były identyczne. Warto zwrócić uwagę na niezwykłe przesunięcie grupy hydroksylowej w kierunku niższego pola (δ 16.02 ppm). Finalne odbezpieczenie eteru metylowego przy użyciu tribromku boru doprowadziło do 2.93. Schemat 2.22. Sposób przygotowania 2.93 oraz 2.96. Sulfonamid 2.100 z grupą metylową w pozycji C6 otrzymałem w trzech etapach (Schemat 2.23). Chlorosulfonowanie benzamidu 2.101 przebiegło regioselektywnie z dobrą wydajnością. Strukturę produktu potwierdziłem przy pomocy widma NOESY po przeprowadzeniu reakcji chlorku sulfonowego 2.102 z 1.199 (Rysunek 2.6). Pożądany salicylamid otrzymałem po odbezpieczeniu 2.103. Schemat 2.23. Synteza 2.100. Pierwszy etap syntezy 2.104 polegał na przekształceniu kwasu 2.105 w symetryczny amid 2.106 (Schemat 2.24). Przygotowanie chlorku sulfonowego 2.107 wymagało drastycznych warunków ze względu na silną dezaktywację pierścienia aromatycznego przez dwa atomy fluoru. Sulfonamid 2.108 poddałem reakcji SNAr z wodą jako nukleofilem, wykorzystując warunki opisane w literaturze dla o-fluorobenzamidu[156]. Rysunek 2.6. Widma NOESY 2.96 oraz 2.103. Niestety w reakcji oprócz pożądanego produktu 2.104 powstał również izomer 2.109, którego nie udało się oddzielić metodą RP-HPLC. Postanowiłem użyć alkoholu benzylowego jako rozbudowanego sterycznie nukleofila, który będzie preferencyjnie atakował mniej zatłoczoną pozycję C2. Nowa strategia umożliwiła otrzymanie zabezpieczonego salicylamidu 2.110 z wydajnością wystarczającą do przeprowadzenia finalnego odbezpieczenia przy użyciu wodoru. Strukturę 2.104 potwierdziłem przez porównanie z uzyskanym wcześniej widmem 1H NMR mieszaniny izomerów. Schemat 2.24. Otrzymywanie 2.104. Wszystkie związki zawierające zmodyfikowaną część B (Schemat 2.20) zostały poddane testom aktywności biologicznej. Wyniki dla aktywnych przykładów przedstawiłem poniżej (Tabela 2.3). Wprowadzenie podstawnika w pozycji C6 znacząco osłabiało powinowactwo do CD73. Przesunięcie donora wiązania donorowego z pozycji C2 na C3 (2.86, 2.83) powodowało utratę aktywności. Efektywność lipofilowa jest przydatnym sposobem ewaluacji ligandów o zróżnicowanej aktywności i lipofilowości[157,158]. Najbardziej interesującymi kandydatami do rozwoju są jak najbardziej aktywne cząsteczki o niskiej lipofilowości, co przekłada się na wysokie wartości LLE. Na tej podstawie można stwierdzić, że 2.82 zawierający atom azotu zamiast C4 działa porównywalnie do 2.7. Co ciekawe 2.84 w przeciwieństwie do 2.92 hamował działanie CD73 pomimo wymiany grupy hydroksylowej na aminową. Ze względów biznesowych porzuciłem rozwój tej serii związków. Tabela 2.3. Aktywne inhibitory ze zmodyfikowaną częścią B. Związek IC50 / µM LLE 2.7 4.05 4.41 2.82 15.13 4.46 2.84 132.31 4.28 2.81 15.66 4.07 2.104 48.60 3.19 2.93 72.06 2.81 2.1.2 Makrocyklizacja salicylamidów Ostatnią modyfikacją salicylamidów, którą wykonałem była makrocyklizacja. Jako związek wyjściowy wytypowałem 2.15 (Schemat 2.3). We współpracy z działem chemii obliczeniowej Ryvu zaprojektowane zostały 4 serie makrocyklicznych ligandów, które poddano ewaluacji na podstawie dokowania molekularnego (Schemat 2.25). Schemat 2.25. Podział zaprojektowanych związków ze względu na lokalizację łącznika. Najlepsze wyniki uzyskały związki typu A i B (2.111-2.113, Schemat 2.26), które zachowały wszystkie najważniejsze oddziaływania z CD73 (Rysunek 2.7). Schemat 2.26. Najbardziej obiecujące makrocykle. Ostatnim filtrem zastosowanym do wytypowania substancji do syntezy był poziom skomplikowania struktury. Wybrałem cząsteczkę 2.113, ponieważ uznałem że najszybciej umożliwi weryfikację przyjętej hipotezy. Rysunek 2.7. Oddziaływania 2.113 z CD73. Kluczowy etap makrocyklizacji 2.113 polegał na reakcji SNAr pomiędzy alkoholem, a fluorkiem arylowym, opartej o analogiczny przykład znaleziony w literaturze (Schemat 2.27)[159]. Schemat 2.27. Literaturowy przykład cyklizacji SNAr. Pełną analizę retrosyntetyczną dla 2.113 przedstawiłem poniżej (Schemat 2.28). Difluorobenzamid 2.114 ulegał dwóm następującym po sobie reakcjom SNAr, które prowadziły kolejno do 2.115 i 2.113. Przygotowanie 2.114 wymagało syntezy chlorku sulfonowego 2.116 oraz aniliny 2.117. Amina 2.117 mogła zostać otrzymana poprzez redukcję grupy nitrowej w 2.118, który powstał w wyniku alkilowania fenolu 2.119 przy użyciu bromopropanolu 2.120. Natomiast 2.116 był produktem chlorosulfonowania benzamidu 2.121. Schemat 2.28. Retrosynteza 2.113 – podejście SNAr. Następnie przystąpiłem do syntezy 2.113 zgodnie z zaprezentowanym planem. Przygotowanie aniliny 2.117 przebiegło bez problemu z bardzo dobrą wydajnością (Schemat 2.29). Otrzymanie drugiego substratu okazało trudniejsze. Chlorosulfonowanie silnie zdezaktywowanego 2.121 wymagało wysokiej temperatury, co przyczyniło się do powstania znacznej ilości kwasu 2.122. Mieszaninę chlorków sulfonowych przekształciłem w sulfonamid 2.114 oraz jego zhydrolizowany analog, który poddałem sprzęganiu amidowemu z amoniakiem. Schemat 2.29. Podejście SNAr do syntezy 2.113 – przygotowanie substratów. Etap makrocyklizacji okazał się problematyczny – literaturowe warunki nie doprowadziły do pożądanego produktu (Schemat 2.30). Próbowałem je zmodyfikować lub zastosować opisany wcześniej układ KOH/DMSO (Schemat 2.24) w różnych temperaturach, jednak bez sukcesu. Schemat 2.30. Podejście SNAr do syntezy 2.113 – makrocyklizacja. Uznałem, że problem może stanowić obecność drugiego atomu fluoru, który wykazuje podobną reaktywność. Zweryfikowałem tę hipotezę poprzez reakcję z alkoholem benzylowym w warunkach wykorzystanych do syntezy 2.110 (Schemat 2.31). Oczekiwany produkt 2.123 powstał regioselektywnie, a jego strukturę potwierdziłem na podstawie zmiany widma 1H NMR w porównaniu z substratem. Próba utworzenia 2.124 również się nie powiodła. Schemat 2.31. Podejście SNAr do syntezy 2.113 – zabezpieczenie C2 i makrocyklizacja. Postanowiłem przygotować jeszcze jeden substrat, który mógłbym bezpośrednio przekształcić do 2.113 (Schemat 2.32). Chlorosulfonowanie salicylamidu 2.125 doprowadziło z dobrą wydajnością do chlorku sulfonowego 2.126. W reakcji 2.126 z aniliną 2.117 powstał sulfonamid 2.127. Wszystkie próby makrocyklizacji 2.127 zakończyły się niepowodzeniem. Schemat 2.32. Podejście SNAr do syntezy 2.113 – zmiana substratu. Postanowiłem zaprojektować nowe ścieżki syntezy 2.113 w oparciu o inne mechanizmy cyklizacji (Schemat 2.33). Makrocykliczny ester 2.128 mógłby zostać przygotowany na dwa sposoby: poprzez wewnątrzcząsteczkowe sprzęganie Buchwalda 2.129 lub reakcję SN2 pomiędzy pierwszorzędowym halogenkiem alkilowym i fenolem w 2.130. Drugie podejście wymagałoby zabezpieczenia sulfonamidowego atomu azotu 2.131, ze względu na możliwość powstania izomerycznego produktu ubocznego. Oba związki przygotowałbym z chlorku sulfonowego 2.132 wykorzystując amoniak i fenol 2.133, bądź anilinę 2.134. Synteza 2.132 polegałaby na chlorosulfonowaniu 2.135, który powstał w reakcji pomiędzy estrem 2.136 i alkanem 2.137. Schemat 2.33. Nowa strategia syntezy 2.113. Przygotowanie nowych substratów przebiegło zgodnie z planem (Schemat 2.34). Regioselektywność alkilowania 2.136 była zapewniona przez zaangażowanie układu salicylowego w tworzenie wiązania wodorowego. Chlorosulfonowanie bogatego w elektrony pierścienia aromatycznego 2.135 doprowadziło z wysoką wydajnością do chlorku sulfonowego 2.132. Od tego momentu postanowiłem podążać obiema ścieżkami równolegle. Synteza sulfonamidów 2.129 i 2.131 nie wymagała optymalizacji. Zdecydowałem, że warto przeprowadzić próbę cyklizacji niezabezpieczonego 2.131. Liczyłem na uzyskanie mieszaniny makrocyklu i alkilowanego sulfonamidu, jednak powstał jedynie związek zawierający ośmioczłonowy pierścień. Mimo to postanowiłem poddać ester amonolizie i ewaluować aktywność 2.138 razem z 2.113. W tym samym czasie sprawdziłem przebieg sprzęgania Buchwalda 2.129, w warunkach znalezionych w literaturze dla analogicznej reakcji pomiędzy pierwszorzędowym sulfonamidem, a bromkiem arylowym zawierającym sąsiadujący eter[160]. Makrocyklizacja przebiegła ze świetną wydajnością. Amonoliza 2.128 pozwoliła zakończyć trzymiesięczną syntezę 2.113. Schemat 2.34. Synteza 2.113. Zarówno 2.113 jak i 2.138 były nieaktywne względem CD73. Synteza pozostałych makrocyklicznych cząsteczek została wstrzymana, ponieważ GSK opublikowało patent opisujący analogiczne makrocykliczne inhibitory CD73[141]. Dokument potwierdził naukową słuszność podjętych działań i zablokował możliwość rozwoju wspomnianej serii związków. Brak aktywności 2.113 w porównaniu do opracowanych przez GSK substancji (Schemat 1.54) mógł być spowodowany nieodpowiednią długością łącznika (opatentowane makrocykle były 16-członowe, a wykonany przeze mnie 11-członowy) lub nieoptymalnym punktem wiązania z aniliną (najaktywniejsze związki z patentu można zaklasyfikować do serii B). Trudno przewidzieć czy wymiana terminalnych atomów łącznika w 2.113 na azot (jak w patencie) doprowadziłaby do wzrostu aktywności. W taki sposób całkowicie zakończyłem próby znalezienia nowych inhibitorów CD73 wywodzących się z salicylamidów opracowanych przez GSK. Najbardziej interesujące substancje, które udało mi się odkryć w tej części pracy to pirydyna 2.82 i pirazyna 2.84, jednak ich rozwój został porzucony ze względów biznesowych. 2.1.3 Modyfikacja benzotiadiazyn Opracowanie inhibitorów CD73 opierających się na szkielecie benzotiadiazynowych sulfonamidów rozpocząłem od wyboru 2.2 jako referencyjnego liganda, ze względu na optymalny stosunek aktywności i poziomu skomplikowania. Do syntezy wytypowałem cząsteczki 2.139-2.141 (Schemat 2.35), które miały sprawdzić czy inhibitor pozostanie aktywny po usunięciu aromatycznego fragmentu aniliny lub wymianie aminowego łącznika na eter czy węglowodór. Ponadto we współpracy z działem chemii obliczeniowej zaprojektowane zostały związki 2.142-2.146, które wg dokowania molekularnego zachowały najważniejsze oddziaływania widoczne w modelu utworzonym dla 2.6. Schemat 2.35. Pierwsze modyfikacje 2.1. Synteza 2.139 oraz 2.140 przebiegła wg ścieżki opisanej w patencie, przy czym zamiast aniliny wykorzystałem odpowiednio amoniak i 2-chlorofenol. Przygotowanie pozostałych przykładów wymagało opracowania nowych metod. Otrzymanie 2.141 polegało na reakcji sulfonamidu 2.147 z chlorkiem kwasowym 2.148 i cyklizacji powstałego amidu 2.149 w wodnym roztworze amoniaku (Schemat 2.36). Schemat 2.36. Synteza 2.141. W przypadku 2.142 konieczna była synteza substratów (Schemat 2.37). Sulfonamid 2.150 przygotowałem w trzech etapach z aniliny 2.151, którą poddałem cyklizacji z CSI. Hydroliza mocznika 2.152 i następujące po niej odbezpieczenie eteru 2.153 z dobrą wydajnością doprowadziły do 2.150, który wykorzystałem do syntezy wielu ligandów. Amid 2.154 powstał w reakcji pomiędzy 2.150 i chlorkiem kwasowym 2.155 otrzymanym z kwasu migdałowego 2.156. Podczas ogrzewania z amoniakiem 2.154 uległ cyklizacji i odbezpieczeniu. Schemat 2.37. Sposób przygotowania 2.142. Syntezę 2.143 rozpocząłem od przekształcenia kwasu 2.157 w chlorek kwasowy i poddaniu go reakcji z 2.150. Próba przygotowania amidu 2.158 w obecności trietyloaminy zakończyła się powstaniem znacznej ilości O-acylowanego produktu. W tym przypadku optymalne warunki uzyskałem ogrzewając oba substraty bez dodatku zasady. Wydzielający się w trakcie reakcji chlorowodór ulatniał się z otwartego układu. Cyklizacja 2.158 w wodzie amoniakalnej doprowadziła do 2.143. Schemat 2.38. Synteza 2.143. Kwas 2.159 potrzebny do przygotowania 2.144 otrzymałem w analogiczny sposób w reakcji z chlorkiem kwasowym 2.160 (Schemat 2.39). Zamiana substratu na 2.161 umożliwiła otrzymanie 2.162. Drugi etap polegał na cyklizacji i hydrolizie. Docelowe amidy 2.144 i 2.145 powstały w sprzęganiu 2.159 lub 2.162 z aniliną 2.163 w obecności HATU i DIPEA. Schemat 2.39. Otrzymywanie 2.144 i 2.145. Ostatni ze związków przygotowałem z powszechnie dostępnego kwasu hipurowego 2.164 (Schemat 2.40). Dwuetapowa sekwencja sprzęgania amidowego i cyklizacji w środowisku zasadowym doprowadziła do 2.146. Schemat 2.40. Przygotowanie 2.146. Wszystkie otrzymane ligandy, a także interesujące związki pośrednie lub produkty uboczne zawierające wolną grupę hydroksylową i sulfonamid zostały poddane testom aktywności względem CD73. Wyniki dla substancji hamujących działanie CD73 przedstawiłem poniżej (Tabela 2.4). Najniższe IC50 uzyskała pochodna fenolu 2.140, przy czym związane jest to z bardzo wysoką lipofilowością w porównaniu do pozostałych cząsteczek. Analiza LLE wskazała, że najbardziej interesujący punkt wyjścia dla rozwoju serii stanowiłby 2.146. Niestety analogiczny chemotyp występował w licznych patentach. Z pozostałych związków najwyższą wartość LLE uzyskał 2.143. Ponadto w literaturze nie opisano tak podstawionych benzotiadiazyn. Za największą wadę 2.143 należało uznać słabą rozpuszczalność, związaną z występowaniem licznych pierścieni aromatycznych i brakiem zaburzających planarność układu, atomów węgla o hybrydyzacji sp3. Tabela 2.4. Wyniki IC50 dla aktywnych pochodnych 2.2. Związek IC50 / µM LLE 2.140 4.49 1.77 2.143 13.03 2.32 2.146 29.37 3.08 2.141 34.74 1.93 2.142 57.97 1.82 Postanowiłem zbadać SAR benzotiadiazyn typu 2.143. W tym celu otrzymałem 9 pochodnych, które umożliwiły lepsze poznanie interakcji z CD73 (Schemat 2.41). Wszystkie przykłady przygotowałem tym samym sposobem co 2.143. Schemat 2.41. Modyfikacje 2.143. Na początku otrzymałem związki 2.165-2.167 (Tabela 2.5). Wprowadzenie dodatkowego atomu azotu zamiast C3 w 2.165 doprowadziło do znacznego spadku LLE. Wymiana benzimidazolu na imidazol w 2.166 poprawiła LLE w związku z obniżeniem lipofilowości. Otrzymałem także 2.167, który był izomerem 2.166. Zmiana lokalizacji drugiego atomu azotu znacząco poprawiła LLE, co wskazało na negatywny wpływ układu imidazolu. Aby sprawdzić postawioną wcześniej hipotezę o kluczowej dla zachowania aktywności roli chloru jako R4, przygotowałem pozbawiony tego podstawnika 2.168. Rezultat był zaskakujący – w przeciwieństwie do zbadanych do tej pory benzotiadiazyn, usunięcie chloru zwiększyło aktywność. W połączeniu z obniżoną lipofilowością dało to znacznie wyższą wartość LLE. Co ważne, w dziale biologii strukturalnej Ryvu udało się wykrystalizować kompleks CD73 z 2.168. Cząsteczka wiązała się z białkiem w bardzo podobny sposób co 2.5 (Rysunek 2.8): grupa sulfonamidowa tworzyła wiązania wodorowe z Gln-523 oraz Ile-91, indol oddziaływał elektrostatycznie z Lys-50 i Arg-328, a fenol wchodził w interakcję z cząsteczką wody. Rysunek 2.8. Oddziaływania w strukturze krystalicznej kompleksu 2.168 z CD73. Kolejnym krokiem było przygotowanie związku 2.169, aby potwierdzić niekorzystny wpływ azotu w pozycji C3. Zgodnie z oczekiwaniami LLE obniżyło się. Przykład 2.170 ukazał, że heterocykliczny pierścień powinien zawierać donor wiązania wodorowego. Cząsteczkę 2.171 otrzymałem w celu walidacji modelu – dokowanie wykazało, że wprowadzenie azotu zamiast C7 spowoduje zanik oddziaływania z Arg-328. Hipoteza została potwierdzona, ponieważ 2.171 był całkowicie nieaktywny. Ostatnie dwa związki z serii to 2.172 oraz 2.173, które zawierały grupy tworzące dodatkowe oddziaływania z białkiem. Dwukrotnie wyższa wartość LLE 2.172 w odniesieniu do 2.143 potwierdziła duże znaczenie nowego mostka solnego pomiędzy N6, a Asp-332. Rozbudowa C7 o grupę hydroksylową w 2.173 umożliwiła dodatkową interakcję z Arg-328, co podwyższyło LLE w porównaniu do 2.168. Synteza pochodnych 2.143 udowodniła działanie nowego chemotypu i pozwoliła wstępnie zbadać SAR. Związki posiadały potencjał do dalszego rozwoju przez modyfikację fragmentu benzotiadiazynowego lub rozbudowę części indolowej. Wprowadzenie polarnych podstawników poprawiło rozpuszczalność w rozpuszczalnikach organicznych. Co najważniejsze, hipotezy postawione na podstawie dokowania molekularnego zostały potwierdzone eksperymentalnie. Tabela 2.5. Aktywność pochodnych 2.143. Związek IC50 / µM LLE 2.143 13.03 2.32 2.172 8.21 4.76 2.173 1.63 4.13 2.167 34.97 3.68 2.168 3.77 3.45 2.169 34.07 2.86 2.166 226.86 2.83 2.170 14.16 1.89 2.165 196.41 1.50 2.171 >400 - Równolegle prowadziłem poszukiwanie alternatywnych pochodnych 2.2. W oparciu o oddziaływania widoczne w strukturze krystalicznej 2.168 oraz dokowanie molekularne wykonane przez dział chemii obliczeniowej Ryvu, zaprojektowane zostały substancje 2.174-2.179 ze zmodyfikowaną częścią benzotiadiazynową (Schemat 2.42). Schemat 2.42. Nowe modyfikacje 2.2. Ostatnie dwa etapy syntezy związków 2.174 i 2.175 polegały na reakcji SNAR odpowiednich amin z benzotiazyną 2.180 oraz odbezpieczeniu fenolu (Schemat 2.43). Sposób przygotowania centralnego fragmentu z tiofenolu 2.181 bazował na ścieżce opisanej w literaturze[161]. Punkt wyjścia stanowił 2-aminobenzotiazol 2.182, który poddałem deaminacji poprzez ogrzewanie z azotynem izoamylu. Redukcja pierścienia tiazolu 2.183 przy użyciu hydrazyny doprowadziła do 2.181, który alkilowałem jodoacetonitrylem 2.184. Grupę aminową w 2.185 przekształciłem w karbaminian. Utlenianie 2.186 do sulfonu 2.187 znacznie zwiększyło kwasowość protonów w sąsiadującej grupie metylenowej, dzięki czemu związek spontanicznie cyklizował po rozpuszczeniu w wodnym roztworze NaOH. W ostatnim etapie przeprowadziłem chlorowanie 2.188. Zarówno 2.174 jak i 2.175 okazały się nieaktywne. Schemat 2.43. Otrzymywanie centralnego fragmentu 2.174 i 2.175. Ewaluację pochodnych sacharyny rozpocząłem od wprowadzenia zabezpieczonej grupy hydroksylowej, w reakcji SNAR 2.189 z metanolanem sodu (Schemat 2.44)[162]. Chlorowanie 2.190 doprowadziło do 2.191, który mogłem modyfikować przez ogrzewanie z odpowiednimi aminami. Schemat 2.44. Synteza substratu 2.191. Ostatni etap polegał na odbezpieczeniu grupy hydroksylowej z użyciem tribromku boru. Spośród czterech związków jedynie 2.177 okazał się mało aktywny (IC50 = 43.15 µM, LLE = 1.99). Porzuciłem poszukiwanie kolejnych ligandów. Wynikiem mojego zaangażowania w tę część projektu było odkrycie nowego typu benzotiadiazynowych inhibitorów CD73. Związki nie były opisane w literaturze ani zastrzeżone roszczeniami patentowymi. Dla substancji 2.168 uzyskano strukturę krystaliczną kompleksu z CD73. Przygotowanie grupy pochodnych pozwoliło na zrozumienie SAR oraz walidację hipotez opartych na dokowaniu molekularnym. Ligandy, które zsyntezowałem mogą posłużyć Ryvu do opracowania bardziej zaawansowanych cząsteczek o znaczeniu terapeutycznym. 2.2 Eksperyment HTS Drugim sposobem poszukiwania nowych inhibitorów było przeprowadzenie w Ryvu eksperymentu HTS komercyjnej biblioteki ligandów. Zdolność hamowania działania CD73 lub CD39 wykazały cztery spośród kilkudziesięciu tysięcy przetestowanych substancji (Schemat 2.45). Amid 2.192 działał na CD73, natomiast związki 2.193 oraz 2.194 hamowały aktywność CD39. Najbardziej interesującą charakterystykę posiadał kwas 2.195, który okazał się dualnym inhibitorem CD39 i CD73. Schemat 2.45. Struktury inhibitorów zidentyfikowanych w HTS. Struktury i czystość wytypowanych związków potwierdziłem zamawiając od dostawców bibliotek próbki substancji. Analizy NMR i HPLC nie wykazały żadnych zanieczyszczeń. Następnie powtórzono testy aktywności, których wyniki przedstawiłem poniżej (Tabela 2.6). Tabela 2.6. Aktywność inhibitorów z HTS. Związek IC50 / µM CD73 CD39 2.192 36.63 - 2.193 - 2.19 2.194 - 16.36 2.195 91.30 17.38 Kolejny etap walidacji polegał na samodzielnej syntezie odkrytych substancji i porównaniu ich działania z komercyjnymi próbkami. W przypadku 2.192 i 2.193 oba związki otrzymałem w sprzęganiu amidowym dostępnych handlowo substratów. Pozostałe substancje wymagały kilkuetapowego przygotowania. Najciekawszym zadaniem było uzyskanie 2.194 ze względu na małą ilość źródeł opisujących substancje tego typu (Schemat 2.46). Syntezę rozpocząłem od podwójnej 1,3-dipolarnej cykloaddycji pomiędzy propiolanem etylu 2.196 i zabezpieczonym donorem ylidu azometinowego 2.197. Wysokociśnieniowe uwodornienie 2.198 w obecności 1,1,2-trichloroetanu jako źródła HCl doprowadziło do aminy 2.199. Wykorzystałem ją w aminowaniu redukcyjnym piperydonu 2.200. Niska wydajność tego etapu była związana z powstawaniem dialkilowanego produktu (pomimo zastosowania nadmiaru 2.199). Metylowanie 2.201 wykonałem stosując formaldehyd. Następnie przeprowadziłem kwasową hydrolizę 2.202. W sprzęganiu amidowym 2.203 i kwasu 2.204 powstał pożądany produkt 2.194. Schemat 2.46. Synteza 2.194. Pierwszy etap przygotowanie dualnego inhibitora 2.195 polegał na sprzęganiu bromku arylowego 2.204 z merkaptanem 2.205 (Schemat 2.47). Następnie utleniłem tioeter 2.206 do sulfonu i poddałem aminowaniu redukcyjnemu z pirolidyną. Kwasowa hydroliza 2.207 pozwoliła z bardzo dobrą wydajnością uzyskać 2.195. Zastosowanie na tym etapie warunków zasadowych prowadziło do natychmiastowej eliminacji kwasu sulfinowego[163]. Otrzymane cząsteczki, pomimo identyczności strukturalnej z komercyjnymi związkami okazały się nieaktywne. Najprawdopodobniejszym wyjaśnieniem rozbieżności wyników jest obecność nieorganicznych zanieczyszczeń w komercyjnych próbkach. Jony metali mogą zaburzać działanie testu aktywności, prowadząc do uzyskania fałszywie pozytywnych rezultatów. Schemat 2.47 Przygotowanie 2.195. Wynikiem mojego zaangażowania w część projektu związaną z HTS była demistyfikacja ligandów z komercyjnej biblioteki. W rezultacie procedura HTS stosowana w Ryvu została rozszerzona o obowiązkową resyntezę zidentyfikowanych inhibitorów. Przeprowadzone przeze mnie doświadczenia wykazały, że wykonanie analiz HPLC i 1H NMR dla kupionych substancji nie jest wystarczające do potwierdzenia czystości. Z uwagi na brak odpowiedniego punktu startowego do opracowania inhibitora CD39, porzuciłem dalszy rozwój tej części projektu. Ze względów biznesowych nie podjąłem się optymalizacji struktur przedstawionych we wstępie literaturowym. 2.3 Synteza antagonistów A2AR Ostatnia część projektu, w którą byłem zaangażowany dotyczyła poszukiwania antagonistów A2AR/A2BR. Moje zadanie polegało na optymalizacji opracowanego w Ryvu związku 2.208 (Schemat 2.48) pod kątem selektywności względem A1R oraz aktywności wobec A2AR i A2BR. Schemat 2.48. Antagonista A2AR odkryty w Ryvu oraz ligand opatentowany przez Heptares. Pomimo bicyklicznego szkieletu, cząsteczka 2.208 była podobna do opatentowanego przez Heptares liganda 2.209. Dawało to nadzieję na możliwość zaadaptowania najbardziej interesujących podstawników[165]. Ze względu na brak dostępności struktury A1R w literaturze, poszukiwanie optymalnych modyfikacji układu imidazo[1,2-a]pirazyny oparte było o systematyczne badanie SAR. Związek 2.208 wykazał nanomolarną aktywność względem wszystkich trzech celów terapeutycznych (Tabela 2.7). Z zaprezentowanego we wstępie przeglądu literatury wynikała istotna rola grupy aminowej w C8. Podstawienie w C3 zostało wcześniej zbadane w Ryvu i niekorzystnie zmieniało profil działania związków. Wynikało stąd, że poprawę parametrów 2.208 mogłem uzyskać przez modyfikację imidazo[1,2-a]pirazynowego szkieletu w trzech pozycjach: C2, C5 oraz C6. Tabela 2.7. Aktywność imidazo[1,2-a]pirazynowych antagonistów A2AR. Związek KB / nM A1R A2AR A2BR 2.208 1.4 0.4 6.5 2.210 2.1 3.9 125 2.211 3.0 19 125 2.212 105 19 125 2.213 17 19 125 2.214 1.4 19 24 Na początku postanowiłem zbadać wpływ modyfikacji grupy w C5. Przygotowałem substancje 2.210-2.214, które zawierały różnorodnie podstawiony indazol lub indol (Schemat 2.49). Schemat 2.49. Pierwsze modyfikacje C5 w 2.208. Badanie SAR imidazo[1,2-a]pirazyn wymagało zaprojektowania ścieżki, która umożliwiłaby szybkie przygotowanie różnorodnych cząsteczek. Związki 2.210-2.214 otrzymałem na dwa sposoby. Pierwszą metodę zastosowałem do syntezy 2.210-2.212. (Schemat 2.50). Początkowy etap polegał na bromowaniu pirazyny 2.215. Wykorzystanie mieszaniny rozpuszczalników pozwoliło zminimalizować powstawanie dibromopirazyny. Następnie w reakcji Suzukiego z udziałem 2.216 wprowadziłem pierwszy podstawnik arylowy. Chlorowanie 2.217 z bardzo dobrą wydajnością doprowadziło do zawierającego dwa atomy chloru 2.218. Produkt poddałem kondensacji z aldehydem 2.219. Niska wydajność amonolizy 2.220 była związana ze słabą rozpuszczalnością produktu oraz powstawaniem pirazynonu. Utworzony w pięciu etapach związek 2.221 mógł być szybko derywatyzowany w reakcji Suzukiego. Dobór warunków sprzęgania zależał od rodzaju drugiego substratu. Potrzebne kwasy lub estry boronowe przygotowałem w reakcji borylowania Miyaury. Jako reprezentatywny przykład przedstawiłem przekształcenie bromku 2.222 w ester 2.223. Schemat 2.50. Synteza imidazo[1,2-a]pirazynowych antagonistów A2AR – metoda A. Sposób przygotowania 2.213 i 2.214 był konwergentny – podstawniki wprowadziłem w ostatnich dwóch reakcjach (Schemat 2.51). Centralny układ imidazo[1,2-a]pirazyny powstał w pierwszych trzech etapach. Rozpocząłem od wyczerpującego bromowania 2.215. Kondensacja 2.224 z acetalem 2.225 doprowadziła do pożądanego bicyklicznego układu. Surowy 2.226 poddałem amonolizie i oczyszczaniu chromatograficznemu. Produkt 2.227 uzyskałem z dobrą sumaryczną wydajnością. Regioselektywność pierwszej modyfikacji 2.227 była zapewniona przez większą reaktywność bromu w sprzęganiu Suzukiego. Schemat 2.51. Synteza imidazo[1,2-a]pirazynowych antagonistów A2AR – metoda B. Wprowadzone zmiany pogorszyły aktywność w stosunku do 2.208 (Tabela 2.7). Umieszczenie chloru w pozycji C3’ indazolu zmniejszyło również powinowactwo do A1R. W skrajnym przypadku 2.211 uzyskałem selektywnego antagonistę A1R. Kolejnym krokiem było przygotowanie ligandów 2.229-2.232 zawierających w C2 dodatkowy podstawnik arylowy (Schemat 2.52). Schemat 2.52. Modyfikacje C2 w 2.208. Powyższe związki otrzymałem w sposób umożliwiający wprowadzanie zmian w C2 na zaawansowanym etapie syntezy (Schemat 2.53). Punktem wyjścia był 2.217, który w sprzęganiu Suzukiego z kwasem boronowym 2.233 przekształciłem w produkt zawierający pożądane grupy w C5 i C6. Bromowanie ostatniej wolnej pozycji pirazyny doprowadziło do 2.234. Następnie w kondensacji zamiast aldehydu 2.219 użyłem odpowiednio podstawionych 2-bromoacetofenonów (2.235 w przypadku 2.229). Cyklizacje przebiegły z akceptowalną wydajnością. Ostatni etap polegał na amonolizie. Testy aktywności wykazały, że wprowadzone modyfikacje nie wpłynęły pozytywnie na profil działania związków. Powinowactwo do A2AR pozostało na poziomie 2.208, przy znacznym obniżeniu antagonizmu A2BR. Aktywność względem A1R wzrosła jedynie dwukrotnie, a lipofilowość związków znacząco się zwiększyła. Dodatkowo rozpuszczalność wszystkich otrzymanych substancji była bardzo niska. Nie kontynuowałem rozwoju tej serii ligandów. Schemat 2.53. Synteza imidazo[1,2-a]pirazynowych antagonistów A2AR – metoda C. Badania prowadzone równolegle przez naukowców z Ryvu wykazały istotny wpływ na aktywność podstawienia fluorem pierścienia fenylowego w C6. Najlepsze wyniki uzyskano dla związków zawierających grupę 3-fluorofenylową lub 4-fluorofenylową. Postanowiłem kontynuować eksplorację SAR dla ligandów zawierających te ugrupowania. Syntezę przeprowadziłem zaprezentowanymi wcześniej metodami A-C. Na początku przygotowałem pochodne 3-fluorofenylowe o minimalnym skomplikowaniu 2.236-2.239. Związki 2.240 oraz 2.241 zawierały podstawniki, które zapewniły większą selektywność względem A1R, w przypadku chemotypu opracowanego przez Heptares. Przykład 2.242 otrzymałem, aby sprawdzić czy możliwe jest wprowadzenie nasyconego układu, który mógłby poprawić rozpuszczalność i parametry ADME. Wybór umotywowany był możliwością katalitycznego uwodornienia pirydyny w 2.240. Pozostałe ligandy 2.243-2.247 wybrałem do syntezy ze względu na obecność grup funkcyjnych, które mogłyby tworzyć nowe oddziaływania z białkiem, co przyczyniłoby się do wzrostu selektywności. Dodatkowo przygotowałem pochodne 4-fluorofenylowe 2.248-2.251. Syntezę wszystkich przygotowywanych przeze mnie związków poprzedzała ewaluacja na podstawie dokowania molekularnego wykonywanego przez dział chemii obliczeniowej Ryvu. Schemat 2.54. Modyfikacje C5 ligandów z grupami fluorofenylowymi. Najbardziej interesujące wyniki testów aktywności otrzymanych cząsteczek przedstawiłem poniżej (Tabela 2.8). Spośród ligandów zawierających 3-fluorofenyl należy wyróżnić 2.240 oraz 2.247. Wprowadzenie dipodstawionej pirydyny w 2.240 zapewniło pięćdziesięciokrotną selektywność względem A1R, jednakże pozbawiło związek powinowactwa do A2BR. Podstawiony dimetylopirydyną 2.241 był jeszcze bardziej selektywny, jednak znacznie słabiej wiązał się z A2AR. Umieszczenie fluorochinoliny w C5 pozwoliło uzyskać korzystniejszy profil działania 2.247, przy zachowaniu aktywności względem A2BR. Para regioizomerów 2.244 i 2.245 wykazała, że odpowiednia orientacja grup tworzących oddziaływania z białkiem jest kluczowa – 2.245 był całkowicie nieaktywny. Wprowadzenie piperydyny w 2.242 także pozbawiło związek aktywności. Natomiast kombinacje 4-fluorofenylu i metylochinoliny w 2.248 oraz metylochinazoliny w 2.249 były optymalne. Ligandy zachowały bardzo wysokie powinowactwo do A2AR i A2BR przy ponad trzydziestokrotnej selektywności wobec A1R. Związek 2.249 posiadał lepszy profil działania od 2.248, jednak okazał się niestabilny w kwaśnych warunkach. Na tym etapie poszukiwanie najkorzystniejszej pary podstawników w C5 i C6 zostało zakończone. Tabela 2.8. Wpływ modyfikacji C5 na aktywność antagonistów A2AR. Związek KB / nM A1R A2AR A2BR 2.237 1.3 2.0 3.9 2.238 7.1 19.0 6.4 2.239 0.65 0.7 4.3 2.240 120 2.4 450 2.241 4000 21.0 130 2.244 22.0 1.7 7.7 2.246 2.6 2.2 71.0 2.247 640 5.7 70.0 2.248 19.0 0.6 0.9 2.249 38.0 0.4 1.4 Równolegle do opisanych powyżej poszukiwań, które doprowadziły do odkrycia 2.248 postanowiłem sprawdzić wpływ usunięcia azotu z imidazolowego pierścienia imidazo[1,2-a]pirazyny 2.241 (Schemat 2.55). Symetria 2,4,6-kolidyny umożliwiła konstrukcję cząsteczki bez komplikacji związanych z regioselektywnością. Pierwszy etap polegał na utworzeniu amidu Weinreba 2.252 z kwasu 2.253. Następnie w reakcji z 2,4,6-kolidyną otrzymałem keton 2.254. Poddałem go bromowaniu w pozycji α. Bromek 2.255 wykorzystałem do alkilowania pirazolu 2.256. Pierścień pirazyny utworzyłem w kondensacji 2.257 z octanem amonu. Chlorowanie pirazynonu 2.258 z wysoką wydajnością doprowadziło do 2.259. Ostatni etap syntezy 2.260 polegał na amonolizie 2.259. Po ewaluacji wyników aktywności 2.260 porzuciłem rozwój pirolo[1,2-a]pirazynowych antagonistów. Związek 2.260 zdecydowanie słabiej działał na A2AR i A2BR. Ponadto wykazał znacznie niższą selektywność względem A1R. Schemat 2.55. Synteza pirolo[1,2-a]pirazynowego antagonisty A2AR. Ostatnia część mojej pracy dotyczyła optymalizacji właściwości 2.248 poprzez modyfikację C2. Naukowcy z Ryvu odkryli, że umieszczenie w tej pozycji grupy amidowej może zwiększyć aktywność i selektywność ligandów oraz poprawić parametry ADME. Substancje wykazywały aktywność w wysokim stężeniu adenozyny, podobnie jak opisany we wstępie inupadenant. Postanowiłem sprawdzić działanie serii amidowych pochodnych 2.248 o zróżnicowanych rozmiarach (Schemat 2.56). Schemat 2.56. Modyfikacje C2 w 2.248. Sposób syntezy ligandów przypominał metodę A (Schemat 2.57). Na początku wykonałem sprzęganie Suzukiego 2.216 z kwasem boronowym 2.261. Następnie bromowałem pirazynę 2.262. Najważniejszy etap polegał na utworzeniu imidazo[1,2-a]pirazyny 2.263 zawierającej grupę estrową w C2. Wykorzystałem w tym celu pirogronian 2.264 i pirazynę 2.265. Regioselektywna amonoliza doprowadziła do ważnego związku pośredniego 2.266 podatnego na modyfikacje w C2 oraz C5. Następnie w reakcji Suzukiego z 2.267 otrzymałem ester 2.268. Poddałem go zasadowej hydrolizie do kwasu 2.269, który sprzęgałem z odpowiednimi aminami. Synteza niektórych amidów była również możliwa bezpośrednio z 2.268. Schemat 2.57. Sposób syntezy amidowych pochodnych 2.248. Otrzymane przeze mnie związki zostały poddane testom aktywności. Wyniki potwierdziły zasadność wprowadzonych modyfikacji (Tabela 2.9). Najmniej selektywny okazał się 2.270 zawierający w C2 niepodstawioną grupę amidową. Wprowadzenie podstawnika metylowego w 2.271 znacznie poprawiło powinowactwo do A2AR, zwiększyło selektywność względem A1R i dwukrotnie osłabiło działanie na A2BR. Był to najlepszy z zsyntezowanych przeze mnie ligandów. Dalsza rozbudowa amidów 2.272 i 2.273 wpłynęła negatywnie na aktywność i selektywność. Drugorzędowe amidy 2.274 i 2.275 zapewniały niewiele gorszą selektywność od 2.271, jednak przy mniejszym powinowactwie do A2BR. Ich zaletą, podobnie jak 2.276, było poprawienie rozpuszczalności. Spośród otrzymanych antagonistów 2.271 został wybrany do bardziej zaawansowanych badań. Tabela 2.9. Wpływ modyfikacji C2 na aktywność antagonistów A2AR. Związek KB / nM K A1R A2AR A2BR 2.248 19.0 0.58 0.9 32.8 2.270 2.7 0.70 1.3 3.9 2.271 7.1 0.16 2.3 44.4 2.272 6.0 0.28 5.5 21.4 2.273 9.1 0.27 4.9 33.7 2.274 8.1 0.20 5.7 40.5 2.275 10.0 0.28 13.8 35.7 2.276 4.7 0.70 3.8 6.7 Profil działania 2.271 potwierdziły testy in vitro w warunkach imitujących wysokie stężenie adenozyny w mikrośrodowisku guza (Tabela 2.10). W tych warunkach otrzymany przeze mnie ligand zachował aktywność względem A2AR. W identycznym środowisku testowane klinicznie związki (1.112, 1.79, 1.41) przestały działać. Żadnej z substancji nie udało się zachować powinowactwa do A2BR w obecności wysokiego stężenia adenozyny. Tabela 2.10. Aktywność antagonistów A2AR w warunkach imitujących mikrośrodowisko guza. Związek A A2AR EC50 [nM] A A2BR EC50 2.271 0.3 4.2 6.4 1618 1.112 57.6 >10000 188 >10000 1.79 13.8 >10000 138 >10000 1.41 3.2 9222 >4000 >10000 Antynowotworowe działanie 2.271 zostało potwierdzone w dwóch eksperymentach in vivo zaprojektowanych w Ryvu (Rysunek 2.9). W pierwszym z nich myszom wszczepiono nowotwór typu B16-F10. Gdy guz osiągnął objętość ok. 120 mm3 podano: mAb będące inhibitorem PD-1, 2.271 oraz kombinację obu środków. Na wykresie widać znaczne zahamowanie wzrostu nowotworu w przypadku kombinacji 2.271 i mAb. Jeszcze bardziej spektakularny rezultat uzyskano dla modelu nowotworu CT26. W tym eksperymencie myszom z guzem o rozmiarze ok. 40 mm3 podano: inhibitor CTLA-4, 2.271 oraz ich kombinację. Antagonista A2AR i mAb wykazały synergiczne działanie, praktycznie całkowicie hamując wzrost nowotworu. Rysunek 2.9. Inhibicja wzrostu nowotworu wywołana kombinacją 2.271 i ICI. W wyniku mojego zaangażowania w część projektu dotyczącą poszukiwania antagonistów A2AR odkryta została grupa ligandów działających selektywnie względem A1R. Spośród nich związek 2.271 wykazał aktywność w wysokim stężeniu adenozyny. Antynowotworową skuteczność 2.271 potwierdzono w eksperymentach in vivo, w których substancja wykazała synergię ze stosowanymi klinicznie ICI. Związki, które otrzymałem zostały ujęte w dwóch zgłoszeniach patentowych złożonych przez Ryvu[166,167]. Działanie 2.271 jest ulepszone w porównaniu do cząsteczek obecnie testowanych klinicznie i stanowi obiecujący punkt wyjścia do opracowania przez Ryvu terapii immunoonkologicznej. PODSUMOWANIE Główny cel badań przeprowadzonych w ramach mojego doktoratu wdrożeniowego stanowiło odkrycie nowej generacji ligandów, które modulowałyby immunosupresyjny szlak adenozyny. Projekt realizowałem w ramach zatrudnienia w Ryvu Therapeutics, dlatego istotne było, aby zsyntezowane przeze mnie cząsteczki mogły zostać opatentowane i wykorzystane do opracowania terapii immunoonkologicznej. Postanowiłem eksplorować trzy ścieżki zapobiegania ucieczce spod nadzoru układu odpornościowego wywoływanej przez adenozynę. Inspirację dla pierwszej części badań stanowiły dwa patenty opisujące sulfonamidowe inhibitory CD73. Przeprowadziłem szczegółową analizę SAR dla obu chemotypów (salicylamidów i benzotiadiazyn). Celem wprowadzonych podstawień bioizosterycznych było ulepszenie właściwości ligandów i zyskania nieograniczonej patentami wolności działania. Otrzymane przeze mnie związki projektowane były w oparciu o dokowanie molekularne do struktury krystalicznej kompleksu CD73 z jednym z salicylamidów. Poszukiwania dotyczyły modyfikacji trzech fragmentów cząsteczki: układu salicylamidowego, grupy sulfonamidowej i centralnego pierścienia fenylowego. Pierwsze dwie części okazały się bardzo konserwatywne – jakiekolwiek zmiany prowadziły do utraty aktywności. Ogółem spośród 47 otrzymanych substancji, jedynie cząsteczki 2.82 i 2.84 zawierające pierścień heterocykliczny w miejscu benzenu wykazały interesujące działanie. Niestety ich rozwój został porzucony ze względów biznesowych. Rozwinięciem tego wątku było poszukiwanie inhibitorów opartych o szkielet benzotiadiazyny. Sumarycznie zsyntezowałem 23 ligandy. Dla 2.168 w dziale biologii strukturalnej Ryvu uzyskano strukturę krystaliczną kompleksu z CD73. Kolejne związki zaprojektowane zostały w oparciu o analizę oddziaływań z białkiem. Wyniki eksperymentalne potwierdziły hipotezy postawione na podstawie dokowania molekularnego. Najaktywniejsze substancje z nowej serii benzotiadiazynowych inhibitorów wykazały aktywność na poziomie cząsteczek opisanych we wspomnianym patencie. Opracowany przeze mnie chemotyp nie jest znany w literaturze. Najaktywniejsze ze związków 2.173 oraz 2.172 wskazały kierunek do dalszej optymalizacji. Zakończenie części projektu poświęconej inhibicji CD73 stanowiła próba syntezy nowatorskiej makrocyklicznej cząsteczki. We współpracy z działem chemii obliczeniowej Ryvu zaproponowane zostały cztery klasy potencjalnie aktywnych związków opartych o strukturę salicylamidu. Wytypowałem jedną z nich do syntezy. Pierwsza zaprojektowana przeze mnie ścieżka syntetyczna okazała się nieskuteczna na kluczowym etapie makrocyklizacji. Opracowałem dwie ortogonalne metody przygotowania produktu, różniące się mechanizmem kluczowego przekształcenia. Jedna z nich zakończyła się sukcesem i doprowadziła do otrzymania pożądanej substancji. Pomimo podobieństwa do aktywnego acyklicznego inhibitora, związek okazał się nieaktywny. Druga część projektu związana była z walidacją wyników eksperymentu HTS komercyjnej biblioteki ligandów. Wykonałem resyntezę czterech małocząsteczkowych związków organicznych. Otrzymane substancje, pomimo identyczności strukturalnej z komercyjnymi odpowiednikami okazały się nieaktywne. Najprawdopodobniejszym wyjaśnieniem rozbieżności wyników była obecność nieorganicznych zanieczyszczeń w komercyjnych próbkach. Jony metali mogą zaburzać działanie testu aktywności, prowadząc do uzyskania fałszywie pozytywnych rezultatów. Procedura HTS stosowana w Ryvu została rozszerzona o obowiązkową resyntezę zidentyfikowanych inhibitorów. Przeprowadzone przeze mnie doświadczenia wykazały, że wykonanie analiz HPLC i 1H NMR dla kupionych substancji nie jest wystarczające do potwierdzenia czystości. Ostatnia część moich badań skupiała się na poszukiwaniu antagonistów A2AR/A2BR. Punkt wyjścia stanowił opracowany w Ryvu nieselektywny antagonista receptorów adenozynowych. W wyniku mojego zaangażowania w tę część projektu odkryta została grupa ligandów działających selektywnie względem A1R. Systematyczna analiza SAR wskazała najkorzystniejsze kombinacje podstawników. Spośród 33 otrzymanych przeze mnie ligandów wytypowany został związek 2.271, który wykazał aktywność w warunkach wysokiego stężenia adenozyny. Potencjał terapeutyczny 2.271 potwierdzono w eksperymentach in vivo, w których substancja wykazała synergię ze stosowanymi klinicznie ICI. Antynowotworowe działanie 2.271 jest ulepszone w porównaniu do cząsteczek obecnie testowanych klinicznie i stwarza fundament do opracowania przez Ryvu terapii immunoonkologicznej. Związki, które zsyntezowałem zostały ujęte w dwóch zgłoszeniach patentowych złożonych przez Ryvu. 3 CZĘŚĆ PREPARATYWNA Uwagi ogólne Wszystkie rozpuszczalniki, reagenty i substraty zostały zakupione ze źródeł komercyjnych i użyte bez wcześniejszego oczyszczenia, o ile nie zostało to uwzględnione w procedurze. Do osuszania roztworów stosowano bezwodny siarczan(VI) sodu lub magnezu. Jako gazu obojętnego używano argonu lub azotu. Przebieg reakcji monitorowano przy pomocy LC-MS lub płytek TLC z żelem krzemionkowym [płytki aluminiowe (0.2 mm)]. Chromatogramy wizualizowano przy pomocy promieniowania UV (254 nm) lub poprzez ogrzewanie płytek uprzednio umieszczonych w wodnym r-rze zawierającym KMnO4 bądź etanolowy r-r ninhydryny. Pomiary LC-MS wykonano przy pomocy spektrometrów mas: Waters Acquity SQD2 UPLC lub Shimadzu LC-MS 2020. Reakcje przeprowadzano w reaktorach mikrofalowych: Biotage Emrys Initiator lub Anton Paar Monowave 450. Chromatografię kolumnową wykonywano przy pomocy: Isco Rf200d lub Interchim Puriflash 450. Preparatywne HPLC wykonywano przy pomocy aparatów: Waters zaopatrzonego w kolumnę Xbridge C18 lub Shimadzu z kolumną Gemini-NX 5. Widma NMR rejestrowane były przy pomocy spektrometrów Bruker 300 MHz lub 400 MHz i zostały ustawione na wzorzec szczątkowego sygnału od rozpuszczalnika. Dane zostały przedstawione według modelu: przesunięcie chemiczne wyrażone w ppm, multipletowość (bs = szeroki singlet, s = singlet, d = dublet, t = tryplet, q = kwartet, m = multiplet), stała sprzężenia wyrażona w Hz oraz integracja. 3.1 Synteza referencyjnych inhibitorów CD73 Procedura A – przygotowanie chlorków sulfonowych W atm. gazu obojętnego, do mieszaniny kwasu chlorosulfonowego (3.1 eq.) i SOCl2 (1.25 eq.) w 0 °C dodano substrat (1.0 eq.). Reakcję doprowadzono do RT i mieszano przez 16 godz. Reakcję zakończono przez wylanie na lód. W przypadku gdy produkt ulegał strąceniu, osad odsączano, przemywano wodą i suszono. W przeciwnym razie mieszaninę reakcyjną ekstrahowano DCM. Połączone fazy organiczne suszono nad bezw. Na2SO4, środek suszący odsączano, a przesącz odparowywano pod zmniejszonym ciśnieniem. Procedura B – przygotowanie sulfonamidów Chlorek sulfonowy (1.0 eq.) dodano w jednej porcji do r-ru aminy (1.2 eq.) i DMAP (kat.) w bezw. pirydynie (0.2-1 M), w 0 °C, w atm. gazu obojętnego. Reakcję doprowadzono do RT i mieszano przez 3-72 godz. Mieszaninę rozcieńczono wodą i zakwaszono 1 M kwasem solnym. W przypadku gdy produkt ulegał strąceniu, osad odsączano, przemywano wodą i suszono. W przeciwnym razie dodawano solankę i ekstrahowano EtOAc. Połączone fazy organiczne przemywano kolejno 1 M r-rem HCl, wodą i solanką. Następnie warstwę organiczną suszono nad bezw. Na2SO4, środek suszący odsączano, a przesącz odparowywano pod zmniejszonym ciśnieniem. Surowy produkt oczyszczano jedną, lub kilkoma z następujących metod: przemywanie rozpuszczalnikami (np. i-PrOH, EtOH, ACN, Et2O, pentan), FCC, RP-HPLC. Procedura C – przygotowanie chlorków kwasowych Do schłodzonej w łaźni lodowej zawiesiny kwasu (1 eq.) w dioksanie lub toluenie wkroplono SOCl2 (2-5 eq.) i kilka kropli DMF (kat.). Reakcję prowadzono w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika przez 1-3 godz. Wszystkie lotne substancje usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość odparowano dwukrotnie z bezw. toluenem lub dioksanem. Powstały chlorek kwasowy wykorzystano bez oczyszczania. Procedura D – uwodornienie W kolbie trójszyjnej umieszczono substrat (1.0 eq.) i rozpuszczono w MeOH, EtOH lub mieszaninie MeOH/DCM (0.05-0.2 M). W atm. gazu obojętnego dodano 10% Pd/C (0.1-1.0 eq.). Przy pomocy pompki wodnej usunięto gaz obojętny i z balonu dodano wodór. Operację powtórzono dwa razy, po czym prowadzono reakcję pod ciśnieniem wodoru z balonu, do zaniku substratu (1-72 godz.). Następnie przesączono mieszaninę przez celit, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Surowy produkt wykorzystywano bez oczyszczania, bądź oczyszczano metodą FCC lub RP-HPLC. 7-chloro-3-[(7-fluoro-1H-indol-5-ylo)amino]-5-hydroksy-4H-1λ⁶,2,4-benzotiadiazyno-1,1-dion (2.1)[139] a. Do szybko mieszanego r-ru izocyjanianu chlorosulfonylu (6.117 g, 43.22 mmol) w 1-nitropropanie (40 ml), schłodzonego do -40 °C, wkroplono r-r 4-chloro-2-metoksyaniliny (5.240 g, 33.25 mmol) w 1-nitropropanie (10 ml). Z r-ru wytrącił się biały osad. Reakcję mieszano przez 5 min w -40°C, po czym doprowadzono do 0 °C. Następnie dodano AlCl3 (5.985 g, 17.13 mmol) i prowadzono reakcję w 110 °C przez 30 min (mieszanina reakcyjna zmieniła kolor na fioletowy). Po ochłodzeniu mieszaninę wylano na lód, a powstały osad odsączono. Surowy produkt przemyto wodą i wysuszono, uzyskując 7-chloro-5-metoksy-3,4-dihydro-2H-1λ⁶,2,4-benzotiadiazyno-1,1,3-trion 2.152 jako szare ciało stałe (5.450 g, 62%). MS: 262.9 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.70 (s, 1H), 7.40 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 7.37 (d, J = 1.7 Hz, 1H). b. Mieszaninę POBr3 (6.549 g, 22.84 mmol), 2.152 (1.500 g, 5.71 mmol) i ACN (39 ml) ogrzewano w 110°C przez 16 godz. Po ochłodzeniu mieszaninę reakcyjną wylano na lód, a osad odsączono. Po wysuszeniu otrzymano 3-bromo-7-chloro-5-metoksy-2H-1λ⁶,2,4-benzotiadiazyno-1,1-dion 3.1 jako beżowe ciało stałe (1.724 g, 93%). MS: 326.9 (M+1). c. Mieszaninę 3.1 (1.600 g, 4.91 mmol), 1 M r-ru BBr3 w DCM (19.66 ml, 19.66 mmol) i DCE (20 ml) ogrzewano w 80 °C przez 8 godz. Po ochłodzeniu dodano lód. Powstały osad odsączono, przemyto wodą i wysuszono. Uzyskano 3-bromo-7-chloro-5-hydroksy-2H-1λ⁶,2,4-benzotiadiazyno-1,1-dion 3.2 jako beżowe ciało stałe (1.370 g, 90%). MS: 312.9 (M+1). d. Mieszaninę 3.2 (0.090 g, 0.29 mmol), 5-amino-7-fluoro-1H-indolu (0.052 g, 0.35 mmol) i KH2PO4 (0.047 g, 0.35 mmol) w t-BuOH (2 ml) ogrzewano w 100 °C przez 16 h. Po ochłodzeniu dodano wody. Powstały osad odsączono, przemyto wodą i wysuszono. Surowy produkt oczyszczono metodą FCC. Zebraną frakcję odparowano, przemyto Et2O i pentanem, po czym wysuszono. Produkt 2.1 uzyskano jako szare ciało stałe (0.040 g, 36%). MS: 381.2 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.75 – 11.56 (m, 2H), 10.15 (s, 1H), 9.44 (s, 1H), 7.48 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 7.44 (t, J = 2.7 Hz, 1H), 7.16 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 7.12 (dd, J = 12.6, 1.7 Hz, 1H), 7.04 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 6.57 – 6.53 (m, 1H). HRMS (M+1): obliczono dla C15H11ClFN4O3S: 381.0219, znaleziono: 381.0221. 7-chloro-3-[(2-chlorofenylo)amino]-5-hydroksy-2H-1λ⁶,2,4-benzotiadiazyno-1,1-dion(2.2)[139] Związek otrzymano jak 2.1, w etapie (d) stosując 2-chloroanilinę. Produkt 2.2 uzyskano jako różowe ciało stałe (0.040 g, 35%). MS: 358.2 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.68 (s, 1H), 10.85 (s, 1H), 9.27 (s, 1H), 7.95 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.56 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.49 – 7.37 (m, 1H), 7.31 – 7.14 (m, 2H), 7.08 (s, 1H). 3-[(2-chlorofenylo)amino]-5-hydroksy-2H-1λ⁶,2,4-benzotiadiazyno-1,1-dion (2.3)[139] Związek otrzymano jak 2.1, w etapie (a) stosując 2-metoksyanilinę, a w etapie (d) 2-chloroanilinę. Produkt 2.2 uzyskano jako beżowe ciało stałe (0.032 g, 25%). MS: 324.1 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.07 (s, 1H), 10.73 (s, 1H), 9.23 (s, 1H), 7.98 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.56 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.47 – 7.36 (m, 1H), 7.27 – 7.04 (m, 4H). 3-[(2-chlorofenylo)amino]-2H-1λ⁶,2,4-benzotiadiazyno-1,1-dion (2.4) a. Mieszaninę 2-aminobenzenosulfonamidu (1.000 g, 2.34 mmol) i mocznika (0.281 g, 4.68 mmol) ogrzewano w 180 °C. Zaobserwowano wydzielanie amoniaku, a po 30 min. nastąpiła krystalizacja. Po ochłodzeniu do mieszaniny reakcyjnej dodano gorącą wodę (10 ml). Do r-ru dodano węgiel aktywny i mieszano przez 15 min. Węgiel odsączono, a przesącz zakwaszono 1 M kwasem solnym i pozostawiono na noc do krystalizacji w 0 °C. Powstałe kryształy odsączono, przemyto wodą i wysuszono. Uzyskano 3,4-dihydro-2H-1λ⁶,2,4-benzotiadiazyno-1,1,3-trion 3.3 jako brązowe ciało stałe (0.250 g, 55%)[168]. MS: 199.0 (M+1). b. Związek 2.4 otrzymano jak 2.1, w etapie (b) stosując 3.3, pomijając etap (c), a w etapie (d) używając 2-chloroaniliny. Produkt 2.4 uzyskano jako beżowe ciało stałe (0.039 g, 31%). MS: 307.9 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.14 (s, 1H), 9.01 (s, 1H), 7.79 (dd, J = 8.1, 1.6 Hz, 1H), 7.73 (dd, J = 7.9, 1.4 Hz, 1H), 7.67 – 7.55 (m, 2H), 7.48 – 7.39 (m, 1H), 7.38 – 7.22 (m, 3H). 6-(5-chloro-3-karbamoilo-4-hydroksybenzenosulfonamido)-1H-indolo-3-karboksamid (1.215)[132] a. Kwas azotowy(V) (1.85 ml, 39.09 mmol) dodano do r-ru kwasu indolo-3-karboksylowego (3.000 g, 18.62 mmol) w kwasie octowym (15 ml). Reakcję prowadzono w 60 °C przez 1 godz. Mieszaninę wylano na lód i ekstrahowano EtOAc. Połączone fazy organiczne przemyto solanką i osuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Surowy produkt oczyszczono metodą FCC. Uzyskano kwas 6-nitro-1H-indolo-3-karboksylowy 3.4 jako żółte ciało stałe (0.907 g, 24%)[169]. MS: 205.0 (M-1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12.52 – 12.35 (m, 2H), 8.41 – 8.36 (m, 2H), 8.17 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 8.05 (dd, J = 8.9, 2.1 Hz, 1H). b. Zgodnie z procedurą C przekształcono 3.4 (0.880 g, 4.27 mmol) w chlorek kwasowy. Następnie umieszczono w naczyniu reakcyjnym, dodano THF (35 ml) i 0.5 M r-r amoniaku w THF (25 ml). Reakcję prowadzono przez 16 h w 60 °C. Wszystkie lotne substancje usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Osad zawieszono w wodzie, sonikowano przez kilka minut, odsączono i wysuszono. Następnie osad przemyto ACN i wysuszono. Uzyskano 6-nitro-1H-indolo-3-karboksyamid 1.221 w postaci żółtego ciała stałego[169]. MS: 205.9 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12.19 (s, 1H), 8.42 – 8.35 (m, 2H), 8.32 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.99 (dd, J = 8.9, 2.1 Hz, 1H), 7.63 (br s, 1H), 7.04 (br s, 1H). c. Mieszaninę 1.221 (0.530 g, 2.58 mmol), NH4Cl (0.691 g, 12.92 mmol), żelaza (0.721 g, 12.92 mmol), EtOH (10 ml) i wody (10 ml) ogrzewano w 80 °C przez 6 h. Mieszaninę reakcyjną przesączono przez celit, a przesącz ekstrahowano EtOAc i n-BuOH. Połączone fazy organiczne wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskano surowy 6-amino-1H-indolo-3-karboksyamid 1.220 jako brązowe ciało stałe (0.534 g). Produkt wykorzystano bez oczyszczania. MS: 175.9 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.37 (s, 1H), 7.95 – 7.83 (m, 2H), 7.61 – 7.03 (m, 2H), 6.93 – 6.90 (m, 2H), 6.68 (dd, J = 8.5, 1.8 Hz, 1H). d. Chlorek sulfonowy przygotowano wg procedury A. Uzyskano chlorek 5-chloro-3-karbamoilo-4-hydroksybenzeno-1-sulfonylu 1.219 jako beżowe ciało stałe (1.180 g, 72%). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.86 (s, 1H), 8.15 (d, J = 1.9 Hz, 2H), 7.72 (d, J = 1.9 Hz, 1H). e. Tytułowy związek przygotowano wg procedury B. Produkt 1.215 uzyskano jako beżowe ciało stałe (0.052 g, 34%). MS: 408.9 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 14.99 (br s, 1H), 11.41 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 9.96 (s, 1H), 8.99 (br s, 1H), 8.34 (br s, 1H), 8.26 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 8.02 – 7.84 (m, 3H), 7.31 (br s, 1H), 7.13 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 6.89 (dd, J = 8.6, 1.9 Hz, 1H), 6.78 (br s, 1H). HRMS (M+1): obliczono dla C16H14ClN4O5S: 409.0368, znaleziono: 409.0367. 2-hydroksy-5-[(1H-indol-6-ylo)sulfamoilo]benzamid (2.5)[132] a. Chlorek sulfonowy przygotowano wg procedury A. Uzyskano chlorek 3-karbamoilo-4-hydroksybenzeno-1-sulfonowy 2.10 w postaci białego ciała stałego (4.350 g, 84%). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.57 (s, 1H), 8.14 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 7.83 (s, 1H), 7.62 (dd, J = 8.5, 2.1 Hz, 1H), 6.81 (dd, J = 8.5, 1.3 Hz, 1H). b. Tytułowy związek przygotowano wg procedury B. Produkt 2.5 uzyskano jako jasnoróżowe ciało stałe (0.020 g, 7%). MS: 331.9 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.57 (s, 1H), 8.14 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 7.83 (s, 1H), 7.62 (dd, J = 8.5, 2.1 Hz, 1H), 6.81 (dd, J = 8.5, 1.3 Hz, 1H). 2-hydroksy-5-[(1H-indol-5-ylo)sulfamoilo]benzamid (2.6)[132] Związek przygotowano wg procedury B. Produkt 2.6 uzyskano jako białe ciało stałe (0.050 g, 18%). MS: 331.9 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.39 (s, 1H), 11.03 (s, 1H), 9.67 (s, 1H), 8.51 (s, 1H), 8.26 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.66 (dd, J = 8.7, 2.3 Hz, 1H), 7.33 – 7.17 (m, 3H), 6.98 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.80 (dd, J = 8.6, 2.1 Hz, 1H), 6.33 (ddd, J = 3.0, 1.9, 0.8 Hz, 1H). 2-hydroksy-5-[(1H-indazol-6-ylo)sulfamoilo]benzamid (2.7)[132] Związek przygotowano wg procedury B. Produkt 2.7 uzyskano jako białe ciało stałe (0.428 g, 76%). MS: 333.0 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.37 (s, 1H), 12.84 (s, 1H), 10.28 (s, 1H), 8.52 (s, 1H), 8.36 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.71 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 1H), 7.60 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.21 (s, 1H), 7.00 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.89 (dd, J = 8.7, 1.8 Hz, 1H). HRMS (M+1): obliczono dla C14H13N4O4S: 333.0652, znaleziono: 333.0651. 5-[(1H-1,3-benzodiazol-6-ylo)sulfamoilo]-2-hydroksybenzamid (2.8)[132] Związek przygotowano wg procedury B. Produkt 2.8 uzyskano w postaci białego ciała stałego (0.015 g, 4%). MS: 333.0 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.35(s, 1H), 12.36 (s, 1H), 9.95 (s, 1H), 8.51 (s, 1H), 8.29 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 8.14 (s, 1H), 8.00 (s, 1H), 7.68 (dd, J = 8.8, 2.3 Hz, 1H), 7.43 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.30 – 7.25 (m, 1H), 7.03 – 6.90 (m, 2H). 2-hydroksy-5-[(4-metoksyfenylo)sulfamoilo]benzamid (2.9)[132] Związek przygotowano wg procedury B. Produkt 2.9 uzyskano w postaci białego ciała stałego (0.020 g, 7%). MS: 323.0 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.43 (s, 1H), 9.78 (s, 1H), 8.53 (s, 1H), 8.26 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 8.03 (s, 1H), 7.66 (dd, J = 8.7, 2.3 Hz, 1H), 7.05 – 6.93 (m, 3H), 6.85 – 6.76 (m, 2H), 3.67 (s, 3H). 6-chloro-2-okso-N-(4-sulfamoilofenylo)-2H-chromeno-3-karboksyamid (1.164)[123] Do mieszaniny sulfanilamidu (0.100 g, 0.58 mmol), HOBt (0.094 g, 0.69 mmol), kwasu 6-chloro-2-okso-2H-chromeno-3-karboksylowego (0.110 g, 0.64 mmol) i DMF (4 ml) w 0 °C, dodano EDC (0.130 g, 0.69 mmol) i DIPEA (0.212 ml, 1.20 mmol). Reakcję prowadzono przez 16 godz. w RT. Reakcję zakończono przez wylanie na lód. Powstały osad odsączono i wysuszono. Surowy produkt oczyszczono przez krystalizację z DMSO/MeOH. Uzyskano 1.164 jako żółte ciało stałe (0.015 g, 7%). MS: 377 (M-1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 10.86 (s, 1H), 8.87 (s, 1H), 8.16 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 7.98 – 7.76 (m, 5H), 7.61 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.32 (s, 2H). 2-[5-chloro-3-metylo-1-(4-metylofenylo)-1H-pirazolo[3,4-b]pirydyn-6-ylo]-4-metylofenol (1.169)[128] a. Do r-ru 1-(2-hydroksy-5-metylofenylo)etanonu (3.000 g, 19.98 mmol) w ksylenie (10 ml), dodano DMF-DMA (2.65 ml, 19.98 mmol). Reakcję prowadzono przez 2 godz. w temp. wrzenia rozpuszczalnika. Po ochłodzeniu odsączono osad i przemyto kolejno EtOH i Et2O. Surowy produkt oczyszczono przez krystalizację z EtOH, uzyskując 3-(dimetyloamino)-1-(2-hydroksy-5-metylofenylo)prop-2-en-1-on 3.5 (1.650 g, 40%) jako żółte ciało stałe. MS: 206.1 (M+1). b. Do schłodzonego w łaźni lodowej r-ru 3.5 (1.000 g, 4.87 mmol) w DCM (40 ml) dodano porcjami NCS (0.680 g, 5.12 mmol). Reakcję prowadzono w 0 °C przez 30 min. Następnie odparowano rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem, a stałą pozostałość przemyto wodą. Surowy produkt oczyszczono przez krystalizację z i-PrOH, otrzymując 3-chloro-6-metylochromon 3.6 jako białe ciało stałe (0.447 g, 47%). MS: 195.0 (M+1). c. Mieszaninę 3.6 (0.200 g, 1.03 mmol), 3-metylo-1-(4-metylofenylo)-1H-pirazolo-5-aminy (0.230 g, 1,23 mmol), 85% H3PO4 (0.36 ml, 6.17 mmol) i DMF (4 ml) ogrzewano przez 16 godz. w 130 °C. Po ochłodzeniu, rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Surowy produkt oczyszczono metodą RP-HPLC, uzyskując 1.169 jako białe ciało stałe (0.005 g, 1%). MS: 364.2 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 9.40 (s, 1H), 8.55 (s, 1H), 8.04 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.36 – 7.27 (m, 2H), 7.11 (dd, J = 8.4, 2.3 Hz, 1H), 7.04 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 6.85 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 2.63 (s, 3H), 2.34 (s, 3H), 2.26 (s, 3H). 3-metylo-N-(pirydyn-4-ylo)benzamid (1.171)[130] Do r-ru 4-aminopirydyny (0.100 g, 1.06 mmol), kwasu m-toluilowego (0.159 g, 1.17 mmol), HOBt (0.172 g, 1,27 mmol) i DMF (4 ml), w 0 °C, dodano EDC (0.244 g, 1.27 mmol) i DIPEA (0.39 ml, 2.2 mmol). Reakcję prowadzono przez 18 godz. w RT. Reakcję zakończono przez wylanie na lód. Osad odsączono, wysuszono i oczyszczono metodą FCC. Produkt 1.171 uzyskano w postaci białego ciała stałego (0.145 g, 65%). MS: 212.9 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 10.55 (s, 1H), 8.57 – 8.38 (m, 2H), 7.86 – 7.66 (m, 4H), 7.51 – 7.30 (m, 2H), 2.40 (s, 3H). 3.2 Synteza salicylamidowych inhibitorów CD73 Procedura E – synteza tioeterów[152] Do mieszaniny halogenku arylowego (1.0 eq.), Pd2(dba)3 (0.1 eq.), XantPhos (0.2 eq.), DIPEA (3.0 eq.) i toluenu (0.3 M), w atm. gazu obojętnego, dodano merkaptan benzylu. Reakcję prowadzono przez 5 godz. w 100-110 °C. Mieszaninę zakwaszono AcOH i rozcieńczono EtOAc i wodą. Osad odsączono, a przesącz przeniesiono do rozdzielacza. Oddzieloną fazę organiczną przemyto solanką i wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Osad przemyto pentanem i wysuszono. W niektórych przypadkach produkt oczyszczano metodą FCC. Procedura F – utlenianie tioeterów do chlorków sulfonowych[152] Do roztworu tioeteru (1.0 eq.) w mieszaninie (3:1) AcOH/woda (0.1 M) dodano NCS (5 eq.). Układ schłodzono w łaźni lodowej i prowadzono reakcję w 0 °C przez 2 godz. Reakcję zakończono przez dodanie wody. W przypadku gdy produkt ulegał strąceniu, osad odsączano, przemywano wodą i suszono. W przeciwnym razie mieszaninę reakcyjną ekstrahowano DCM. Połączone fazy organiczne suszono nad bezw. Na2SO4, środek suszący odsączano, a przesącz odparowywano pod zmniejszonym ciśnieniem. Procedura G – przekształcenie tioeterów w sulfonamidy[153] Do zawiesiny tioeteru (1.0 eq.) w mieszaninie (20:1) ACN/woda (0.2-0.4 M), w 0 °C, dodano NCS (3.0 eq.) i NH4Cl (1.0 eq.). Usunięto łaźnię lodową i prowadzono reakcję w RT przez 2 godz. Gdy chlorek sulfonowy został utworzony (kontrola UPLC), schłodzono mieszaninę do 0 °C i dodano roztwór aminy (2.0 eq.) w pirydynie (1-2 M). Reakcję doprowadzono do RT i mieszano 16-72 godz. Następnie mieszaninę rozcieńczono wodą, zakwaszono 1 M r-rem HCl i ekstrahowano EtOAc. Połączone fazy organiczne przemyto wodą i solanką oraz wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczano metodą FCC lub RP-HPLC. 2-hydroksy-5-sulfamoilobenzamid (2.12) Związek przygotowano wg procedury B. Produkt 2.12 uzyskano w postaci różowego ciała stałego (0.037 g, 20%). MS: 217.2 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.40 (s, 1H), 8.56 (s, 1H), 8.36 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 8.04 (s, 1H), 7.83 (dd, J = 8.7, 2.0 Hz, 1H), 7.22 (s, 2H), 7.06 (d, J = 8.7 Hz, 1H). 2-hydroksy-5-(metylosulfamoilo)benzamid (2.13) Związek przygotowano wg procedury B. Produkt 2.13 uzyskano w postaci białego ciała stałego (0.050 g, 26%). MS: 231.2 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.54 (s, 1H), 8.64 (s, 1H), 8.31 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 8.07 (s, 1H), 7.76 (dd, J = 8.7, 2.3 Hz, 1H), 7.26 (q, J = 5.0 Hz, 1H), 7.08 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 2.40 (d, J = 5.1 Hz, 3H). 5-(dimetylosulfamoilo)-2-hydroksybenzamid (2.14) Związek przygotowano wg procedury B. Produkt 2.14 uzyskano w postaci białego ciała stałego (0.015 g, 7%). MS: 245.3 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.77 (s, 1H), 8.77 (s, 1H), 8.28 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 8.13 (s, 1H), 7.74 (dd, J = 8.7, 2.3 Hz, 1H), 7.09 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 2.58 (s, 6H). 2-hydroksy-5-(fenylosulfamoilo)benzamid (2.15) Związek przygotowano wg procedury B. Produkt 2.15 uzyskano w postaci białego ciała stałego (0.044 g, 35%). MS: 293.0 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.46 (s, 1H), 10.14 (s, 1H), 8.56 (s, 1H), 8.34 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.71 (dd, J = 8.7, 2.0 Hz, 1H), 7.29 – 7.16 (m, 2H), 7.14 – 6.95 (m, 4H). HRMS (M+1): obliczono dla C13H13N2O4S: 293.0591, znaleziono: 293.0583. 2-hydroksy-5-[(4-metoksyfenylo)(metylo)sulfamoilo]benzamid (2.16) Związek przygotowano wg procedury B. Produkt 2.16 uzyskano w postaci białego ciała stałego (0.168 g, 59%). MS: 337.1 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.73 (s, 1H), 8.68 (s, 1H), 8.22 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 8.10 (s, 1H), 7.35 (dd, J = 8.7, 2.3 Hz, 1H), 7.05 – 6.96 (m, 3H), 6.92 – 6.85 (m, 2H), 3.74 (s, 3H), 3.09 (s, 3H). HRMS (M+1): obliczono dla C15H16N2O5S: 337.0853, znaleziono: 337.0852. 2-hydroksy-5-(fenyloformamido)sulfonylobenzamid (2.17) Związek przygotowano wg procedury B, stosując NaH (2.2 eq.) i THF zamiast pirydyny. Produkt 2.17 uzyskano w postaci białego ciała stałego (0.005 g, 4%). MS: 318.9 (M-1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.62 (s, 1H), 12.46 (s, 1H), 8.66 (s, 1H), 8.56 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 8.11 (s, 1H), 7.99 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 1H), 7.91 – 7.81 (m, 2H), 7.68 – 7.58 (m, 1H), 7.50 (dd, J = 8.3, 7.0 Hz, 2H), 7.12 (d, J = 8.8 Hz, 1H). 2-hydroksy-5-(1H-pirolo-1-sulfonylo)benzamid (2.19) Związek przygotowano wg procedury B, stosując NaH (2.2 eq.) i THF zamiast pirydyny. Produkt 2.19 uzyskano w postaci beżowego ciała stałego (0.063 g, 37%). MS: 267.9 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.88 (s, 1H), 8.70 (s, 1H), 8.55 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 8.22 (s, 1H), 7.94 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 1H), 7.36 – 7.28 (m, 2H), 7.08 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 6.38 – 6.32 (m, 2H). HRMS (M+1): obliczono dla C11H11N2O4S: 267.0434, znaleziono: 267.0429. 3-karbamoilo-4-hydroksybenzeno-1-sulfonian 4-metoksyfenylu (2.18) Związek przygotowano wg procedury B. Produkt 2.18 uzyskano w postaci białego ciała stałego (0.005 g, 2%). MS: 324.0 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.99 (s, 1H), 8.73 (s, 1H), 8.44 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 8.19 (s, 1H), 7.76 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 1H), 7.09 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.98 – 6.88 (m, 4H), 3.72 (s, 3H). 5-(2,3-dihydro-1H-indolo-1-sulfonylo)-2-hydroksybenzamid (2.20) Związek przygotowano wg procedury B. Produkt 2.20 otrzymano jako różowe ciało stałe (0.150 g, 56%). MS: 318.8 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.76 (s, 1H), 8.73 (br s, 1H), 8.41 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 8.13 (br s, 1H), 7.74 (dd, J = 8.8, 2.3 Hz, 1H), 7.49 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.20 – 7.12 (m, 2H), 7.01 – 6.93 (m, 2H), 3.92 (t, J = 8.4 Hz, 2H), 2.91 (t, J = 8.4 Hz, 2H). HRMS (M+1): obliczono dla C15H15N2O4S: 319.0747, znaleziono: 319.0747. 5-[(2-fenyloazetydyn-1-ylo)sulfonylo]-2-hydroksybenzamid (2.21) a. Do r-ru styrenu (0.520 g, 4.99 mmol) w bezw. Et2O (5 ml), w atm. gazu obojętnego, dodano CSI (0.521 ml, 5.99 mmol). Reakcję prowadzono w RT przez 2 godz. Następnie odparowano rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem. Stałą pozostałość (2.26) rozpuszczono w Et2O (10 ml) i dodano do szybko mieszanego r-ru Na2CO3 (1.746 g, 16.48 mmol) i Na2SO3 (0.881 g, 6.99 mmol) w mieszaninie wody (10 ml) i lodu (10 ml). Reakcję prowadzono przez 1 godz, po czym mieszaninę przesączono przez lejek ze spiekiem. Fazę wodną przesączu ekstrahowano Et2O. Połączone fazy organiczne wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskano 4-fenyloazetydyn-2-on 2.27 w postaci jasnożółtego ciała stałego (0.563 g, 77%)[150]. MS: 148.1 (M+1). 1H NMR (300 MHz, Chloroform-d3) δ 7.46 – 7.29 (m, 5H), 6.23 (s, 1H), 4.73 (dd, J = 5.3, 2.5 Hz, 1H), 3.45 (ddd, J = 14.9, 5.3, 2.4 Hz, 1H), 2.93 – 2.82 (m, 1H). b. Do schłodzonego w łaźni lodowej r-ru 2.27 (0.560 g, 3.80 mmol) w bezw. Et2O (5 ml), w atm. gazu obojętnego, wkroplono r-r LAH (2 M w THF, 4.0 ml, 8.00 mmol). Reakcję prowadzono przez 20 min w RT oraz przez 4 godz. w temp. wrzenia rozpuszczalnika. Po ochłodzeniu do mieszaniny reakcyjnej dodano 20% r-r NaOH (10 ml). Zawiesinę przesączono przez lejek ze spiekiem. Przesącz ekstrahowano DCM. Połączone fazy organiczne wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymano surową 2-fenyloazetydynę 2.24 w postaci bezbarwnego oleju (0.520 g)[150]. Produkt wykorzystano bez oczyszczania. c. Związek przygotowano wg procedury B. Produkt 2.21 otrzymano jako różowe ciało stałe (0.023 g, 15%). MS: 331.0 (M-1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.83 (s, 1H), 8.78 (s, 1H), 8.36 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 8.13 (s, 1H), 7.78 (dd, J = 8.7, 2.2 Hz, 1H), 7.49 – 7.41 (m, 2H), 7.40 – 7.25 (m, 3H), 7.13 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 4.79 (t, J = 8.3 Hz, 1H), 3.80 – 3.68 (m, 1H), 3.66 – 3.54 (m, 1H), 2.37 – 2.25 (m, 1H), 2.17 – 2.03 (m, 1H). kwas 1-(-4-hydroxy-3-karbamoilobenzenosulfonylo)piperydynylo-4-karboksylowy (2.22) a. Sulfonamid przygotowano wg procedury B. Uzyskano 1-(4-hydroksy-3-karbamoilobenzenosulfonylo)piperydynylo-4-karboksylan etylu 3.7 jako białe ciało stałe (0.270 g, 60%). MS: 357.1 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.75 (s, 1H), 8.72 (s, 1H), 8.27 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 8.15 (s, 1H), 7.73 (dd, J = 8.7, 2.3 Hz, 1H), 7.09 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 4.03 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 3.50 (dt, J = 11.9, 4.0 Hz, 2H), 2.38 (dp, J = 11.0, 3.7, 3.3 Hz, 3H), 1.88 (dd, J = 13.4, 3.6 Hz, 2H), 1.68 – 1.40 (m, 2H), 1.13 (t, J = 7.1 Hz, 3H). b. Do r-ru 3.7 (0.075 g, 0.21 mmol) w MeOH (2 ml) dodano wodny r-r LiOH (0.026, 0.63 mmol). Reakcję prowadzono w RT przez 16 godz. Reakcję zakończono przez wylanie na lód. Roztwór zakwaszono 1 M r-r-rem HCl do pH 4. Powstały osad odsączono, przemyto wodą i wysuszono. Produkt 2.22 uzyskano jako białe ciało stałe (0.045 g, 65%). MS: 329.2 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.76 (s, 1H), 12.28 (s, 1H), 8.73 (s, 1H), 8.27 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 8.16 (s, 1H), 7.73 (dd, J = 8.7, 2.3 Hz, 1H), 7.09 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 3.47 (dd, J = 11.9, 4.1 Hz, 2H), 2.44 – 2.15 (m, 3H), 1.87 (dd, J = 13.6, 3.8 Hz, 2H), 1.67 – 1.39 (m, 2H). HRMS (M+1): obliczono dla C13H17N2O6S: 329.0802, znaleziono: 329.0799. 2-hydroksy-5-[(2-oksoimidazolidin-1-ylo)sulfonylo]benzamid (2.23) Związek przygotowano wg procedury B, stosując NaH (3.0 eq.) i DMF zamiast pirydyny. Produkt 2.23 otrzymano jako białe ciało stałe (0.006 g, 2%). MS: 286.9 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.77 (s, 1H), 8.70 (s, 1H), 8.43 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 8.13 (s, 1H), 7.93 (dd, J = 8.8, 2.3 Hz, 1H), 7.53 (s, 1H), 7.09 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 3.88 – 3.79 (m, 2H), 3.39 – 3.25 (m, 2H). HRMS (M+1): obliczono dla C10H12N3O5S: 286.0492, znaleziono: 286.0488. 2-hydroksy-5-(4-metoksybenzenosulfonamido)benzamid (2.28) a. Sulfonamid przygotowano wg procedury B. Otrzymano 2-hydroksy-5-(4-metoksybenzenosulfonamido)benzoesan metylu 3.8 jako beżowe ciało stałe (0.210 g, 52%). MS: 336.1 (M-1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 10.26 (s, 1H), 9.90 (s, 1H), 7.64 – 7.56 (m, 2H), 7.48 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 7.19 (dd, J = 8.9, 2.8 Hz, 1H), 7.10 – 7.01 (m, 2H), 6.88 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 3.86 (s, 3H), 3.80 (s, 3H). b. Mieszaninę 3.8 (0.120 g, 0.36 mmol) i wodnego r-ru amoniaku (3.3 ml) ogrzewano w 100 °C przez 2 godz. Wszystkie lotne substancje usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono metodą RP-HPLC. Uzyskano 2.28 w postaci beżowego ciała stałego (0.006 g, 5%). MS: 323.0 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12.46 (s, 1H), 9.69 (s, 1H), 8.29 (s, 1H), 7.82 (s, 1H), 7.63 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 7.62 – 7.50 (m, 2H), 7.12 – 6.99 (m, 2H), 6.90 (dd, J = 8.8, 2.6 Hz, 1H), 6.74 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 3.80 (s, 3H). 4-hydroksy-N1-(1H-indazol-6-ylo)benzeno-1,3-dikarboksyamid (2.29) a. Kwas (metoksykarbonylo)benzoesowy (0.050 g, 0.25 mmol) przekształcono wg procedury C w chlorek kwasowy. Następnie rozpuszczono w dioksanie (3 ml) i schłodzono w łaźni lodowej i dodano 6-aminoindazol 1.199 (0.041 g, 0.31 mmol). Reakcję prowadzono przez 1 godz. w 0 °C, oraz przez 16 godz. w 60 °C. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono wodą i zakwaszono 1 M r-rem HCl. Fazę wodną ekstrahowano DCM. Połączone fazy organiczne suszono nad bezw. Na2SO4, środek suszący odsączano, a przesącz odparowywano pod zmniejszonym ciśnieniem. Surowy produkt oczyszczono metodą FCC, uzyskując 2-hydroksy-5-[(1H-indazol-6-ylo)karbamoilo]benzoesan metylu 3.9 jako beżowe ciało stałe (0.015 g, 19%).MS: 310.6 (M-1). b. W 7 M metanolowym r-rze amoniaku (3 ml) rozpuszczono 3.9 (0.010, 0.032 mmol). Reakcję prowadzono w RT przez 72 godz. Wszystkie lotne substancje usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Surowy produkt zawieszono w wodzie i zakwaszono 1 M r-rem HCl. Osad odsączono, przemyto Et2O, pentanem i wysuszono. Amid 2.29 otrzymano jako białe ciało stałe (0.005 g, 53%). MS: 297.1 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.44 (s, 1H), 12.94 (s, 1H), 10.18 (s, 1H), 8.63 (s, 1H), 8.50 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 8.24 (s, 1H), 8.07 – 7.95 (m, 3H), 7.70 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.35 (dd, J = 8.7, 1.7 Hz, 1H), 6.99 (d, J = 8.6 Hz, 1H). 3-amino-4-hydroksy-N-(1H-indazol-6-ylo)benzeno-1-sulfonamid (2.30) a. Związek przygotowano wg procedury A. Otrzymano chlorek 4-hydroksy-3-nitrobenzeno-1-sulfonylu 3.10 w postaci beżowego ciała stałego (3.500 g, 55%). 1H NMR (300 MHz, Chloroform-d3) δ 11.14 (s, 1H), 8.86 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 8.24 (dd, J = 9.0, 2.4 Hz, 1H), 7.45 (d, J = 9.0 Hz, 1H). b. Związek przygotowano wg procedury B. Uzyskano 4-hydroksy-N-(1H-indazol-6-ylo)-3-nitrobenzeno-1-sulfonamid 2.31 w postaci żółtego ciała stałego (0.550 g, 26%). MS: 335.0 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12.89 (s, 1H), 12.17 (s, 1H), 10.42 (s, 1H), 8.25 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.96 (d, J = 1.0 Hz, 1H), 7.80 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 1H), 7.63 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.33 – 7.16 (m, 2H), 6.89 (dd, J = 8.6, 1.8 Hz, 1H). c. Zgodnie z procedurą D uwodorniono 2.31 (0.700 g, 2.09 mmol). Otrzymano 2.30 jako żółte ciało stałe (0.630 g, 99%). MS: 305.0 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12.82 (s, 1H), 10.07 (s, 1H), 7.92 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 7.57 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.25 – 7.16 (m, 1H), 7.01 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.91 – 6.82 (m, 2H), 6.66 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 4.95 (s, 2H). N-{2-hydroksy-5-[(1H-indazol-6-ylo)sulfamoilo]fenylo}acetamid (2.32) Do roztworu 2.30 (0.050 g, 0.16 mmol) w DCM/DMF (2 ml) dodano chlorek acetylu (0.010 ml, 0.16 mmol) i prowadzono reakcję przez 16 godz. w RT. Reakcję zakończono przez dodanie wody. Warstwę organiczną oddzielono i wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Związek oczyszczono metodą RP-HPLC. Produkt 2.32 otrzymano w postaci żółtego ciała stałego (0.009 g, 16%). MS: 347.1 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.83 (s, 1H), 10.87 (s, 1H), 10.26 (s, 1H), 9.27 (s, 1H), 8.49 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 7.92 (d, J = 1.0 Hz, 1H), 7.57 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.32 (dd, J = 8.5, 2.4 Hz, 1H), 7.25 – 7.20 (m, 1H), 6.93 – 6.84 (m, 2H), 2.09 (s, 3H). HRMS (M+1): obliczono dla C15H15N4O4S: 347.0809, znaleziono: 347.08015. 4-hydroksy-N-(1H-indazol-6-ylo)-3-metanosulfonamidobenzeno-1-sulfonamid (2.33) Związek przygotowano jak 2.32, stosując chlorek mesylu zamiast chlorku acetylu. Produkt 2.33 uzyskano w postaci jasnoróżowego ciała stałego (0.019 g, 22%). MS: 383.1 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.84 (s, 1H), 10.95 (s, 1H), 10.25 (s, 1H), 8.95 (s, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.69 – 7.66 (m, 1H), 7.58 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.40 (dd, J = 8.5, 2.3 Hz, 1H), 7.24 (s, 1H), 6.91 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.87 (dd, J = 8.7, 1.8 Hz, 1H), 2.85 (s, 3H). HRMS (M+1): obliczono dla C14H15N4O5S2: 383.0478, znaleziono: 383.048. 4-hydroksy-N-(1H-indazol-6-ylo)-3-(sulfamoiloamino)benzeno-1-sulfonamid (2.34) Związek przygotowano jak 2.32, stosując chlorek sulfamoilu zamiast chlorku acetylu. Produkt 2.34 uzyskano w postaci żółtego ciała stałego (0.016 g, 25%). MS: 384.0 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.82 (s, 1H), 10.76 (s, 1H), 10.17 (s, 1H), 8.14 (s, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.85 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 7.57 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.29 (dd, J = 8.5, 2.3 Hz, 1H), 7.27 – 7.22 (m, 1H), 7.07 (s, 2H), 6.91 – 6.82 (m, 2H). HRMS (M+1): obliczono dla C13H14N5O5S2: 384.0431, znaleziono: 384.0432. {2-hydroksy-5-[(1H-indazol-6-ylo)sulfamoilo]fenylo}mocznik (2.35) Związek przygotowano jak 2.32, dodając kolejno kwas octowy (3 eq.), cyjanian potasu (2.8 eq.) i wodę (3 eq.), zamiast chlorku acetylu. Produkt 2.35 uzyskano w postaci żółtego ciała stałego (0.010 g, 18%). MS: 346.6 (M-1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.83 (s, 1H), 11.00 (s, 1H), 10.37 (s, 1H), 10.25 (s, 1H), 9.18 (s, 1H), 8.64 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.58 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.27 (dd, J = 8.4, 2.4 Hz, 1H), 7.22 (d, J = 1.0 Hz, 1H), 7.01 – 6.82 (m, 1H), 6.70 – 6.40 (m, 1H). kwas 2-hydroksy-5-[(1H-indazol-6-ylo)sulfamoilo]benzoesowy (2.36) Postępując wg procedury B uzyskano 2.36 w postaci beżowego ciała stałego (0.071 g, 10%). MS: 334.1 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12.87 (s, 1H), 10.32 (s, 1H), 8.19 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.95 (d, J = 1.0 Hz, 1H), 7.79 (dd, J = 8.8, 2.5 Hz, 1H), 7.61 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.25 (d, J = 1.4 Hz, 1H), 7.05 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.87 (dd, J = 8.7, 1.8 Hz, 1H). 2-hydroksy-5-[(1H-indazol-6-ylo)sulfamoilo]-N-metylobenzamid (2.37) Zgodnie z procedurą C utworzono chlorek kwasowy z 2.36 (0.150 g, 0.45 mmol) i rozpuszczono w dioksanie. Do mieszaniny dodano r-r MeNH2 (2 M w THF, 1.13 ml, 2.25 mmol) i prowadzono reakcję przez 18 godz. Wszystkie lotne substancje usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Surowy produkt oczyszczono metodą RP-HPLC. Związek 2.37 uzyskano w postaci białego ciała stałego (0.035 g, 23%). MS: 347.1 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.01 (s, 1H), 12.85 (s, 1H), 10.30 (s, 1H), 8.88 (q, J = 4.5 Hz, 1H), 8.34 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.94 (d, J = 1.0 Hz, 1H), 7.71 (dd, J = 8.7, 2.4 Hz, 1H), 7.60 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.25 – 7.17 (m, 1H), 7.02 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.89 (dd, J = 8.6, 1.8 Hz, 1H), 2.80 (d, J = 4.5 Hz, 3H). 4-hydroksy-3-(hydroksymetylo)-N-(1H-indazol-6-ylo)benzeno-1-sulfonamid (2.38) a. Zgodnie z procedurą A utworzono 5-(chlorosulfonylo)-2-hydroksybenzoesan metylu 3.11 w postaci białego ciała stałego (0.400 g, 98%). b. Postępując wg procedury B przygotowano 2-hydroksy-5-[(1H-indazol-6-ylo)sulfamoilo]benzoesan metylu 2.39 jako brązowe ciało stałe (0.120 g, 53%). MS: 346.5 (M-1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12.87 (s, 1H), 11.02 (s, 1H), 10.33 (s, 1H), 8.15 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.94 (q, J = 2.4, 1.8 Hz, 1H), 7.77 (dd, J = 8.8, 2.5 Hz, 1H), 7.61 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.24 (tt, J = 1.8, 0.9 Hz, 1H), 7.07 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.86 (dd, J = 8.6, 1.8 Hz, 1H), 3.85 (d, J = 2.0 Hz, 3H). c. Do roztworu 2.39 (0.075 g, 0.22 mmol) w THF (1 ml) dodano NaBH4 (0.049 g, 1.30 mmol), a następnie wkroplono MeOH (0.050 ml). Reakcję prowadzono przez 2 godz. w RT. Do mieszaniny reakcyjnej dodano wodę (1 ml) i odsączono osad. Przesącz ekstrahowano DCM. Połączone fazy organiczne wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono metodą RP-HPLC. Związek 2.38 uzyskano w postaci białego ciała stałego (0.009 g, 13%). MS: 317.9 (M-1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12.82 (s, 1H), 10.21 (s, 2H), 7.91 (s, 1H), 7.82 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.57 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.47 (dd, J = 8.5, 2.5 Hz, 1H), 7.23 (s, 1H), 6.88 (dd, J = 8.6, 1.8 Hz, 1H), 6.80 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 4.42 (s, 2H), 3.17 (s, 1H). HRMS (M+1): obliczono dla C14H14N3O4S: 320.0700, znaleziono: 320.0694. 3-cyjano-4-hydroksy-N-(1H-indazol-6-ylo)benzeno-1-sulfonamid (2.40) a. Zgodnie z procedurą A utworzono chlorek 3-cyjano-4-hydroksybenzeno-1-sulfonylu 3.12 w postaci żółtego ciała stałego (0.573 g, 31%). MS: 216.5 (M-1) 1H NMR (300 MHz, Acetonitryl-d3) δ 9.64 (s, 1H), 8.33 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 8.12 (dd, J = 9.1, 2.5 Hz, 1H), 7.26 (d, J = 9.1 Hz, 1H). b. Postępując wg procedury B przygotowano 2.40 jako białe ciało stałe (0.333 g, 63%). MS: 315.0 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.87 (s, 1H), 12.25 (s, 1H), 10.33 (s, 1H), 7.97 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.95 (s, 1H), 7.78 (dd, J = 8.9, 2.4 Hz, 1H), 7.62 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.22 (s, 1H), 7.08 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 6.86 (dd, J = 8.7, 1.8 Hz, 1H). HRMS (M+1): obliczono dla C14H11N4O3S: 315.0546, znaleziono: 315.0545. 3-(aminometylo)-4-hydroksy-N-(1H-indazol-6-ylo)benzeno-1-sulfonamid (2.41) Zgodnie z procedurą D uwodorniono 2.40 (0.050 g, 0.16 mmol). Produkt oczyszczono metodą RP-HPLC. Uzyskano sól TFA 2.41 w postaci beżowego ciała stałego (0.025 g, 36%). MS: 317.0 (M-1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.85 (s, 1H), 11.30 (s, 1H), 10.31 (s, 1H), 8.01 (s, 3H), 7.93 (d, J = 0.9 Hz, 1H), 7.80 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 7.67 (dd, J = 8.6, 2.4 Hz, 1H), 7.62 – 7.56 (m, 1H), 7.24 (s, 1H), 6.99 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.90 (dd, J = 8.7, 1.8 Hz, 1H), 3.94 (q, J = 5.4 Hz, 2H). HRMS (M+1): obliczono dla C14H15N4O3S: 319.0859, znaleziono: 319.0854. N',2-dihydroksy-5-[(1H-indazol-6-ylo)sulfamoilo]benzeno-1-karboksyimidamid (2.42) Do r-ru 2.40 (0.050 g, 0.16 mmol) w EtOH (0.5 ml), dodano r-r chlorowodorku hydroksylaminy (0.044 g, 0.64 mmol) i Na2CO3 (0.034 g, 0.32 mmol) w wodzie (0.5 ml). Reakcję prowadzono przez 16 godz. w 80 °C. Po ochłodzeniu mieszaninę rozcieńczono wodą i zakwaszono 1 M r-rem HCl. Powstały osad odsączono, przemyto wodą i wysuszono. Następnie przemyto ACN i Et2O i wysuszono. Uzyskano 2.42 w postaci beżowego ciała stałego (0.015 g, 27%). MS: 348.0 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.10 (s, 1H), 12.81 (s, 1H), 10.26 (s, 1H), 10.18 (s, 1H), 8.15 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.58 (dd, J = 8.7, 2.3 Hz, 2H), 7.21 (s, 1H), 6.96 – 6.88 (m, 2H), 6.52 (s, 2H). HRMS (M+1): obliczono dla C14H14N5O4S: 348.0761, znaleziono: 348.0761. 4-hydroksy-N-(1H-indazol-6-ylo)-3-(1H-1,2,3,4-tetrazol-5-ylo)benzeno-1-sulfonamid (2.43) Mieszaninę 2.40 (0.070 g, 0.22 mmol), NaN3 (0.029 g, 0.45 mmol), chlorowodorku trietyloaminy (0.061 g, 0.45 mmol) i toluenu (1.5 ml) ogrzewano w 110 °C przez 20 godz. Fazę wodną oddzielono i przemyto Et2O. Następnie zakwaszono 1 M r-rem HCl, a powstały osad odsączono, przemyto wodą i wysuszono. Otrzymano 2.43 w postaci białego ciała stałego (0.045 g, 57%). MS: 358.7 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.85 (s, 1H), 12.16 (s, 1H), 10.38 (s, 1H), 8.49 (s, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.72 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.59 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.26 (s, 1H), 7.12 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.89 (d, J = 8.5 Hz, 1H). HRMS (M+1): obliczono dla C14H12N7O3S: 358.0717, znaleziono: 358.0717. 2-hydroksy-5-[(1H-indazol-6-ylo)sulfamoilo]benzeno-1-karboksyimidamid (2.45) a. Postępując wg procedury B przygotowano 3-cyjano-4-fluoro-N-(1H-indazol-6-ylo)benzeno-1-sulfonamid 2.46 w postaci różowego ciała stałego (0.806 g, 66%). MS: 317.1 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12.90 (s, 1H), 10.58 (s, 1H), 8.30 (dd, J = 5.9, 2.3 Hz, 1H), 8.06 (ddd, J = 8.8, 4.9, 2.4 Hz, 1H), 7.97 (s, 1H), 7.73 – 7.62 (m, 2H), 7.25 (s, 1H), 6.87 (dd, J = 8.6, 1.7 Hz, 1H). b. Do roztworu oksymu acetonu (0.050 g, 0.70 mmol) w bezw. DMF (3 ml), w atmosferze gazu obojętnego, dodano KOt-Bu (0.078 g, 0.70 mmol). Zawiesina zmieniła kolor na żółty. Po 30 min. mieszania, dodano 2.46 (0.200 g, 0.63 mmol). Osad uległ rozpuszczeniu i powstał pomarańczonowy roztwór. Reakcję prowadzono przez 15 godz. w RT i 2 godz. w 50 °C. Mieszaninę rozcieńczono nasyconym r-rem NH4Cl i ekstrahowano EtOAc. Połączone fazy organiczne przemyto wodą i solanką oraz wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskano 3-cyjano-N-(1H-indazol-6-ylo)-4-{[(propan-2-ylideno)amino]oksy}benzeno-1-sulfonamid 2.47 (0.390 g), który wykorzystano w nastepnym etapie bez oczyszczania. MS: 370.1 (M+1). c. Do r-ru 2.47 (0.380 g) w EtOH (2 ml) dodano 5% r-r HCl (2 ml) i ogrzewano w 100 °C przez 73 godz. Po tym czasie EtOH usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Do pozostałego wodnego r-ru dodano stały K2CO3 (aż uzyskano pH 9-10). Następnie ekstrahowano EtOAc. Połączone fazy organiczne przemyto wodą i solanką oraz wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono metodami FCC i RP-HPLC. Uzyskano 3-amino-N-(1H-indazol-6-ylo)-1,2-benzoksazolo-5-sulfonamid 2.48 jako białe ciało stałe (0.044 g, 21%). MS: 330.1 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.85 (s, 1H), 10.40 (s, 1H), 8.42 (d, J = 1.4 Hz, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.87 (dd, J = 8.9, 1.9 Hz, 1H), 7.64 – 7.57 (m, 2H), 7.20 (s, 1H), 6.88 (dd, J = 8.6, 1.8 Hz, 1H), 6.67 (s, 2H). d. Zgodnie z procedurą D uwodorniono 2.48 (0.020 g, 0.06 mmol). Surowy produkt przemyto pentanem i wysuszono. Uzyskano 2.45 jako beżowe ciało stałe (0.018 g, 89%). MS: 332.1 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.75 (s, 1H), 10.64 (s, 1H), 9.91 (s, 1H), 8.11 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 7.90 (s, 1H), 7.55 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.36 (dd, J = 9.3, 2.6 Hz, 1H), 7.19 (s, 1H), 6.91 (dd, J = 8.7, 1.8 Hz, 1H), 6.36 (d, J = 9.3 Hz, 1H). HRMS (M+1): obliczono dla C14H14N5O3S: 332.0812, znaleziono: 332.0811. 2-hydroksy-5-[(1H-indol-5-ylo)sulfamoilo]benzeno-1-karbotioamid (2.44) Mieszaninę 2.6 (0.025 g, 0.08 mmol), odczynnika Lawessona (0.034 g, 0.08 mmol) i THF (2 ml) ogrzewano w 70 °C przez 2 godz. Reakcję zakończono przez dodanie wody i r-ru NaHCO3. Mieszaninę ekstrahowano EtOAc. Produkt oczyszczono metodą FCC. Uzyskano 2.44 jako beżowe ciało stałe (0.008 g, 31%). MS: 348.1 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.59 (s, 1H), 11.02 (s, 1H), 10.06 (s, 1H), 9.72 (s, 1H), 9.51 (s, 1H), 8.30 (s, 1H), 7.49 (dd, J = 8.6, 2.4 Hz, 1H), 7.30 – 7.26 (m, 1H), 7.26 – 7.17 (m, 2H), 6.90 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.86 – 6.79 (m, 5H), 6.39 – 6.26 (m, 1H). 4-hydroksy-N-(1H-indazol-6-ylo)-3-(1H-pirazol-4-ylo)benzeno-1-sulfonamid (2.53) a. Zgodnie z procedurą B otrzymano 3-bromo-N-(1H-indazol-6-ylo)-4-metoksybenzeno-1-sulfonamid 2.49 w postaci żółtego ciała stałego (1.600 g, 80%). MS: 380.2 (M-1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12.89 (s, 1H), 10.34 (s, 1H), 7.94 (dd, J = 9.3, 1.7 Hz, 1H), 7.70 (dd, J = 8.7, 2.3 Hz, 1H), 7.63 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.28 – 7.24 (m, 1H), 7.21 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.89 (dd, J = 8.7, 1.8 Hz, 1H), 3.87 (s, 3H). b. Mieszaninę 2.49 (0.300 g, 0.78 mmol), 1.110 (0.263 g, 2.4 mmol), Pd(PPh3)4 (0.181 g, 0.16 mmol), Cs2CO3 (0.852 g, 2.6 mmol) i DME/EtOH/H2O (1:1:1, 3 ml), w atm. gazu obojętnego, ogrzewano w reaktorze mikrofalowym, przez 30 min w 140 °C. Powstały osad odsączono i przemyto wodą, a następnie oczyszczono metodą FCC. Uzyskano N-(1H-indazol-6-ylo)-4-metoksy-3-(1H-pirazol-4-ylo)benzeno-1-sulfonamid 2.51 jako jasnożółte ciało stałe (0.075 g, 26%). MS: 368.6 (M-1). c. Do r-ru 2.51 (0.075 g, 0.20 mmol) w DCE (2 ml) dodano 1 M r-r BBr3 w DCM (1.02 ml, 1.02 mmol) i prowadzono reakcję w RT przez 18 godz. Reakcję zakończono przez wylanie na lód. Fazę wodną ekstrahowano DCM/i-PrOH (4:1). Połączone fazy organiczne wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono metodą FCC. Uzyskano 2.53 jako brązowe ciało stałe (0.012 g, 17%). MS: 354.9 (M-1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.95 (s, 1H), 12.82 (s, 1H), 10.75 (s, 1H), 10.16 (s, 1H), 8.09 (s, 1H), 7.96 – 7.88 (m, 2H), 7.84 (s, 1H), 7.58 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.40 (dd, J = 8.5, 2.4 Hz, 1H), 7.27 (s, 1H), 6.96 – 6.88 (m, 2H). 4-hydroksy-N-(1H-indazol-6-ylo)-3-(1H-pirazol-5-ylo)benzeno-1-sulfonamid (2.54) Związek otrzymano analogicznie do 2.53, w etapie (b) stosując 2.50 i ogrzewając w 80 °C przez 20 min, natomiast w etapie (c) prowadząc reakcję w 80 °C przez 72 godz. Produkt 2.54 uzyskano w postaci brązowego ciała stałego (0.007 g, 12%). MS: 356.1 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.28 (s, 1H), 12.82 (s, 1H), 11.40 (s, 1H), 10.24 (s, 1H), 8.20 (s, 1H), 7.91 (s, 2H), 7.58 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.52 (dd, J = 8.6, 2.4 Hz, 1H), 7.26 (s, 1H), 7.00 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.91 (dd, J = 8.7, 1.8 Hz, 1H), 6.79 (s, 1H). HRMS (M+1): obliczono dla C16H14N5O3S: 356.0812, znaleziono: 356.0812. 2-(hydroksymetylo)-5-[(1H-indazol-6-ylo)sulfamoilo]benzamid (2.59) a. Zgodnie z procedurą B uzyskano N-(1H-indazol-6-ylo)-3-okso-1,3-dihydro-2-benzofurano-5-sulfonamid 2.60 jako różowe ciało stałe (0.130 g, 86%). MS: 330.1 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.89 (s, 1H), 10.60 (s, 1H), 8.15 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 8.09 (dd, J = 8.0, 1.7 Hz, 1H), 7.95 (d, J = 1.3 Hz, 1H), 7.84 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.62 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.29 (s, 1H), 6.90 (dd, J = 8.7, 1.8 Hz, 1H), 5.45 (s, 2H). b. Mieszaninę 2.60 (0.042 g, 0.13 mmol) i 7 M metanolowego r-ru amoniaku (1.8 ml) ogrzewano w 80 °C przez 2 godz. Wszystkie lotne substancje usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono metodą RP-HPLC. Uzyskano 2.59 jako białe ciało stałe (0.001 g, 2%). MS: 345.1 (M-1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12.87 (s, 1H), 10.42 (s, 1H), 8.01 (s, 1H), 7.94 (s, 1H), 7.87 – 7.78 (m, 2H), 7.69 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.61 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.27 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 6.91 (dd, J = 8.7, 1.8 Hz, 1H), 5.42 (s, 1H), 4.72 – 4.54 (m, 2H). 2-amino-5-[(1H-indazol-6-ylo)sulfamoilo]benzamid (2.62) a. Zgodnie z procedurą B uzyskano 2-fluoro-5-[(1H-indazol-6-ylo)sulfamoilo]benzoesan metylu 2.61 jako brązowe ciało stałe (0.220 g, 64%). MS: 348.1 (M-1). b. Mieszaninę 2.61 (0.070 g, 0.21 mmol) i wodnego r-ru amoniaku (3.2 ml) ogrzewano w 125 °C przez 72 godz. Wszystkie lotne substancje usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono metodą RP-HPLC. Uzyskano 2.62 jako białe ciało stałe (0.006 g, 9%). MS: 332.2 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12.80 (s, 1H), 10.02 (s, 1H), 8.10 – 7.85 (m, 3H), 7.58 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.44 (dd, J = 8.8, 2.2 Hz, 1H), 7.35 – 7.10 (m, 4H), 6.90 (dd, J = 8.7, 1.8 Hz, 1H), 6.69 (d, J = 8.8 Hz, 1H). 5-[(1H-indazol-6-ylo)sulfamoilo]-1H-indazolo-7-karboksyamid (2.63) a. Zgodnie z procedurą E uzyskano kwas 5-(benzylosulfanylo)-1H-indazolo-7-karboksylowy 2.67 jako żółte ciało stałe (0.284 g, 60%). MS: 285.6 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.45 (s, 1H), 13.18 (s, 1H), 8.13 (s, 1H), 8.03 (d, J = 1.4 Hz, 1H), 7.87 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 7.50 – 7.44 (m, 1H), 7.29 – 7.22 (m, 4H), 4.21 (s, 2H). b. Do roztworu 2.67 (0.282 g, 0.99 mmol) w DMF (2 ml), w 0 °C, dodano TBTU (0.637 g, 1.98 mmol) i mieszano przez 15 min. Następnie dodano 0.5 M r-r amoniaku w THF i prowadzono reakcję w RT przez 18 godz. Mieszaninę rozcieńczono EtOAc i przemyto r-rem NaHCO3 oraz solanką. Fazę organiczną wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Surowy produkt oczyszczono metodą FCC. Uzyskano 5-(benzylosulfanylo)-1H-indazolo-7-karboksyamid 2.68 (0.088 g, 31%). MS: 282.7 (M-1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.06 (s, 1H), 8.23 (s, 1H), 8.01 (d, J = 12.2 Hz, 2H), 7.88 (s, 1H), 7.55 (s, 1H), 7.38 – 7.14 (m, 5H), 4.26 (s, 2H). c. Zgodnie z procedurą F uzyskano surowy chlorek 7-karbamoilo-1H-indazolo-5-sulfonylu 2.69 jako żółte ciało stałe (0.213 g). MS: 258.6 (M-1). d. Postępując wg procedury B otrzymano 2.63 w postaci brązowego ciała stałego (0.012 g, 11%). MS: 355.7 (M-1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.48 (s, 1H), 12.80 (s, 1H), 10.33 (s, 1H), 8.41 – 8.30 (m, 3H), 8.27 (s, 1H), 7.90 (s, 1H), 7.70 (s, 1H), 7.57 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.21 (s, 1H), 6.90 (dd, J = 8.7, 1.8 Hz, 1H). HRMS (M+1): obliczono dla C15H13N6O3S: 357.0764, znaleziono: 357.0761. 5-[(1H-indazol-6-ylo)sulfamoilo]-1H-1,3-benzodiazolo-7-karboksyamid (2.64) a. Mieszaninę 5-bromo-2,3-diaminobenzoesanu metylu (0.400 g, 1.63 mmol) i ortomrówczanu trimetylu (3.0 ml) ogrzewano w 100 °C przez 3 godz. Powstały osad odsączono, przemyto Et2O oraz pentanem i wysuszono. Otrzymano 5-bromo-1H-1,3-benzodiazolo-7-karboksylan metylu 2.71 jako szare ciało stałe (0.362 g, 87%). MS: 255.6 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12.79 (s, 1H), 8.38 (s, 1H), 8.18 (s, 1H), 7.89 (s, 1H), 3.95 (s, 3H). b. Zgodnie z procedurą E uzyskano 5-(benzylosulfanylo)-1H-1,3-benzodiazolo-7-karboksylan metylu 2.72 w postaci pomarańczowego ciała stałego (0.368 g, 72%). MS: 299.0 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12.68 (s, 1H), 8.33 (s, 1H), 7.94 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 7.76 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 7.31 – 7.15 (m, 5H), 4.25 (s, 2H), 3.93 (s, 3H). c. Postępując wg procedury G otrzymano chlorowodorek 5-[(1H-indazol-6-ylo)sulfamoilo]-1H-1,3-benzodiazolo-7-karboksylanu metylu 2.73, jako różowe ciało stałe (0.077 g, 43%). MS: 372.0 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 10.56 (s, 1H), 8.80 (s, 1H), 8.32 (s, 2H), 7.91 (s, 1H), 7.58 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.29 (s, 1H), 6.89 (dd, J = 8.7, 1.8 Hz, 1H), 3.95 (s, 3H). d. Mieszaninę 2.73 (0.045 g, 0.11 mmol) i 7 M metanolowego r-ru amoniaku (5 ml) ogrzewano w 100 °C przez 48 godz. Wszystkie lotne substancje usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość zawieszono w wodzie i zakwaszono 1 M r-rem HCl. Osad odsączono, przemyto wodą i wysuszono. Produkt oczyszczono przez przemywanie ACN, Et2O i pentanem. Po wysuszeniu uzyskano 2.64 jako beżowe ciało stałe (0.013 g, 30%). MS: 357.5 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.28 (s, 1H), 12.83 (s, 1H), 10.45 (s, 1H), 9.10 (s, 1H), 8.63 (s, 1H), 8.35 (s, 1H), 8.07 (s, 1H), 7.98 – 7.86 (m, 2H), 7.57 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.24 (s, 1H), 6.88 (d, J = 8.4 Hz, 1H). HRMS (M+1): obliczono dla C15H13N6O3S: 357.0764, znaleziono: 357.0758. 5-[(1H-indazol-6-ylo)sulfamoilo]-1H-indazolo-3-karboksyamid (2.74) a. Zgodnie z procedurą E uzyskano 5-(benzylosulfanylo)-1H-indazolo-3-karboksylan etylu 2.77 jako żółte ciało stałe (0.389 g, 84%). MS: 313.5 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.94 (s, 1H), 7.99 – 7.92 (m, 1H), 7.60 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 7.43 (dd, J = 8.7, 1.7 Hz, 1H), 7.35 – 7.17 (m, 5H), 4.37 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 4.25 (s, 2H), 1.35 (t, J = 7.1 Hz, 3H). b. Zgodnie z procedurą F uzyskano 5-(chlorosulfonylo)-1H-indazolo-3-karboksylan etylu 2.78 jako jasnożółte ciało stałe (0.173 g, 65%). MS: 289.7 (M+1). 1H NMR (300 MHz, Chloroform-d3) δ 12.80 (s, 1H), 8.97 (s, 1H), 8.12 (d, J = 1.9 Hz, 2H), 4.66 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 1.57 (t, J = 7.1 Hz, 3H). c. Postępując wg procedury B otrzymano 5-[(1H-indazol-6-ylo)sulfamoilo]-1H-indazolo-3-karboksylan etylu 2.79 w postaci białego ciała stałego (0.178 g, 77%). MS: 386.1 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 14.30 (s, 1H), 12.84 (s, 1H), 10.47 (s, 1H), 8.54 (s, 1H), 7.91 (s, 1H), 7.82 – 7.75 (m, 2H), 7.58 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.27 (s, 1H), 6.89 (dd, J = 8.7, 1.8 Hz, 1H), 4.38 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 1.33 (t, J = 7.1 Hz, 3H). d. Mieszaninę 2.79 (0.062 g, 0.16 mmol) i 7 M metanolowego r-ru amoniaku (3 ml) ogrzewano w 100 °C przez 20 godz. Wszystkie lotne substancje usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono metodą FCC. Uzyskano 2.74 jako beżowe ciało stałe (0.017 g, 30%). MS: 357.1 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.94 (s, 1H), 12.83 (s, 1H), 10.44 (s, 1H), 8.76 – 8.71 (m, 1H), 7.89 (s, 2H), 7.75 – 7.68 (m, 2H), 7.56 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.51 (s, 1H), 7.30 – 7.22 (m, 1H), 6.89 (dd, J = 8.7, 1.8 Hz, 1H). 1-hydroksy-N-(1H-indazol-6-ylo)-4-okso-3,4-dihydroftalazyno-6-sulfonamid (2.75) a. Zgodnie z procedurą A uzyskano 4-[(1H-indazol-6-ylo)sulfamoilo]benzeno-1,2-dikarboksylan dimetylu 2.80 jako różowe ciało stałe (0.067 g, 50%). MS: 390.1 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.92 (s, 1H), 10.62 (s, 1H), 8.15 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 8.02 – 7.93 (m, 2H), 7.86 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.64 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.25 (s, 1H), 6.87 (dd, J = 8.7, 1.8 Hz, 1H), 3.84 (s, 3H), 3.82 (s, 3H). b. Do r-ru 2.80 (0.034 g, 0.09 mmol) w EtOH (1 ml) dodano monohydrat hydrazyny (0.085 ml, 1.75 mmol). Reakcję prowadzono w temp. wrzenia rozpuszczalnika przez 4 godz. Wszystkie lotne substancje usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Osad przemyto Et2O i rozpuszczono w wodzie. Następnie r-r zakwaszono 0.1 M r-rem HCl, a powstały osad odsączono, przemyto wodą oraz Et2O i wysuszono. Otrzymano 2.75 w postaci białego ciała stałego (0.003 g, 10%). MS: 358.1 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.89 (s, 1H), 11.83 (s, 2H), 10.68 (s, 1H), 8.62 – 8.07 (m, 3H), 7.95 (s, 1H), 7.62 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.27 (s, 1H), 6.88 (dd, J = 8.7, 1.9 Hz, 1H). 3-hydroksy-6-[(1H-indazol-6-ylo)sulfamoilo]pirydyno-2-karboksyamid (2.81) a. Zgodnie z procedurą E uzyskano 6-(benzylosulfanylo)-3-hydroksypirydyno-2-karboksylan metylu 3.13 jako jasnożółte ciało stałe (0.334 g, 78%). MS: 276.0 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.32 (s, 1H), 7.45 – 7.39 (m, 3H), 7.35 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.31 – 7.25 (m, 2H), 7.23 – 7.18 (m, 1H), 4.35 (s, 2H), 3.92 (s, 3H). b. Zgodnie z procedurą F uzyskano surowy 6-(chlorosulfonylo)-3-hydroksypirydyno-2-ckarboksylan metylu 3.14 jako bezbarwny olej (0.150 g). MS: 251.9 (M+1). c. Postępując wg procedury B utworzono 3-hydroksy-6-[(1H-indazol-6-ylo)sulfamoilo]pirydyno-2-karboksylan metylu 3.15. MS: 348.9 (M+H). Następnie rozpuszczono 3.15 w 7 M metanolowym r-rze amoniaku (3 ml) i prowadzono reakcję w RT przez 72 godz. Wszystkie lotne substancje usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono metodą RP-HPLC. Otrzymano 2.81 jako białe ciało stałe (0.006 g, 5%). MS: 333.9 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12.88 (br s, 2H), 10.33 (br s, 1H), 8.70 (s, 1H), 8.44 (s, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.86 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.60 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.39 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.30 (s, 1H), 6.96 (dd, J = 8.6, 1.7 Hz, 1H). HRMS (M+1): obliczono dla C13H12N5O4S: 334.0605, znaleziono: 334.0610. 5-hydroksy-2-[(1H-indazol-6-ylo)sulfamoilo]pirydyno-4-karboksamid (2.82) a. Roztwór 2-bromo-5-hydroksyizonikotynianu metylu (0.600 g, 2.59 mmol) w 7 M r-rze amoniaku w metanolu (10 ml), mieszano w RT przez 20 godz. Wszystkie lotne substancje usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskano surowy 2-bromo-5-hydroksypirydyno-4-karboksyamid 3.16 jako beżowe ciało stałe (0.620 g). MS: 217.0 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 10.19 (s, 1H), 7.66 (s, 1H), 7.58 (s, 1H), 7.38 (s, 1H). b. Zgodnie z procedurą E przygotowano 2-(benzylosulfanylo)-5-hydroksypirydyno-4-karboksyamid 3.17 jako pomarańczowe ciało stałe (0.479 g, 69%). MS: 261.1 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12.19 (s, 1H), 8.48 (s, 1H), 8.27 (s, 1H), 8.20 (s, 1H), 7.68 (s, 1H), 7.39 – 7.17 (m, 5H), 4.35 (s, 2H). c. Postępując wg procedury G uzyskano 2.82 jako beżowe ciało stałe (0.012 g, 9%). MS: 334.1 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12.82 (s, 1H), 10.50 (s, 1H), 8.67 (s, 1H), 8.49 – 8.09 (m, 3H), 7.92 (s, 1H), 7.57 (s, 1H), 7.27 (s, 1H), 6.92 (s, 1H). HRMS (M+1): obliczono dla C13H12N5O4S: 334.0605, znaleziono: 334.0601. 2-hydroksy-5-[(1H-indazol-6-ylo)sulfamoilo]pirydyno-3-karboksyamid (2.86) a. Do zawiesiny 2-hydroksy-5-sulfononikotynianu etylu (0.305 g, 1.23 mmol) w SOCl2 (2.25 ml, 30.84 mmol), dodano kilka kropli DMF (kat.). Prowadzono reakcję w temp. wrzenia przez 3 godz. Wszystkie lotne substancje usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość odparowano trzykrotnie z bezw. toluenem. Uzyskano surowy 2-chloro-5-(chlorosulfonylo)pirydyno-3-karboksylan etylu 2.88 jako żółte ciało stałe (0.560 g). b. Zgodnie z procedurą B stosując zamiast pirydyny TEA (2.1 eq.) i r-r (1:1) DMA/dioksan (5 ml), przygotowano 2-chloro-5-[(1H-indazol-6-ylo)sulfamoilo]pirydyno-3-karboksylan etylu 2.89 jako żółte ciało stałe (0.110 g, 23%). MS: 380.9 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12.94 (s, 1H), 10.72 (s, 1H), 8.81 (s, 1H), 8.45 (s, 1H), 8.00 (s, 1H), 7.67 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.28 (s, 1H), 6.88 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 4.31 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 1.26 (t, J = 7.0 Hz, 3H). c. Do r-ru 2.89 (0.066 g, 0.17 mmol) w MeOH (2 ml) dodano NaOMe (0.028 g, 0.52 mmol) i mieszano w RT przez 18 godz. Mieszaninę schłodzono i rozcieńczono wodą oraz r-rem NH4Cl. Następnie ekstrahowano EtOAc. Połączone fazy organiczne przemyto solanką i wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskano 5-[(1H-indazol-6-ylo)sulfamoilo]-2-metoksypirydyno-3-karboksylan metylu 2.90 jako żółte ciało stałe (0.034 g, 53%). MS: 363.8 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12.90 (s, 1H), 10.53 (s, 1H), 8.63 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 8.43 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 7.97 (s, 1H), 7.64 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.28 (s, 1H), 6.88 (dd, J = 8.6, 1.8 Hz, 1H), 3.94 (s, 3H), 3.81 (s, 3H). d. Do wodnego r-ru amoniaku dodano 2.90 (0.033 g, 0.09 mmol) i mieszano w RT przez 16 godz. Wszystkie lotne substancje usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskano 5-[(1H-indazol-6-ylo)sulfamoilo]-2-metoksypirydyno-3-karboksyamid 2.91 jako brązowe ciało stałe (0.029 g, 92%).%). MS: 346.8 (M-1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12.86 (s, 1H), 8.56 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 8.46 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 7.94 (s, 1H), 7.86 (s, 1H), 7.76 (s, 1H), 7.61 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.26 (s, 1H), 6.87 (dd, J = 8.6, 1.8 Hz, 1H), 3.97 (s, 3H). e. Do r-ru 2.91 (0.025 g, 0.07 mmol) w 4 M r-rze HCl w dioksanie (1.3 ml, 5.20 mmol) dodano kilka kropli wody. Mieszaninę ogrzewano w 50 °C przez 1 godz. Wszystkie lotne substancje usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono metodą RP-HPLC. Uzyskano 2.86 jako białe ciało stałe (0.005 g, 19%). MS: 334.1 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12.90 (s, 1H), 10.45 (s, 1H), 8.82 – 8.68 (m, 1H), 8.55 (d, J = 2.9 Hz, 1H), 7.97 (s, 2H), 7.73 (d, J = 3.4 Hz, 1H), 7.65 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.26 (s, 1H), 6.88 (dd, J = 8.6, 1.7 Hz, 1H). 2-amino-5-[(1H-indazol-6-ylo)sulfamoilo]pirydyno-3-karboksyamid (2.92) Do 7 M metanolowego r-ru amoniaku (3 ml) dodano 2.89 (0.020 g, 0.05 mmol). Mieszaninę ogrzewano w 120 °C przez 16 godz. Wszystkie lotne substancje usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono metodą FCC. Otrzymano 2.92 jako białe ciało stałe (0.005 g, 29%). MS: 331.6 (M-1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12.84 (s, 1H), 10.14 (s, 1H), 8.31 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 8.27 – 8.17 (m, 2H), 7.94 (s, 1H), 7.88 (s, 2H), 7.61 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.49 (s, 1H), 7.23 (s, 1H), 6.90 (dd, J = 8.7, 1.8 Hz, 1H). HRMS (M+1): obliczono dla C13H13N6O3S: 333.0764, znaleziono: 333.0758. 6-[(1H-indazol-6-ylo)sulfamoilo]-3-okso-2,3-dihydropirydazyno-4-karboksyamid (2.83) a. Zgodnie z procedurą E uzyskano 6-(benzylosulfanylo)-3-okso-2,3-dihydropirydazyno-4-karboksylan metylu 3.18 jako jasnożółte ciało stałe (0.400 g, 36%). MS: 277.1 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.43 (s, 1H), 7.74 (s, 1H), 7.42 – 7.23 (m, 5H), 4.28 (s, 2H), 3.79 (s, 3H). b. Do 7 M metanolowego r-ru amoniaku (3 ml) dodano 3.18 (0.106 g, 0.38 mmol) i mieszano w RT przez 17 godz. Wszystkie lotne substancje usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Osad przemyto wodą oraz Et2O i wysuszono. Uzyskano 6-(benzylosulfanylo)-3-okso-2,3- dihydropirydazyno-4-karboksyamid 3.19 jako żółte ciało stałe (0.061 g, 61%). MS: 260.7 (M-1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.72 (s, 1H), 8.80 (s, 1H), 8.06 (s, 1H), 7.89 (s, 1H), 7.46 – 7.19 (m, 5H), 4.31 (s, 2H). c. Postępując wg procedury G otrzymano 2.83 jako brązowe ciało stałe (0.015, 20%). MS: 355.0 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 14.31 (s, 1H), 12.95 (s, 1H), 10.87 (s, 1H), 8.55 – 8.46 (m, 1H), 8.33 (s, 1H), 8.22 – 8.10 (m, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.67 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.32 (s, 1H), 6.91 (dd, J = 8.6, 1.8 Hz, 1H). 3-amino-6-[(1H-indazol-6-ylo)sulfamoilo]pirazyno-2-karboksyamid (2.84) a. Zgodnie z procedurą E uzyskano 3-amino-6-(benzylosulfanylo)pirazyno-2-karboksylan metylu 3.20 jako żółte ciało stałe (0.376 g, 64%). MS: 276.7 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.20 (s, 1H), 7.39 – 7.35 (m, 2H), 7.32 – 7.24 (m, 4H), 7.23 – 7.20 (m, 1H), 4.29 (s, 2H), 3.88 (s, 3H). b. Do wodnego r-ru amoniaku (5 ml) dodano 3.20 (0.170 g, 0.62 mmol) i ogrzewano w 85 °C przez 1 godz. Wszystkie lotne substancje usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Osad rozpuszczono w wodzie, dodano r-r NaHCO3 i ekstrahowano EtOAc. Połączone fazy organiczne przemyto solanką i wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymano 3-amino-6-(benzylosulfanylo)pirazyno-2-karboksyamid 3.21 jako żółte ciało stałe (0.112 g, 70%). MS: 261.2 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.10 (s, 1H), 8.05 (s, 1H), 7.67 (s, 1H), 7.48 (s, 2H), 7.36 – 7.16 (m, 5H), 4.39 (s, 2H). c. Postępując wg procedury F przygotowano surowy chlorek 5-amino-6-karbamoilopirazyno-2-sulfonylu 3.22 jako żółte ciało stałe (0.032 g). MS: 235.5 (M-1). d. Zgodnie z procedurą B uzyskano 2.84 jako białe ciało stałe (0.011 g, 24%). MS: 334.0 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.87 (s, 1H), 10.40 (s, 1H), 8.50 (s, 1H), 8.36 (s, 1H), 8.14 (s, 1H), 8.06 (s, 1H), 7.98 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.60 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.29 (s, 1H), 6.93 (dd, J = 8.6, 1.7 Hz, 1H). 2-(difluorometylo)-5-[(1H-indazol-6-ylo)sulfamoilo]pirydyno-3-karboksyamid (2.85) a. Zgodnie z procedurą B uzyskano 2-(difluorometylo)-5-[(1H-indazol-6-ylo)sulfamoilo]pirydyno-3-karboksylan etylu 3.23 jako różowe ciało stałe (0.051 g, 39%). MS:397.1 (M+1). b. Do 7 M metanolowego r-ru amoniaku (1.8 ml) dodano 3.23 (0.050 g, 0.12 mmol) i mieszano w RT przez 64 godz. Wszystkie lotne substancje usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Osad przemyto wodą i wysuszono. Otrzymano 2.85 jako beżowe ciało stałe (0.035 g, 79%). MS: 368.1 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.93 (s, 1H), 10.80 (s, 1H), 9.03 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 8.40 (s, 1H), 8.33 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 8.03 – 7.91 (m, 2H), 7.66 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.40 – 7.07 (m, 2H), 6.91 (dd, J = 8.7, 1.9 Hz, 1H). 2-hydroksy-3-[(1H-indazol-6-ylo)sulfamoilo]-6-metoksybenzamid (2.96) a. Zgodnie z procedurą B przygotowano 3-[(1H-indazol-6-ylo)sulfamoilo]-2,6-dimetoksybenzoesan metylu 2.95 jako różowe ciało stałe (0.158 g, 95%). MS: 390.6 (M-1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.83 (s, 1H), 10.27 (s, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.86 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.58 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.21 (s, 1H), 6.94 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 6.90 (dd, J = 8.7, 1.8 Hz, 1H), 3.85 (s, 3H), 3.82 (s, 3H), 3.79 (s, 3H). b. Do 7 M metanolowego roztworu amoniaku (4 ml) w MeOH (3 ml) dodano 2.95 (0.155 g, 0.40 mmol) i ogrzewano przez 21 godz. w 100 °C. Wszystkie lotne substancje usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono metodą FCC. Uzyskano 2.96 jako białe ciało stałe (0.005 g, 3%). MS: 361.0 (M-1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 16.02 (s, 1H), 12.82 (s, 1H), 10.06 (s, 1H), 8.48 (s, 1H), 8.29 (s, 1H), 7.95 – 7.78 (m, 2H), 7.55 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.22 (s, 1H), 6.93 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.62 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 3.90 (s, 3H). Widmo NOESY wykazało korelację pomiędzy δ 3.91 (s, 3H) i 6.62 (d, J = 9.1 Hz, 1H). 2,6-dihydroksy-3-[(1H-indazol-6-ylo)sulfamoilo]benzamid (2.93) a. Zgodnie z procedurą C przekształcono kwas 6-metoksysalicylowy (1.500 g, 8.92 mmol) w chlorek kwasowy. Następnie rozpuszczono w dioksanie (10 ml) i wkroplono do mieszaniny dioksanu (5 ml) i wodnego r-ru amoniaku (5 ml), w 0 °C. Doprowadzono reakcję do RT i mieszano przez 15 godz. Wszystkie lotne substancje usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Osad zawieszono w wodzie i zakwaszono 1 M r-rem HCl. Następnie esktrahowano EtOAc. Połączone fazy organiczne przemyto r-rem NaHCO3 oraz solanką i wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Osad przemyto mieszaniną Et2O i DCM. Stałą pozostałość odrzucono, a przesącz zebrano i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskano 2-hydroksy-6-metoksyybenzamid 2.98 jako beżowe ciało stałe (0.478 g, 32%). MS: 168.0 (M+1). 1H NMR (300 MHz, Chloroform-d) δ 13.70 (s, 1H), 8.11 (br s, 1H), 7.30 (t, J = 8.4 Hz, 1H), 6.63 (dd, J = 8.4, 0.9 Hz, 1H), 6.45 – 6.38 (m, 1H), 5.92 (br s, 1H), 3.95 (s, 3H). b. Zgodnie z procedurą A uzyskano chlorek 2-hydroksy-3-karbamoilo-4-metoksybenzeno-1-sulfonylu 2.99 jako beżowe ciało stałe (0.183 g, 50%). MS: 265.8 (M+1). c. Zgodnie z procedurą B otrzymano 2.96 jako różowe ciało stałe (0.206 g, 94%). MS: 361.0 (M-1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 16.02 (s, 1H), 12.80 (s, 1H), 10.06 (s, 1H), 8.47 (s, 1H), 8.29 (s, 1H), 7.89 (s, 1H), 7.84 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.55 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.22 (s, 1H), 6.93 (dd, J = 8.7, 1.7 Hz, 1H), 6.62 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 3.90 (s, 3H). d. Do zawiesiny 2.96 (0.050 g, 0.14 mmol) w DCE (1 ml) dodano 1M r-r BBr3 w DCM (2.5 ml, 2.50 mmol). Reakcję prowadzono w 60 °C przez 52 godz. Mieszaninę wylano na lód, powstały osad odsączono i wysuszono. Produkt oczyszczono metodą RP-HPLC. Uzyskano 2.93 jako białe ciało stałe (0.012 g, 25%). MS: 349.1 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 15.79 (s, 1H), 12.78 (s, 1H), 12.36 (s, 1H), 9.96 (s, 1H), 8.37 (s, 2H), 7.89 (s, 1H), 7.67 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.54 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.19 (s, 1H), 6.91 (dd, J = 8.7, 1.7 Hz, 1H), 6.39 (s, 1H). HRMS (M+1): obliczono dla C14H13N4O5S: 349.0601, znaleziono: 349.0600. 6-hydroksy-3-[(1H-indazol-6-ylo)sulfamoilo]-2-metylobenzamid (2.100) a. Zgodnie z procedurą A uzyskano chlorek 3-karbamoilo-4-metoksy-2-metylobenzeno-1-sulfonylu 2.102 jako białe ciało stałe (0.340 g, 79%). 1H NMR (300 MHz, Chloroform-d) δ 8.11 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 6.91 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 6.05 (s, 1H), 5.76 (s, 1H), 3.95 (s, 3H), 2.77 (s, 3H). b. Zgodnie z procedurą B otrzymano 3-[(1H-indazol-6-ylo)sulfamoilo]-6-metoksy-2-metylobenzamid 2.103 jako białe ciało stałe (0.190 g, 93%). MS: 361.5 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12.83 (s, 1H), 10.51 (s, 1H), 7.91 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 7.83 – 7.70 (m, 1H), 7.61 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.51 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 7.23 (dd, J = 1.9, 1.0 Hz, 1H), 7.01 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 6.92 (dd, J = 8.7, 1.8 Hz, 1H), 3.77 (s, 3H). Widmo NOESY wykazało korelację pomiędzy δ 3.77 (s, 3H) i 7.01 (d, J = 8.9 Hz, 1H). c. Do zawiesiny 2.103 (0.057 g, 0.16 mmol) w DCE (1 ml) dodano 1M r-r BBr3 w DCM (0.7 ml, 0.70 mmol). Reakcję prowadzono w 60 °C przez 16 godz. Mieszaninę wylano na lód, powstały osad odsączono i wysuszono. Produkt oczyszczono metodą FCC. Uzyskano 2.100 jako białe ciało stałe (0.006 g, 11%). MS: 345.0 (M-1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12.80 (s, 1H), 10.42 (s, 2H), 7.91 (s, 1H), 7.80 – 7.67 (m, 2H), 7.58 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.41 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 7.21 – 7.14 (m, 1H), 6.88 (dd, J = 8.6, 1.8 Hz, 1H), 6.75 (d, J = 8.8 Hz, 1H). 2-fluoro-6-hydroksy-3-[(1H-indazol-6-ylo)sulfamoilo]benzamid (2.104) a. Zgodnie z procedurą C przekształcono kwas 2,6-difluorobenzoesowy (1.500 g, 9.49 mmol) w chlorek kwasowy. Następnie rozpuszczono w dioksanie (5 ml) i wkroplono do wodnego r-ru amoniaku (10 ml), w 0 °C. Reakcję doprowadzono do RT i prowadzono przez 18 godz. Wszystkie lotne substancje usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Osad zawieszono w wodzie, zakwaszono 1 M r-rem HCl, odsączono i wysuszono. Uzyskano 2,6-difluorobenzamid 2.106 jako białe ciało stałe (0.927 g, 62%). MS: 158.0 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.12 (s, 1H), 7.83 (s, 1H), 7.53 – 7.44 (m, 1H), 7.19 – 7.10 (m, 2H).6.05 (s, 1H), 5.76 (s, 1H), 3.95 (s, 3H), 2.77 (s, 3H). b. Zgodnie z procedurą A otrzymano chlorek 2,4-difluoro-3-karbamoilobenzeno-1-sulfonylu 2.107 jako beżowe ciało stałe (0.247 g, 31%). MS: 256.6 (M+1). c. Zgodnie z procedurą B uzyskano 2,6-difluoro-3-[(1H-indazol-6-ylo)sulfamoilo]benzamid 2.108 jako różowe ciało stałe (0.213 g, 73%). MS: 351.7.0 (M-1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12.90 (s, 1H), 10.89 (s, 1H), 8.29 (s, 1H), 8.01 (s, 1H), 7.95 (s, 1H), 7.94 – 7.86 (m, 1H), 7.64 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.37 – 7.28 (m, 1H), 7.26 (s, 1H), 6.92 (dd, J = 8.7, 1.8 Hz, 1H). d. Mieszaninę 2.108 (0.138 g, 0.39 mmol), alkoholu benzylowego (0.127 g, 1.18 mmol), KOH (0.66 g, 1.18 mmol) i DMSO (1 ml) ogrzewano w 100 °C przez 1 godz. Reakcję zakończono przez dodanie wody i zakwaszenie 1 M r-rem HCl. Następnie mieszaninę ekstrahowano EtOAc. Połączone fazy organiczne przemyto solanką i wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono metodą FCC. Otrzymano 6-(benzyloksy)-2-fluoro-3-[(1H-indazol-6-ylo)sulfamoilo]benzamid 2.110 jako białe ciało stałe (0.048 g, 28%). MS: 441.9.0 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12.87 (s, 1H), 10.70 (s, 1H), 8.03 (s, 1H), 7.94 (s, 1H), 7.79 (dd, J = 8.7 Hz, 1H), 7.70 (s, 1H), 7.62 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.43 – 7.30 (m, 5H), 7.26 (s, 1H), 7.07 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 6.93 (dd, J = 8.7, 1.8 Hz, 1H), 5.18 (s, 2H). e. Zgodnie z procedurą D uwodorniono 2.110 (0.015 g, 0.03 mmol). Produkt oczyszczono metodą FCC. Uzyskano 2.104 jako białe ciało stałe (0.004 g, 34%). MS: 351.1 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12.85 (s, 1H), 11.69 (s, 1H), 10.58 (s, 1H), 7.93 (s, 2H), 7.76 (s, 1H), 7.66 (dd, J = 8.7 Hz, 1H), 7.60 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.22 (s, 1H), 6.91 (dd, J = 8.7, 1.8 Hz, 1H), 6.75 (d, J = 8.8 Hz, 1H). 3.3 Synteza makrocyklicznych salicylamidów 3-(2-aminofenoksy)propan-1-ol (2.117)[170] a. Mieszaninę 2-nitrofenolu (1.000 g, 7.19 mmol), NaOH (0.288 g, 7.19 mmol) i bezw. DMF (8 ml), w atm. gazu obojętnego, ogrzewano w 80 °C przez 30 min. Następnie dodano 3-bromopropanol (0.650 ml, 7.19 mmol) i kontynuowano ogrzewanie w 80 °C przez 18 godz. Mieszaninę ochłodzono, rozcieńczono wodą i ekstrahowano EtOAc. Połączone fazy organiczne przemyto solanką i wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono metodą FCC. Otrzymano 3-(2-nitrofenoksy)propan-1-ol 2.118 w postaci zielonego oleju (1.072 g, 75%). MS: 198.0 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 7.88 (dd, J = 8.1, 1.7 Hz, 1H), 7.54 (ddd, J = 9.0, 7.4, 1.7 Hz, 1H), 7.15 – 7.08 (m, 1H), 7.08 – 6.99 (m, 1H), 4.28 (t, J = 5.8 Hz, 2H), 3.90 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 2.10 (p, J = 5.7 Hz, 2H). b. Zgodnie z procedurą D uwodorniono 2.118 (1.070 g, 5.43 mmol). Produkt nie wymagał oczyszczania. Uzyskano 2.117 jako czarny olej (0.876 g, 97%). MS: 168 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 6.85 – 6.77 (m, 2H), 6.76 – 6.68 (m, 2H), 4.15 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.88 (q, J = 5.8 Hz, 2H), 3.77 (s, 2H), 2.07 (p, J = 6.0 Hz, 2H), 1.73 (t, J = 5.3 Hz, 1H). 2,4-difluoro-5-{[2-(3-hydroksypropoksy)fenylo]sulfamoilo}benzamid (2.114) a. Zgodnie z procedurą A otrzymano mieszaninę (1:1) chlorku 2,4-difluoro-5-karbamoilobenzeno-1-sulfonylu 2.116 i kwasu 2.122 jako beżowe ciało stałe (1.525 g). MS: 255.9 (M+1, amid), 254.8 (M-1, kwas). 1H NMR (amid, 300 MHz, DMSO-d6) δ 8.85 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 8.73 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.25 – 7.16 (m, 2H), 6.96 (s, 1H), 6.66 (s, 1H). b. Zgodnie z procedurą B przygotowano 2.114 jako beżowe ciało stałe (0.266 g, 35%). MS: 386.9 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 9.81 (s, 1H), 7.94 (dd, J = 7.9 Hz, 1H), 7.82 (br s, 2H), 7.62 (dd, J = 10.1 Hz, 1H), 7.27 – 7.19 (m, 1H), 7.19 – 7.11 (m, 1H), 6.97 – 6.83 (m, 2H), 4.47 (t, J = 4.9 Hz, 1H), 3.82 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.46 (q, J = 5.7 Hz, 2H), 1.67 (p, J = 6.3 Hz, 2H). Uzyskano także wywodzący się z 2.122, kwas 2,4-difluoro-5-{[2-(3-hydroksypropoksy)fenylo]sulfamoilo}benzoesowy 3.24 jako beżowe ciało stałe (0.252 g, 30%). MS: 385.0 (M-1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.71 (br s, 1H), 9.87 (s, 1H), 8.11 (dd, J = 8.1 Hz, 1H), 7.64 (dd, J = 10.4 Hz, 1H), 7.28 – 7.11 (m, 2H), 6.97 – 6.83 (m, 2H), 4.45 (br s, 1H), 3.80 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.44 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 1.69 – 1.58 (m, 2H). c. Do roztworu 3.24 (0.250 g, 0.65 mmol) w THF (3 ml), w 0 °C, dodano CDI (0.262 g, 1.61 mmol) i mieszano w RT przez 1 godz. Następnie dodano 0.5 M r-r amoniaku w THF (6 ml) i kontynuowano reakcję w RT przez 20 godz. Wszystkie lotne substancje usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozcieńczono wodą, zakwaszono 1 M r-rem HCl i ekstrahowano EtOAc. Połączone fazy organiczne przemyto solanką i wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono metodą FCC. Uzyskano 2.114 jako białe ciało stałe (0.064 g, 26%). MS: 387.0 (M+1). 2-(benzyloksy)-4-fluoro-5-{[2-(3-hydroksypropoksy)fenylo]sulfamoilo}benzamid (2.123) Mieszaninę 2.114 (0.070 g, 0.18 mmol), KOH (0.022 g, 0.40 mmol), alkoholu benzylowego (0.020 g, 0.18 mmol) i DMSO (4 ml) ogrzewano w 50 °C przez 2 godz. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono wodą, zakwaszono 1 M r-rem HCl i ekstrahowano EtOAc. Połączone fazy organiczne przemyto solanką i wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono metodą FCC. Uzyskano 2.123 jako białe ciało stałe (0.032 g, 37%). MS: 475.2 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 9.48 (s, 1H), 8.05 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.70 (s, 1H), 7.53 (s, 1H), 7.52 – 7.46 (m, 2H), 7.45 – 7.36 (m, 3H), 7.31 (d, J = 12.2 Hz, 1H), 7.21 (dd, J = 7.8, 1.6 Hz, 1H), 7.16 – 7.07 (m, 1H), 6.93 – 6.81 (m, 2H), 5.33 (s, 2H), 4.48 (t, J = 5.1 Hz, 1H), 3.78 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.46 (q, J = 5.9 Hz, 2H), 1.66 (p, J = 6.3 Hz, 2H). 4-fluoro-2-(hydroksy)-5-{[2-(3-hydroksypropoksy)fenylo]sulfamoilo}benzamid (2.127) a. Zgodnie z procedurą C utworzono chlorek kwasowy z kwasu 4-fluoro-2-hydroksybenzoesowego (0.500 g, 3.20 mmol). Następnie rozpuszczono w bezw. dioksanie (5 ml) i dodano do mieszaniny wodnego r-ru amoniaku (10 ml) i dioksanu (5 ml), w 0 °C. Prowadzono reakcję w 80 °C przez 3 godz. Wszystkie lotne substancje usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozcieńczono wodą, zakwaszono 1 M r-rem HCl i ekstrahowano EtOAc. Połączone fazy organiczne przemyto solanką i wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono metodą FCC. Uzyskano 4-fluoro-2-hydroksybenzamid 2.125 jako brązowe ciało stałe (0.286 g, 58%). MS: 155.9 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.55 (s, 1H), 8.40 (s, 1H), 8.03 – 7.88 (m, 2H), 6.80 – 6.68 (m, 2H). b. Zgodnie z procedurą A otrzymano chlorek 2-fluoro-4-hydroksy-5-karbamoilobenzeno-1-sulfonylu 2.126 jako beżowe ciało stałe (0.217 g, 50%). MS: 253.9 (M+1). 1H NMR (300 MHz, Acetonitryl-d3) δ 14.43 (s, 1H), 8.35 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.44 (s, 1H), 6.95 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 6.65 (s, 1H). c. Zgodnie z procedurą B uzyskano 2.127 jako beżowe ciało stałe (0.164 g, 64%). MS: 385.1 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 14.10 (s, 1H), 9.35 (s, 1H), 8.58 (s, 1H), 8.21 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.05 (s, 1H), 7.22 (dd, J = 7.8, 1.5 Hz, 1H), 7.15 – 7.06 (m, 1H), 6.95 – 6.81 (m, 3H), 4.48 (s, 1H), 3.84 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.49 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 1.72 (p, J = 6.2 Hz, 2H). 4-(3-chloropropoksy)-5-(chlorosulfonylo)-2-hydroksybenzoesan metylu (2.132) a. Mieszaninę 2,4-dihydroksybenzoesanu metylu (2.500 g, 14.87 mmol), 1-bromo-3-chloropropanu (1.592 ml, 15.61 mmol), K2CO3 (6.165 g, 44.60 mmol) i ACN (20 ml) ogrzewano w 80 °C przez 18 godz. Mieszaninę rozcieńczono wodą, zakwaszono 1 M r-rem HCl i ekstrahowano EtOAc. Połączone fazy organiczne przemyto solanką i wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono metodą FCC. Uzyskano 4-(3-chloropropoksy)-2-hydroksybenzoesan metylu 2.135 jako beżowe ciało stałe (1.500 g, 41%). MS: 245.1 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 10.76 (s, 1H), 7.77 – 7.67 (m, 1H), 6.60 – 6.50 (m, 2H), 4.14 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 3.86 (s, 3H), 3.78 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.16 (p, J = 6.3 Hz, 2H). b. Zgodnie z procedurą A otrzymano 2.132 jako szare ciało stałe (0.690 mg, 82%). MS: 340.9 (M-1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 10.90 (br s, 1H), 8.15 (s, 1H), 6.54 (s, 1H), 4.14 (t, J = 5.5 Hz, 2H), 3.92 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.88 (s, 3H), 2.12 (p, J = 6.2 Hz, 2H). 8-hydroksy-2-(2-hydroksyfenylo)-1,1-diokso-2,3,4,5-tetrahydro-6,1λ⁶,2-benzoksatiazocyno-9-karboksyamid (2.138) a. Zgodnie z procedurą B otrzymano 4-(3-chloropropoksy)-2-hydroksy-5-[(2-hydroksyfenylo)sulfamoilo]benzoesan metylu 2.131 jako brązowe ciało stałe (0.277 g, 91%). MS: 416.1 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.14 (s, 1H), 9.74 (s, 1H), 8.37 (s, 1H), 8.07 (s, 1H), 7.13 (dd, J = 7.9, 1.4 Hz, 1H), 6.90 (ddd, J = 8.0, 1.6 Hz, 1H), 6.77 – 6.65 (m, 3H), 4.21 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.88 – 3.78 (m, 5H), 2.21 (p, J = 6.0 Hz, 2H). b. Mieszaninę 2.131 (0.020 g, 0.05 mmol), K2CO3 (0.023 g, 0.017 mmol) i DMF (1 ml) ogrzewano w 80 °C przez 16 godz. Mieszaninę rozcieńczono wodą, zakwaszono 1 M r-rem HCl i ekstrahowano EtOAc. Połączone fazy organiczne przemyto solanką i wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskano surowy 8-hydroksy-2-(2-hydroksyfenylo)-1,1-diokso-2,3,4,5-tetrahydro-6,1λ⁶,2-benzoksatiazocyno-9-karboksylan metylu 3.25 jako brązowe ciało stałe (0.035 g). MS: 380.1 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.11 (s, 1H), 8.41 (s, 1H), 8.15 (s, 1H), 7.23 (dd, J = 7.9, 1.4 Hz, 1H), 7.13 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.03 – 6.93 (m, 1H), 6.81 (td, J = 7.7, 1.3 Hz, 1H), 6.65 (s, 1H), 4.59 – 4.37 (m, 4H), 3.86 (s, 3H), 2.03 – 1.85 (m, 2H). c. Mieszaninę 3.25 (0.033 g, 0.09 mmol) i 7 M metanolowego r-ru amoniaku (4 ml) ogrzewano w 65 °C przez 72 godz. Wszystkie lotne substancje usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Osad zawieszono w wodzie, zakwaszono 1 M r-rem HCl i przesączono. Następnie osad przemyto wodą i wysuszono. Uzyskano 2.138 jako żółte ciało stałe (0.005 g, 16%). MS: 365.1 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 14.11 (s, 1H), 8.59 (s, 1H), 8.33 (s, 1H), 8.29 (s, 1H), 7.94 (s, 1H), 7.26 (dd, J = 8.0, 1.5 Hz, 1H), 7.14 (dd, J = 8.2, 1.1 Hz, 1H), 6.97 (td, J = 7.8, 1.6 Hz, 1H), 6.86 – 6.76 (m, 1H), 6.52 (s, 1H), 4.58 – 4.36 (m, 4H), 1.98 – 1.91 (m, 2H). HRMS (M+1): obliczono dla C16H17N2O6S: 365.0802, znaleziono: 365.0863. 17-hydroksy-2,2-diokso-10,14-dioksa-2λ⁶-tia-3-azatricyklo[13.4.0.0⁴,⁹]nonadeka-1(19),4(9),5,7,15,17-heksaeno-18-karboksyamid (2.113) a. Do 0.5 M r-ru amoniaku (6 ml) w THF, w -10 °C, dodano 2.132 (0.200 g, 0.58 mmol). Reakcję doprowadzono do RT i mieszano przez 64 godz. Wszystkie lotne substancje usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Osad zawieszono w wodzie, zakwaszono 1 M r-rem HCl, odsączono i wysuszono. Produkt oczyszczono metodą FCC. Uzyskano 4-(3-chloropropoksy)-2-hydroksy-5-sulfamoilobenzoesan metylu 3.26 jako białe ciało stałe (0.090 g, 48%). MS: 322.0 (M-1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.09 (s, 1H), 8.18 (s, 1H), 7.07 (s, 2H), 6.77 (s, 1H), 4.27 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.89 (s, 3H), 3.83 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.27 (p, J = 6.1 Hz, 2H). b. Do r-ru 2-bromofenolu (0.321 g, 1.85 mmol) w DMF (2 ml), w 0 °C, dodano NaH (0.076 g, 1.89 mmol) i mieszano przez 30 min w RT. Następnie do r-ru fenolanu wkroplono r-r 3.26 (0.060 g, 0.19 mmol) w DMF (3 ml). Reakcję prowadzono przez 30 min w RT i 17 godz. w 65 °C. Mieszaninę wylano na lód, zakwaszono 1 M r-rem HCl i ekstrahowano EtOAc. Połączone fazy organiczne przemyto solanką i wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono metodą FCC. Uzyskano 4-[3-(2-bromofenoksy)propoksy]-2-hydroksy-5-sulfamoilobenzoesan metylu 2.129 jako beżowe ciało stałe (0.053 g, 63%). MS: 458.0 (M-1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.08 (s, 1H), 8.18 (s, 1H), 7.56 (dd, J = 7.9, 1.4 Hz, 1H), 7.40 – 7.27 (m, 1H), 7.18 – 6.99 (m, 3H), 6.96 – 6.83 (m, 1H), 6.78 (s, 1H), 4.35 (t, J = 5.9 Hz, 2H), 4.25 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 3.89 (s, 3H), 2.34 – 2.25 (m, 2H). c. Mieszaninę 2.129 (0.052 g, 0.11 mmol), Cs2CO3 (0.184 g, 0.56 mmol), [Pd2(dba)3]·CHCl3 (0.012 g, 0.01 mmol), t-BuXPhos (0.010 g, 0.02 mmol) i toluenu (6 ml), w atm. gazu obojętnego, ogrzewano w 85 °C przez 15 godz. Mieszaninę rozcieńczono wodą, zakwaszono 1 M r-rem HCl i ekstrahowano EtOAc. Połączone fazy organiczne przemyto solanką i wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono metodą FCC. Uzyskano 17-hydroksy-2,2-diokso-10,14-dioksa-2λ⁶-tia-3-azatricyklo[13.4.0.0⁴,⁹]nonadeka-1(19),4(9),5,7,15,17-heksaeno-18-karboksylan metylu 2.128 jako żółte ciało stałe (0.030 g, 72%). MS: 380.3 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.10 (s, 1H), 8.41 (s, 1H), 8.15 (s, 1H), 7.24 (dd, J = 8.0, 1.5 Hz, 1H), 7.13 (dd, J = 8.2, 1.1 Hz, 1H), 7.02 – 6.93 (m, 1H), 6.86 – 6.77 (m, 1H), 6.66 (s, 1H), 4.49 (q, J = 5.1 Hz, 4H), 3.86 (s, 3H), 2.02 – 1.90 (m, 2H). d. Rozpuszczono 2.128 (0.025 g, 0.07 mmol) w 7 M metanolowym r-rze amoniaku (4 ml) i ogrzewano w 65 °C przez 18 godz. Wszystkie lotne substancje usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Osad zawieszono w wodzie, zakwaszono 1 M r-rem HCl, odsączono, przemyto wodą i wysuszono. Następnie osad rozpuszczono w EtOAc i przesączono przez filtr strzykawkowy. Przesącz odparowano. Uzyskano 2.113 jako jasnożółte ciało stałe (0.011 g, 46%). MS: 365.0 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 14.11 (s, 1H), 8.60 (br s, 1H), 8.33 (s, 1H), 8.28 (s, 1H), 7.93 (br s, 1H), 7.26 (dd, J = 8.0, 1.7 Hz, 1H), 7.14 (dd, J = 8.2, 1.4 Hz, 1H), 7.03 – 6.93 (m, 1H), 6.87 – 6.76 (m, 1H), 6.51 (s, 1H), 4.54 – 4.39 (m, 4H), 1.99 – 1.89 (m, 2H). HRMS (M+1): obliczono dla C16H17N2O6S: 365.0802, znaleziono: 365.0793. 3.4 Synteza benzotiadiazynowych inhibitorów CD73 Procedura H – zasadowa cyklizacja Mieszaninę amidu (1.0 eq.) i wodnego r-ru amoniaku (20 ml/1 mmol amidu) ogrzewano w 100 °C przez 2 godz. Wszystkie lotne substancje usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Dodano wody i zakwaszono 1 M r-rem HCl. W przypadku gdy produkt ulegał strąceniu, zawiesinę wirowano w 3200 rpm przez 10 min. Usuwano supernatant oczyszczano przez przemywanie wodą, ACN i Et2O. Po każdej zmianie rozpuszczalnika, zawiesinę sonikowano i wirowano, a supernatant odrzucano. Gdy produkt nie strącał się, mieszaninę ekstrahowano roztworem DCM/i-PrOH (4:1). Połączone fazy organiczne suszono nad bezw. Na2SO4, środek suszący odsączano, a przesącz odparowywano pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczano metodą FCC lub RP-HPLC. Procedura I – sprzęganie amidowe Do r-ru kwasu (1.0 eq.) w DMF (0.1-0.2 M) dodano odczynnik sprzęgający (HATU, CDI, PyBOP, BOP lub EDC, 1.1 eq.) i mieszano w RT przez 30 min. Po tym czasie dodano r-r aminy (1.1 eq.) i DIPEA (3.0 eq.) w DMF (0.5-1.0 M). Reakcję prowadzono w RT przez 16-72 godz. Do mieszaniny dodano wodę i ekstrahowano EtOAc. Połączone fazy organiczne przemyto solanką i wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczano metodą FCC lub RP-HPLC. 3-amino-7-chloro-5-hydroksy-2H-1λ⁶,2,4-benzotiadiazyno-1,1-dion (2.139) Związek otrzymano jak 2.1, w etapie (d) stosując 0.5 M r-r amoniaku w dioksanie. Produkt 2.139 uzyskano jako brązowe ciało stałe (0.040 g, 83%). MS: 247.8 (M+1). 1H NMR (400 MHz, Metanol-d4) δ 7.19 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 6.99 (d, J = 2.1 Hz, 1H). 7-chloro-3-(2-chlorofenoksy)-5-hydroksy-4H-1λ⁶,2,4-benzotiadiazyno-1,1-dion (2.140) Związek otrzymano jak 2.1, w etapie (d) stosując 2-chlorofenol. Produkt 2.140 uzyskano jako beżowe ciało stałe (0.008 g, 7%). MS: 359.0 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.45 (s, 1H), 11.70 (s, 1H), 7.67 – 7.63 (m, 1H), 7.51 – 7.45 (m, 2H), 7.44 – 7.37 (m, 1H), 7.24 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 7.10 (d, J = 2.2 Hz, 1H). HRMS (M+1): obliczono dla C13H9Cl2N2O4S: 358.9655, znaleziono: 358.9656. 2-amino-5-chloro-3-hydroksybenzeno-1-sulfonamid (2.150) a. Zawiesinę 2.152 (5.450 g, 20.75 mmol) w 50% r-rze H2SO4 (125 ml) ogrzewano w temp. wrzenia przez 64 godz. Mieszaninę schłodzono w łaźni lodowej, zobojętniono 30% r-rem NaOH i ekstrahowano EtOAc. Połączone fazy organiczne przemyto wodą oraz solanką i wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskano 2-amino-5-chloro-3-metoksybenzeno-1-sulfonamid 2.153 jako szare ciało stałe (3.918 g, 80%). MS: 236.9 (M+1). 1H NMR (300 MHz, Chloroform-d) δ 7.38 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 6.89 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 5.01 (s, 2H), 4.89 (s, 2H), 3.90 (s, 3H). b. Mieszaninę 2.153 (3.040 g, 12.84 mmol), 1 M r-ru BBr3 w DCM (40.00 ml, 40.00 mmol) i DCE (30 ml) ogrzewano w 80 °C przez 7 godz. Po ochłodzeniu mieszaninę wylano na lód. Następnie fazę wodną ekstrahowano EtOAc, Połączone fazy organiczne przemyto solanką i wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono metodą FCC. Uzyskano 2.150 jako brązowe ciało stałe (1.920 g, 67%). MS: 223.1 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.37 (s, 1H), 7.38 (s, 2H), 7.05 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.79 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 5.42 (s, 2H). 3-[(2-chlorofenylo)metylo]-5-hydroksy-4H-1λ⁶,2,4-benzotiadiazyno-1,1-dion (2.141) a. Do r-ru 2-amino-3-hydroksybenzeno-1-sulfonamidu 2.147 (0.120 g, 0.64 mmol) i TEA (0.11 ml, 0.77 mmol) w THF (5 ml), w 0 °C, wkroplono chlorek 2-(2-chlorofenylo)acetylu (0.133 g, 0.70 mmol). Reakcję doprowadzono do RT i mieszano przez 15 godz. Mieszaninę rozcieńczono wodą i ekstrahowano DCM. Połączone fazy organiczne przemyto r-rem NaHCO3 oraz solanką i wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono metodą FCC. Uzyskano 2-(2-chlorofenylo)-N-(2-hydroksy-6-sulfamoilofenylo)acetamid 2.149 jako białe ciało stałe (0.090 g, 41%). MS: 341.1 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.86 (s, 1H), 9.26 (s, 1H), 7.52 (s, 1H), 7.42 (s, 1H), 7.36 – 7.32 (m, 1H), 7.31 – 7.26 (m, 3H), 7.11 (s, 3H), 3.86 (s, 2H). b. Zgodnie z procedurą H uzyskano 2.141 jako beżowe ciało stałe (0.016 g, 30%). MS: 323.0 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.61 (s, 1H), 11.15 (s, 1H), 7.50 – 7.44 (m, 1H), 7.43 – 7.37 (m, 1H), 7.36 – 7.31 (m, 2H), 7.27 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 7.19 (dd, J = 8.0, 1.3 Hz, 1H), 7.14 (dd, J = 7.9, 1.3 Hz, 1H), 4.21 (s, 2H). HRMS (M+1): obliczono dla C14H12ClN2O3S: 323.0252, znaleziono: 323.0253. 7-chloro-3-[(2-chlorofenylo)(hydroksy)metylo]-5-hydroksy-4H-1λ⁶,2,4-benzotiadiazyno-1,1-dion (2.142) a. Do r-ru kwasu 2-chloromigdałowego (0.500 g, 2.68 mmol) w DCM (2 ml) dodano chlorek acetylu (0.286 ml, 4.02 mmol). Reakcję prowadzono w RT przez 18 godz. Wszystkie lotne substancje usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskano surowy kwas 2-(acetyloksy)-2-(2-chlorofenylo)octowy 2.156 jako jasnożółty olej (0.672 g). MS: 227.1 (M-1). b. Zgodnie z procedurą C otrzymano octan 2-chloro-1-(2-chlorofenylo)-2-oksoetylu 2.155 jako żółty olej (0.214 g, 99%). c. Do r-ru 2.155 (0.214 g, 0.86 mmol) i TEA (0.16 ml, 1.18 mmol) w THF (3.5 ml), w 0 °C, wkroplono r-r 2.150 (0.175 g, 0.79 mmol) w THF (1.5 ml). Reakcję doprowadzono do RT i mieszano przez 16 godz. Mieszaninę rozcieńczono wodą i ekstrahowano DCM. Połączone fazy organiczne przemyto r-rem NaHCO3, wodą oraz solanką i wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono metodą FCC. Uzyskano octan [(4-chloro-2-hydroksy-6-sulfamoilofenylo)karbamoilo](2-chlorofenylo)metylu 2.154 jako beżowe ciało stałe (0.176 g, 52%). MS: 431.0 (M-1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.77 (s, 1H), 9.64 (s, 1H), 7.82 – 7.75 (m, 1H), 7.53 (dd, J = 7.9, 1.4 Hz, 1H), 7.47 – 7.41 (m, 1H), 7.41 – 7.35 (m, 1H), 7.31 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 7.16 (s, 2H), 7.12 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.46 (s, 1H), 2.14 (s, 3H). d. Zgodnie z procedurą H otrzymano 2.142 jako żółte ciało stałe (0.044 g, 59%). MS: 373.0 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.96 (s, 1H), 10.79 (s, 1H), 7.57 – 7.51 (m, 1H), 7.50 – 7.45 (m, 1H), 7.42 – 7.36 (m, 2H), 7.26 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 7.14 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 5.91 (s, 1H), 5.76 (s, 1H). HRMS (M+1): obliczono dla C14H11Cl2N2O4S: 372.9811, znaleziono: 372.9813. 7-chloro-5-hydroksy-3-(1H-indol-2-ylo)-4H-1λ⁶,2,4-benzotiadiazyno-1,1-dion (2.143) a. Zgodnie z procedurą C uzyskano surowy chlorek 1H-indolo-2-karbonylu 3.27 jako brązowe ciało stałe (0.114 g). b. Mieszaninę 2.150 (0.068 g, 0.31 mmol), 3.27 (0.050 g, 0.28 mmol) i dioksanu (2 ml) ogrzewano w 80 °C przez 5 godz. Następnie dodano wody i ekstrahowano EtOAc. Połączone fazy organiczne przemyto solanką i wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono metodą FCC. Uzyskano N-(4-chloro-2-hydroksy-6-sulfamoilofenylo)-1H-indolo-2-karboksyamid 2.158 jako pomarańczowe ciało stałe (0.038 g, 37%). MS: 363.9 (M-1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.75 – 11.57 (m, 1H), 10.59 (s, 1H), 9.48 (s, 1H), 7.66 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.45 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.37 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.28 (s, 1H), 7.24 – 7.16 (m, 2H), 7.06 (t, J = 7.9 Hz, 1H). c. Zgodnie z procedurą H uzyskano 2.143 jako brązowe ciało stałe (0.012 g, 42%). MS: 348.1 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.09 (s, 1H), 11.79 (s, 1H), 11.25 (s, 1H), 7.79 – 7.58 (m, 2H), 7.50 (s, 1H), 7.28 (s, 2H), 7.21 – 7.04 (m, 2H). 7-chloro-N-(2-chlorofenylo)-5-hydroksy-1,1-diokso-4H-1λ⁶,2,4-benzotiadiazyno-3-karboksyamid (2.144) a. Do r-ru 2.150 (0.200 g, 0.90 mmol) w mieszaninie (1:1) DMA/Et2O (3 ml), w 0 °C, wkroplono chloroglioksylan etylu (0.110 ml, 0.99 mmol). Po 30 min wkroplono TEA (0.131 ml, 0.94 mmol) i mieszano w 0 °C przez 3 godz. Dodano wodę i r-r NaHCO3, i ekstrahowano EtOAc. Połączone fazy organiczne przemyto solanką i wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskano [(4-chloro-2-hydroksy-6-sulfamoilofenylo)karbamoilo] mrówczan etylu 3.28 jako brązowe ciało stałe (0.290 g). MS: 323.0 (M+1). b. Rozpuszczono surowy 3.28 (0.290 g) w 5% r-rze NaOH (3 ml) i ogrzewano w 100 °C przez 2 godz. Po ochłodzeniu r-r zakwaszono 1 M r-rem HCl. Powstały osad odsączono, przemyto wodą i wysuszono. Produkt oczyszczono przez przemywanie ACN, Et2O i pentanem. Uzyskano kwas 7-chloro-5-hydroksy-1,1-diokso-4H-1λ⁶,2,4-benzotiadiazyno-3-karboksylowy 2.159 jako żółte ciało stałe (0.101 g, 41%). MS: 276.9 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.99 (s, 1H), 10.73 (s, 1H), 7.32 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 7.14 (d, J = 2.1 Hz, 1H). c. Zgodnie z procedurą I uzyskano 2.144 jako żółte ciało stałe (0.007 g, 12%). MS: 386.0 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.76 (s, 1H), 7.74 (dd, J = 8.0, 1.5 Hz, 1H), 7.59 (dd, J = 8.0, 1.4 Hz, 1H), 7.43 (ddd, J = 7.8, 1.4 Hz, 1H), 7.38 – 7.28 (m, 2H), 7.13 (s, 1H). HRMS (M+1): obliczono dla C14H10Cl2N3O4S: 385.9764, znaleziono: 385.9764. 2-(7-chloro-5-hydroksy-1,1-diokso-4H-1λ⁶,2,4-benzotiadiazyn-3-ylo)-N-(2-chlorofenylo)acetamid (2.145) Związek otrzymano jak 2.144, w etapie (a) stosując 3-chloro-3-oksopropionian metylu. Produkt 2.145 uzyskano jako białe ciało stałe (0.005 g, 9%). MS: 400.0 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.82 (s, 1H), 9.91 (s, 1H), 7.77 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.52 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.35 (td, J = 7.9, 1.4 Hz, 1H), 7.27 – 7.15 (m, 2H), 7.10 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 3.94 (s, 2H). N-[(7-chloro-5-hydroksy-1,1-diokso-4H-1λ⁶,2,4-benzotiadiazyn-3-ylo)metylo]benzamid (2.146) a. Zgodnie z procedurą I uzyskano surowy N-(4-chloro-2-hydroksy-6-sulfamoilofenylo)-2-(fenyloformamido)acetamid 3.29 jako pomarańczowe ciało stałe (0.075g). MS: 381.9 (M-1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.35 (s, 1H), 9.26 (s, 1H), 9.03 (s, 1H), 7.93 – 7.85 (m, 2H), 7.59 – 7.53 (m, 1H), 7.52 – 7.45 (m, 2H), 7.28 (d, J = 2.2 Hz, 3H), 7.13 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 4.04 (d, J = 4.9 Hz, 2H). b. Zgodnie z procedurą H uzyskano 2.146 jako brązowe ciało stałe (0.015 g, 32%). MS: 363.9 (M-1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.76 (s, 1H), 11.58 (s, 1H), 9.11 – 9.00 (m, 1H), 7.93 – 7.87 (m, 2H), 7.61 – 7.55 (m, 1H), 7.54 – 7.47 (m, 2H), 7.24 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 7.10 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 4.45 (d, J = 5.9 Hz, 2H). HRMS (M+1): obliczono dla C15H13ClN3O4S: 366.0310, znaleziono: 366.0311. 3-(1H-1,3-benzodiazol-2-ylo)-7-chloro-5-hydroksy-4H-1λ⁶,2,4-benzotiadiazyno-1,1-dion (2.165) a. Zgodnie z procedurą I uzyskano N-(4-chloro-2-hydroksy-6-sulfamoilofenylo)-1H-1,3-benzodiazolo-2-karboksyamid 3.30 jako brązowe ciało stałe (0.150 g). MS: 367.0 (M+1). b. Zgodnie z procedurą H otrzymano 2.165 w postaci beżowego ciała stałego (0.023 g, 16%). MS: 349.1 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 7.76 – 7.66 (m, 2H), 7.42 – 7.33 (m, 2H), 7.30 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 7.15 (d, J = 2.1 Hz, 1H). HRMS (M+1): obliczono dla C14H10ClN4O3S: 349.0157, znaleziono: 349.0157. 7-chloro-5-hydroksy-3-(1H-imidazol-2-ylo)-4H-1λ⁶,2,4-benzotiadiazyno-1,1-dion (2.166) Związek otrzymano jak 2.165. Produkt 2.166 uzyskano jako brązowe ciało stałe (0.011 g, 10%). MS: 298.9 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 7.47 (s, 2H), 7.21 (s, 1H), 7.07 (s, 1H). HRMS (M+1): obliczono dla C10H8ClN4O3S: 299.0000, znaleziono: 299.0001. 7-chloro-5-hydroksy-3-(1H-pirazol-5-ylo)-4H-1λ⁶,2,4-benzotiadiazyno-1,1-dion (2.167) Związek otrzymano jak 2.165. Produkt 2.167 uzyskano jako beżowe ciało stałe (0.008 g, 17%). MS: 299.0 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.85 (s, 1H), 12.00 (s, 1H), 10.14 (d, J = 6.1 Hz, 1H), 8.05 (s, 1H), 7.31 (s, 1H), 7.14 (s, 1H), 6.94 (s, 1H). HRMS (M-1): obliczono dla C10H6ClN4O3S: 296.9855, znaleziono: 296.9855. 5-hydroksy-3-(1H-indol-2-ylo)-4H-1λ⁶,2,4-benzotiadiazyno-1,1-dion (2.168) Związek otrzymano jak 2.143, w etapie (b) stosując 2.147. Produkt 2.168 uzyskano jako brązowe ciało stałe (0.040 g, 41%). MS: 314.1 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.09 (s, 1H), 11.29 – 10.97 (m, 2H), 7.70 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.63 (s, 1H), 7.51 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.39 – 7.23 (m, 3H), 7.23 – 7.05 (m, 2H). HRMS (M+1): obliczono dla C15H12N3O3S: 314.0594, znaleziono: 314.0594. 3-(1H-1,3-benzodiazol-2-ylo)-5-hydroksy-4H-1λ⁶,2,4-benzotiadiazyno-1,1-dion (2.169) Związek otrzymano jak 2.165, w etapie (a) stosując 2.147. Produkt 2.169 uzyskano jako brązowe ciało stałe (0.040 g, 41%). MS: 314.1 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.09 (s, 1H), 11.29 – 10.97 (m, 2H), 7.70 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.63 (s, 1H), 7.51 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.39 – 7.23 (m, 3H), 7.23 – 7.05 (m, 2H). 3-(1-benzotiofen-2-ylo)-5-hydroksy-4H-1λ⁶,2,4-benzotiadiazyno-1,1-dion (2.170) Związek otrzymano jak 2.143, w etapie (b) stosując 2.147. Produkt 2.170 uzyskano jako brązowe ciało stałe (0.086 g, 64%). MS: 331.1 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.50 (s, 1H), 11.26 (s, 1H), 8.61 (s, 1H), 8.17 – 8.00 (m, 2H), 7.62 – 7.46 (m, 2H), 7.41 – 7.17 (m, 3H). 5-hydroksy-3-{1H-pirolo[2,3-c]pirydyn-2-ylo}-4H-1λ⁶,2,4-benzotiadiazyno-1,1-dion (2.171) Związek otrzymano jak 2.143, w etapie (b) stosując 2.147. Produkt 2.171 uzyskano jako żółte ciało stałe (0.010 g, 38%). MS: 315.0 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.99 (s, 1H), 8.22 (d, J = 6.1 Hz, 1H), 7.97 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.50 (s, 1H), 7.26 – 7.12 (m, 2H), 7.10 – 6.99 (m, 1H). HRMS (M+1): obliczono dla C14H11N4O3S: 315.0546, znaleziono: 315.0540. 5-hydroksy-3-{1H-pirolo[3,2-c]pirydyn-2-ylo}-4H-1λ⁶,2,4-benzotiadiazyno-1,1-dion (2.172) Związek otrzymano jak 2.143, w etapie (b) stosując 2.147. Produkt 2.172 uzyskano jako brązowe ciało stałe (0.012 g, 15%). MS: 315.0 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 9.37 (s, 1H), 8.45 (d, J = 6.5 Hz, 1H), 7.94 – 7.79 (m, 2H), 7.32 – 7.17 (m, 2H), 7.10 (d, J = 6.8 Hz, 1H). HRMS (M+1): obliczono dla C14H11N4O3S: 315.0546, znaleziono: 315.0540. 5-hydroksy-3-(6-hydroksy-1H-indol-2-ylo)-4H-1λ⁶,2,4-benzotiadiazyno-1,1-dion (2.173) Związek otrzymano jak 2.165, w etapie (a) stosując 2.147. Produkt 2.173 uzyskano jako żółte ciało stałe (0.008 g, 9%). MS: 330.0 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.62 (s, 1H), 10.95 (s, 1H), 9.43 (s, 1H), 7.47 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.35 – 7.18 (m, 2H), 7.19 – 7.06 (m, 1H), 6.84 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 6.63 (dd, J = 8.7, 2.0 Hz, 1H). 3-[(2-chlorofenylo)amino]-5-hydroksy-1,1-diokso-4H-1λ⁶,4-benzotiazyno-2-karbonitryl (2.174) a. Do r-ru 4-metoksy-2-aminobenzotiazolu (1.500 g, 8.32 mmol) w THF (15 ml) wkroplono azotyn izoamylu (2.46 ml, 18.31 mmol). Mieszaninę ogrzewano w 75 °C przez 30 min. Reakcję zakończono przez dodanie wody. Mieszaninę ekstrahowano EtOAc. Połączone fazy organiczne przemyto solanką i wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono metodą FCC. Uzyskano 4-metoksy-1,3-benzotiazol 2.183 w postaci pomarańczowego ciała stałego (0.730 g, 53%). MS: 166.7 (M+1). 1H NMR (300 MHz, Chloroform-d) δ 8.91 (s, 1H), 7.53 (dd, J = 8.1, 0.8 Hz, 1H), 7.39 (dd, J = 8.0 Hz, 1H), 6.97 – 6.91 (m, 1H), 4.07 (s, 3H). b. Mieszaninę 2.183 (0.700 g, 4.24 mmol), monohydratu hydrazyny (1.54 ml, 31.78 mmol) i EtOH (10 ml), w atm. gazu obojętnego, ogrzewano w 90 °C przez 4 godz. Reakcję zakończono przez dodanie r-ru AcOH (6 ml) w wodzie (200 ml). Mieszaninę ekstrahowano DCM. Połączone fazy organiczne przemyto solanką i wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskano 2-amino-3-metoksybenzeno-1-tiol 2.181 jako żółty olej (0.559 g, 91%). MS: 156.4 (M+1). 1H NMR (300 MHz, Chloroform-d) δ 6.98 (dd, J = 7.7, 1.4 Hz, 1H), 6.73 (dd, J = 8.1, 1.4 Hz, 1H), 6.64 (dd, J = 7.9 Hz, 1H), 4.24 (br s, 2H), 3.85 (s, 3H), 3.03 (br s, 1H). c. Do r-ru 2.181 (0.297 g, 1.91 mmol) w EtOH (5 ml) dodano 1 M r-r NaOH (1.91 ml, 1.91 mmol) i mieszano w RT przez 5 min. Następnie wkroplono jodoacetonitryl (0.138 ml, 1.91 mmol) i prowadzono reakcję przez 2 godz. Do mieszaniny dodano wodę i AcOH, a następnie ekstrahowano EtOAc. Połączone fazy organiczne przemyto solanką i wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Po oczyszczaniu metodą FCC, otrzymano 2-[(2-amino-3-metoksyfenylo)sulfanylo]acetonitryl 2.185 w postaci żółtego oleju (0.285 g, 77%). MS: 195.7 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.00 (dd, J = 7.9, 1.3 Hz, 1H), 6.90 (dd, J = 8.0, 1.1 Hz, 1H), 6.59 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 5.05 (s, 2H), 3.86 (s, 2H), 3.80 (s, 3H). d. Do r-ru 2.185 (0.250 g, 1.29 mmol) w bezw. THF (5 ml), w 0 °C, wkroplono chloromrówczan etylu (0.142 ml, 1.48 mmol) i r-r pirydyny (0.208 ml, 2.57 mmol) w bezw. THF (2 ml). Usunięto łaźnię lodową i kontynuowano reakcję w RT przez 19 godz. Wszystkie lotne substancje usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozcieńczono wodą i Et2O. Fazę organiczną oddzielono, przemyto wodą oraz solanką i wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskano 2.186 jako beżowe ciało stałe (0.275 g, 80%). MS: 267.0 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8.57 (s, 1H), 7.33 (dd, J = 8.2 Hz, 1H), 7.05 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.98 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 4.16 (s, 2H), 4.03 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 3.77 (s, 3H), 1.18 (t, J = 6.6 Hz, 3H). e. Do r-ru 2.186 (0.216 g, 0.81 mmol) w DCM (4 ml), w 0 °C, wkroplono r-r m-CPBA (0.560 g, 2.49 mmol) w DCM (1 ml). Reakcję doprowadzono do RT i mieszano przez 16 godz. Do mieszaniny dodano r-r NaHCO3 i DCM. Fazę wodną ekstrahowano DCM. Połączone fazy organiczne przemyto solanką i wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskano N-[2-(cyjanometanosulfonylo)-6-metoksyfenylo]karbaminian etylu 2.187 w postaci żółtego ciała stałego (0.192 g, 79%). MS: 299.1 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.70 (s, 1H), 7.65 – 7.60 (m, 1H), 7.59 – 7.55 (m, 2H), 5.08 (s, 2H), 4.05 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 3.86 (s, 3H), 1.18 (t, J = 7.0 Hz, 3H). f. Rozpuszczono 2.187 (0.188 g, 0.63 mmol) w 0.5 M r-rze NaOH (2.3 ml, 1.15 mmol) i mieszano w RT przez 2 godz. Mieszaninę zakwaszono 1 M roztworem HCl i ekstrahowano n-butanolem. Połączone fazy organiczne przemyto solanką i wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskano 3-hydroksy-5-metoksy-1,1-diokso-4H-1λ⁶,4-benzotiazyno-2-karbonitryl 2.188 jako żółte ciało stałe (0.152 g, 96%). MS: 252.9 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.19 (s, 1H), 7.20 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.15 – 7.00 (m, 2H), 3.87 (s, 3H). g. Dodano 2.188 (0.122 g, 0.48 mmol) do szybko mieszanego r-ru H3PO4 (0.02 ml, 1.93 mmol) w POCl3 (1.00 ml). Następnie dodano chlorowodorek pirydyny (0.16 g) i ogrzewano mieszaninę w 100 °C przez 19 godz. Reakcję zakończono przez wylanie na lód. Powstały osad odsączono, przemyto wodą i wysuszono. Uzyskano 3-chloro-5-metoksy-1,1-diokso-4H-1λ⁶,4-benzotiazyno-2-karbonitryl 2.180 jako brązowe ciało stałe (0.108 g, 82%). MS: 268.9 (M-1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 7.47 (s, 2H), 7.39 (s, 1H), 3.96 (s, 3H). h. Mieszaninę 2.180 (0.055 g, 0.20 mmol), 2-chloroaniliny (0.103 g, 0.81 mmol) i KOt-Bu (0.090 g, 0.81 mmol) ogrzewano w reaktorze mikrofalowym, w 200 °C, przez 30 min. Mieszaninę rozcieńczono wodą i ekstrahowano EtOAc. Połączone fazy organiczne przemyto solanką i wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono metodą FCC. Otrzymano 3-[(2-chlorofenylo)amino]-5-metoksy-1,1-diokso-4H-1λ⁶,4-benzotiazyno-2-karbonitryl 3.31 jako brązowe ciało stałe (0.019 g, 26%). MS: 360.7 (M-1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 10.51 (s, 1H), 9.76 (s, 1H), 7.60 – 7.55 (m, 1H), 7.45 – 7.36 (m, 5H), 7.34 – 7.27 (m, 1H), 3.99 (s, 3H). i. Do r-ru 3.31 (0.018 g, 0.05 mmol) w DCE (1 ml) wkroplono 1 M r-r BBr3 w DCM (0.20 ml, 0.20 mmol). Reakcję prowadzono w RT przez 16 godz. Mieszaninę wylano na lód i ekstrahowano r-rem DCM/i-PrOH (4:1). Połączone fazy organiczne przemyto solanką i wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono metodą FCC. Uzyskano 2.174 w postaci brązowego ciała stałego (0.008 g, 46%). MS: 348.1 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.23 (s, 1H), 10.36 (s, 1H), 9.69 (s, 1H), 7.60 – 7.53 (m, 1H), 7.46 – 7.38 (m, 2H), 7.34 – 7.21 (m, 3H), 7.15 (dd, J = 6.7, 2.6 Hz, 1H). 3-(benzylamino)-5-hydroksy-1,1-diokso-4H-1λ⁶,4-benzotiazyno-2-karbonitryl (2.175) Związek otrzymano jak 2.174. Produkt 2.175, uzyskano w postaci beżowego ciała stałego (0.005 g, 28%). MS: 328.2 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.08 (s, 1H), 10.03 (s, 1H), 8.18 (s, 1H), 7.42 – 7.36 (m, 4H), 7.35 – 7.27 (m, 1H), 7.21 – 7.11 (m, 2H), 7.10 – 7.01 (m, 1H), 4.64 (d, J = 5.6 Hz, 2H). HRMS (M+1): obliczono dla C16H14N3O3S: 328.075, znaleziono: 328.0746. 4-hydroksy-3-[(1H-pirazol-5-ylo)amino]-1λ⁶,2-benzotiazolo-1,1-dion (2.176) a. Do r-ru 1,1-ditlenku 4-fluorobenzo[d]izotiazolo-3(2H)-onu (0.600 g, 2.49 mmol) w MeOH (12 ml) dodano 5.4 M r-r NaOMe w MeOH (1.657 ml, 8.95 mmol). Mieszaninę ogrzewano w reaktorze mikrofalowym, w 150 °C, przez 22 min. Mieszaninę zakwaszono 1 M r-rem HCl. Wszystkie lotne substancje usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozcieńczono 1 M r-rem HCl i ekstrahowano EtOAc. Połączone fazy organiczne przemyto solanką i wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskano 2.190 jako brązowe ciało stałe (0.603 g, 95%)[162]. MS: 212.1 (M-1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 7.93 (dd, J = 8.4, 7.7 Hz, 1H), 7.61 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.54 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 3.96 (s, 3H). b. Zgodnie z procedurą C uzyskano 3-chloro-4-metoksy-1λ⁶,2-benzotiazolo-1,1-dion 2.191 w postaci brązowego ciała stałego (0.528 g, 93%). 1H NMR (300 MHz, Chloroform-d) δ 7.83 – 7.76 (m, 1H), 7.51 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.29 (s, 1H), 4.07 (s, 3H). c. Mieszaninę 2.191 (0.158 g, 0.68 mmol), 3-aminopirazolu (0.170 g, 2.05 mmol) i dioksanu (4 ml) ogrzewano w 80 °C przez 4 godz. Reakcję zakończono przez dodanie wody i EtOAc. Powstały osad odsączono, przemyto wodą, Et2O i pentanem. Po wysuszeniu uzyskano 4-metoksy-3-[(1H-pirazol-5-ylo)amino]-1λ⁶,2-benzotiazolo-1,1-dion 3.32 jako beżowe ciało stałe (0.086 g, 45%). MS: 279.6 (M+1). d. Mieszaninę 3.32 (0.060 g, 0.22 mmol), 1 M r-ru BBr3 w DCM (1.08 ml, 1.08 mmol) i DCE (2 ml) ogrzewano w 70 °C przez 20 godz. Reakcję zakończono przez wylanie na lód. Powstały osad odsączono, przemyto wodą, DCM, Et2O i wysuszono. Produkt oczyszczono metodą RP-HPLC. Otrzymano 2.176 w postaci białego ciała stałego (0.014 g, 25%). MS: 265.6 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12.85 (s, 1H), 12.70 (s, 1H), 9.80 (s, 1H), 7.85 – 7.78 (m, 1H), 7.74 – 7.64 (m, 1H), 7.46 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 7.26 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 6.69 (d, J = 2.0 Hz, 1H). HRMS (M+1): obliczono dla C10H9N4O3S: 265.039, znaleziono: 265.0385. 4-hydroksy-3-[(3-fenylo-1H-pirazol-5-ylo)amino]-1λ⁶,2-benzotiazolo-1,1-dion (2.177) Związek otrzymano jak 2.176. Uzyskano 2.177 jako brązowe ciało stałe (0.015 g, 45%). MS: 341.2 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.20 (s, 1H), 11.10 (s, 1H), 7.79 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 7.57 – 7.28 (m, 4H), 7.17 – 6.88 (m, 3H). 3-{[(2-chlorofenylo)metylo]amino}-4-hydroksy-1λ⁶,2-benzotiazolo-1,1-dion (2.178) Związek otrzymano jak 2.176. Uzyskano 2.178 jako białe ciało stałe (0.004 g, 4%). MS: 323.1 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.12 (s, 1H), 7.77 (dd, J = 8.3, 7.5 Hz, 1H), 7.67 (s, 1H), 7.57 – 7.53 (m, 2H), 7.52 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 7.44 – 7.37 (m, 3H), 5.55 (s, 2H). 3-{[2-(2-chlorofenylo)etylo]amino}-4-hydroksy-1λ⁶,2-benzotiazolo-1,1-dion (2.179) Związek otrzymano jak 2.176. Uzyskano 2.179 jako białe ciało stałe (0.047 g, 54%). MS: 337.1 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.04 (s, 1H), 8.28 (s, 1H), 7.64 – 7.58 (m, 1H), 7.45 (dd, J = 7.4, 1.8 Hz, 1H), 7.39 (dd, J = 7.3, 2.0 Hz, 1H), 7.36 – 7.24 (m, 3H), 7.15 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 3.78 – 3.70 (m, 2H), 3.11 (t, J = 7.2 Hz, 2H). 3.5 Resynteza związków z HTS N-(2-okso-2,3-dihydro-1H-1,3-benzodiazol-5-ylo)-1H-1,3-benzodiazolo-5-karboksyamid (2.192) Zgodnie z procedurą I uzyskano 2.192 jako białe ciało stałe (0.096 g, 49%). MS: 293.9 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12.72 (s, 1H), 10.55 (dd, J = 26.3, 1.9 Hz, 2H), 10.09 (s, 1H), 8.25 (d, J = 67.9 Hz, 2H), 7.96 – 7.43 (m, 3H), 7.30 (dd, J = 8.4, 2.0 Hz, 1H), 6.88 (d, J = 8.4 Hz, 1H). N-[2-(dimetyloamino)-2-(furan-2-ylo)etylo]-2-(1H-imidazol-2-ylo)benzamid (2.193) Zgodnie z procedurą I uzyskano mrówczan 2.193 jako żółte ciało stałe (0.019 g, 12%). MS: 325.1 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.63 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 8.17 (s, 1H), 7.94 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.68 – 7.62 (m, 1H), 7.56 – 7.44 (m, 1H), 7.46 – 7.29 (m, 2H), 7.15 (s, 2H), 6.48 – 6.41 (m, 1H), 6.39 – 6.32 (m, 1H), 3.99 – 3.89 (m, 1H), 3.86 – 3.71 (m, 1H), 3.50 – 3.37 (m, 1H), 2.16 (s, 6H). kwas 2-metylo-5-[1-(pirazyno-2-karbonylo)piperydyn-4-ylo]-oktahydropirolo[3,4-c]pirolo-3a-karboksylowy (2.194) a. Do r-ru propiolanu etylu (0.300 g, 3.06 mmol) i N-metoksymetylo-N-(trimetylosililometylo)benzylaminy (2.394 g, 9.17 mmol) w DCM (15 ml), dodano TFA (0.047 ml, 0.61 mmol) i mieszano w RT przez 64 godz. Reakcję zakończono przez dodanie r-ru NaHCO3. Fazę wodną oddzielono i ekstrahowano DCM. Połączone fazy organiczne przemyto solanką i wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono metodą FCC. Uzyskano 2,5-dibenzylo-oktahydropirolo[3,4-c]pirolo-3a-karboksylan etylu 2.198 jako żółty olej (1.000 g, 90%). MS: 365.3 (M+1). 1H NMR (300 MHz, Chloroform-d) δ 7.39 – 7.17 (m, 11H), 4.15 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 3.69 – 3.53 (m, 4H), 3.11 – 3.01 (m, 1H), 2.91 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 8.1 Hz, 2H), 2.55 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 2.44 (dd, J = 8.8, 4.6 Hz, 2H), 1.24 (t, J = 7.1 Hz, 3H). b. W aparacie Parra (4 bar) uwodorniono mieszaninę 2.198 (0.630 g, 1.73 mmol), 1,1,2-tichloroetanu (0.353 ml, 3.80 mmol), 10% Pd/C (0.080 g) i EtOH (40 ml). Reakcję prowadzono w RT przez 18 godz. Mieszaninę przesączono przez lejek ze spiekiem. Osad zebrano, zawieszono w wodzie i sonikowano. Zawiesinę przesączono przez filtr strzykawkowy, a przesącz zliofilizowano. Uzyskano dichlorowodorek oktahydropirolo[3,4-c]pirolo-3a-karboksylanu etylu 2.199 jako żółte ciało stałe (0.376 g, 85%). MS: 185.2 (M+1). 1H NMR (300 MHz, D2O) δ 4.32 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 4.14 (d, J = 13.1 Hz, 2H), 3.81 (dd, J = 12.3, 8.1 Hz, 2H), 3.66 – 3.55 (m, 3H), 3.45 (dd, J = 12.4, 6.1 Hz, 2H), 1.32 (t, J = 7.2 Hz, 3H). c. Do r-ru 1-Boc-piperydonu (0.100 g, 0.50 mmol), 2.199 (0.368 g, 1.43 mmol) i AcOH (0.057 ml, 1.00 mmol) w DCM (15 ml), dodano MgSO4. Prowadzono reakcję w RT przez 1 godz. Następnie dodano NaBH(OAc)3 (0.053 g, 29%) i mieszano przez 16 godz. Mieszaninę rozcieńczono DCM i r-rem NaHCO3. Fazę wodną oddzielono i ekstrahowano DCM. Połączone fazy organiczne przemyto solanką i wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono metodą FCC. Uzyskano 4-[3a-(etoksykarbonylo)-oktahydropirolo[3,4-c]pirol-2-ylo]piperydyno-1-karboksylan tert-butylu 2.201 jako bezbarwny olej (0.053 g, 29%). MS: 368.3 (M+1). 1H NMR (300 MHz, Chloroform-d) δ 4.16 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 3.89 (s, 2H), 3.31 – 3.15 (m, 2H), 2.96 – 2.81 (m, 4H), 2.79 (s, 2H), 2.76 – 2.68 (m, 2H), 2.67 – 2.57 (m, 1H), 2.57 – 2.47 (m, 1H), 2.20 – 2.08 (m, 1H), 1.80 – 1.76 (m, 2H), 1.51 – 1.34 (m, 10H), 1.32 – 1.20 (m, 4H). d. Do r-ru 2.201 (0.049 g, 0.13 mmol) i 35% wodnego r-ru formaldehydu (0.037 ml, 0.47 mmol) w DCM (4 ml), dodano MgSO4. Prowadzono reakcję w RT przez 18 godz. Następnie dodano NaBH(OAc)3 (0.155 g, 0.73 mmol) i mieszano w RT przez 48 godz. Reakcję zakończono przez dodanie r-ru NaHCO3. Fazę wodną oddzielono i ekstrahowano DCM. Połączone fazy organiczne przemyto solanką i wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskano 4-[3a-(etoksykarbonylo)-5-metylo-oktahydropirolo[3,4-c]pirol-2-yl]opiperydyno-1-karboksylan tert-butylu 2.202 jako żółty olej (0.046 g, 90%). MS: 382.5 (M+1). 1H NMR (300 MHz, Chloroform-d) δ 4.16 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 4.01 – 3.85 (m, 2H), 3.11 – 2.71 (m, 7H), 2.69 – 2.63 (m, 1H), 2.58 – 2.47 (m, 2H), 2.42 – 2.36 (m, 1H), 2.34 (s, 3H), 2.28 – 2.17 (m, 1H), 1.88 – 1.79 (m, 2H), 1.44 (s, 10H), 1.26 (t, J = 7.1 Hz, 4H). e. Mieszaninę 2.202 (0.044 g, 0.11 mmol), 4 M r-ru HCl w dioksanie (0.428 ml, 1.71 mmol), wody (0.5 ml) i dioksanu (1.0 ml) ogrzewano w 65 °C przez 17 godz. Wszystkie lotne substancje usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszczono w wodzie i zliofilizowano. Uzyskano trichlorowodorek kwasu 2-metylo-5-(piperydyn-4-ylo)-oktahydropirolo[3,4-c]pirolo-3a-karboksylowego 2.203 jako żółte ciało stałe. MS: 254.1 (M-1). 1H NMR (300 MHz, D2O) δ 4.40 – 4.26 (m, 1H), 4.19 – 3.98 (m, 2H), 3.94 – 3.52 (m, 8H), 3.46 – 3.19 (m, 2H), 3.19 – 2.95 (m, 5H), 2.54 – 2.36 (m, 2H), 2.11 – 1.90 (m, 2H). f. Zgodnie z procedurą I uzyskano 2.194 jako białe ciało stałe (0.016 g, 52%). MS:360.2 (M+1). 1H NMR (300 MHz, D2O) δ 8.81 (d, J = 1.4 Hz, 1H), 8.75 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 8.70 (dd, J = 2.6, 1.5 Hz, 1H), 4.63 – 4.47 (m, 1H), 4.03 – 3.42 (m, 3H), 3.33 – 2.46 (m, 13H), 2.22 – 2.07 (m, 1H), 2.01 – 1.86 (m, 1H), 1.65 – 1.38 (m, 2H). HRMS (M+1): obliczono dla C18H26N5O3: 360.2030, znaleziono: 360.2019. kwas 3-({4'-[1-(pirolidyn-1-yl)etyl]-[1,1'-bifenyl]-4-ylo}sulfonylo)propanowy (2.195) a. Mieszaninę 4-acetylo-4’-bromobifenylo (1.000 g, 3.63 mmol), 3-merkaptopropionianu metylu (0.443 g, 4.00 mmol), DIPEA (1.899 ml, 10.90 mmol), Pd2(dba)3 (0.333 g, 0.36 g), XantPhos (0.421 g, 0.73 mmol) i toluenu (15 ml), w atm. gazu obojętnego, ogrzewano w 80 °C przez 18 godz. Mieszaninę zakwaszono AcOH, rozcieńczono wodą oraz EtOAc i przesączono przez lejek Buchnera. Fazę organiczną oddzielono, przemyto solanką i wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono metodą FCC. Uzyskano 3-({4'-acetyl-[1,1'-bifeny]-4-ylo}sulfanylo)propionian etylu 2.206 jako żółte ciało stałe (0.470 g, 41%). MS: 315.3 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.03 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.83 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.73 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.45 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 3.61 (s, 3H), 3.24 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.67 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.61 (s, 3H). b. Do schłodzonego w łaźni lodowej r-ru 2.206 (0.401 g, 1.28 mmol) w DCM (6 ml), dodano r-r m-CPBA (0.880 g, 3.93 mmol) w DCM (5 ml). Reakcję prowadzono w 0 °C przez 2 godz. Następnie dodano r-r Na2S2O3 i r-r NaHCO3. Fazę wodną oddzielono i ekstrahowano DCM. Połączone fazy organiczne przemyto solanką i wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskano 3-({4'-acetyl-[1,1'-bifenyl]-4-ylo}sulfonylo)propanian metylu 3.33 jako białe ciało stałe (0.401 g, 91%). MS: 347.1 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.12 – 7.97 (m, 6H), 7.93 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 3.63 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.53 (s, 3H), 2.68 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.64 (s, 3H). c. Aminowanie redukcyjne wykonano jak w etapie (c) syntezy 2.194, stosując pirolidynę i 3.33 (0.150 g, 0.43 mmol). Otrzymano 3-({4'-[1-(pirolidyn-1-yl)etyl]-[1,1'-bifenyl]-4-ylo}sulfonylo)propanian metylu 2.207 jako białe ciało stałe (0.160 g, 69%). MS: 402.5 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 7.94 (s, 4H), 7.71 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.45 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 3.61 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.53 (s, 3H), 3.29 – 3.20 (m, 1H), 2.66 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.36 – 2.25 (m, 2H), 1.73 – 1.60 (m, 4H), 1.32 (d, J = 6.6 Hz, 3H). d. Hydrolizę wykonano jak w etapie (e) syntezy 2.194, stosując 2.207 (0.020 g, 0.05 mmol). Uzyskano chlorowodorek 2.195 jako żółte ciało stałe (0.016 g, 76%). MS: 388.1 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12.56 (br s, 1H), 11.21 (br s, 1H), 7.99 (s, 4H), 7.87 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.79 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 4.53 – 4.38 (m, 1H), 3.70 (br s, 1H), 3.58 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 3.20 – 3.05 (m, 1H), 3.06 – 2.81 (m, 2H), 2.56 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.07 – 1.78 (m, 4H), 1.66 (d, J = 6.7 Hz, 3H). 3.6 Synteza antagonistów A2AR Część ligandów przekształcano w chlorowodorki. W tym celu do r-ru czystego związku w niewielkiej objętości MeOH, dodawano 2 M r-r HCl (10.0 eq.) w eterze lub 3 M r-r HCl w MeOH (10.0 eq.) i mieszano przez 1 godz w RT. Wszystkie lotne substancje usuwano pod zmniejszonym ciśnieniem. Sól rozpuszczano w wodzie i liofilizowano. Procedura N – przygotowanie estrów/kwasów boronowych Mieszaninę halogenku arylowego (1.0 eq.), B2(pin)2 (1.5 eq.), KOAc (3.0 eq.) i dioksanu lub DMF (0.2 M) przedmuchano argonem przez 5-10 min. Następnie dodano Pd(dppf)Cl2·DCM (0.1 eq.) i ogrzewano w 100 °C przez 2 godz. Po ochłodzeniu, mieszaninę przesączono przez celit, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono metodą FCC lub wykorzystywano bez oczyszczania. Procedura O – sprzęganie Suzukiego Mieszaninę halogenku arylowego (1.0 eq.), estru lub kwasu boronowego (1.2 eq.), Na2CO3 (2.0 eq.), r-ru (4:1) dioksanu i wody (0.2 M) przedmuchano argonem przez 5-10 min. Następnie zastosowano jeden z poniższych wariantów (A-C). Po ochłodzeniu, mieszaninę przesączono przez celit, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono metodą FCC lub RP-HPLC. A. Dodano Pd(PPh3)4 (0.08 eq.) i ogrzewano w 100 °C przez 16-24 godz. B. Dodano Pd(dppf)Cl2·DCM (0.1 eq.) i ogrzewano w 150 °C przez 2 godz. C. Użyto K2CO3 (2.0 eq.) zamiast Na2CO3. Dodano Pd(amphos)Cl2 (0.05 eq.) i ogrzewano w 100-140 °C przez 16-24 godz. D. Dodano SPhos Pd G3 (0.05 eq.) i ogrzewano w 130 °C przez 16-24 godz. 5-(1H-indazol-5-ylo)-6-fenyloimidazo[1,2-a]pirazyno-8-amina (2.210) a. Do r-ru 2-amino-6-chloropirazyny (5.000 g, 38.60 mmol) w mieszaninie bezw. CHCl3 (120 ml), ACN (12 ml) i MeOH (12 ml), w 0 °C, dodano porcjami NBS (7.560 g, 42.45 mmol). Reakcję doprowadzono do RT i mieszano przez 1 godz. Wszystkie lotne substancje usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono metodą FCC, uzyskując 5-bromo-6-chloropirazyno-2-aminę 2.216 jako jasnobrązowe ciało stałe (6.340 g, 79%). MS: 209.9 (M+1). 1H NMR (300 MHz, Chloroform-d) δ 7.69 (s, 1H), 4.78 (br s, 2H). b. Zgodnie z procedurą OA otrzymano 6-chloro-5-fenylopirazyno-2-aminę 2.217 (2.11 g, 50%) jako białe ciało stałe. MS:206.1 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 7.93 (s, 1H), 7.66 - 7.59 (m, 2H), 7.47 - 7.32 (m, 3H), 7.00 (br s, 2H). c. Do r-ru 2.217 (0.670 g, 3.26 mmol) w mieszaninie ACN (10 ml) i DMF (3 ml), w -10 °C, dodano NCS (0.457 g, 3.42 mmol). Reakcję doprowadzono do RT, a następnie ogrzewano w 70 °C przez 1 godz. Wszystkie lotne substancje usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszczono w EtOAc i wodzie. Fazę wodną oddzielono i ekstrahowano EtOAc. Połączone fazy organiczne przemyto solanką i wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono metodą FCC. Otrzymano 3,6-dichloro-5-fenylopirazyno-2-aminę 2.218 jako jasnożółte ciało stałe (0.579 g, 82%). MS: 239.9 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 7.66 - 7.59 (m, 2H), 7.50 - 7.39 (m, 3H), 7.37 (br s, 2H). d. Mieszaninę 2.218 (0.500 g, 2.08 mmol), ACN (6 ml), dioksanu (6 ml) i 50% wodnego r-ru chloroacetaldehydu (2.64 ml, 2-.83 mmol) ogrzewano w 110 °C przez 1 godz. Wszystkie lotne substancje usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono metodą FCC. Uzyskano 5,8-dichloro-6-fenyloimidazo[1,2-a]pirazynę 2.220 jako gęsty brązowy olej (0.411 g, 75%). MS: 264.1 (M+1). e. Mieszaninę 2.220 (1.400 g, 5.30 mmol), ACN (9 ml) i wodnego r-ru amoniaku (30 ml) ogrzewano w 100 °C przez 24 godz. Wszystkie lotne substancje usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono metodą FCC. Otrzymano 5-chloro-6-fenyloimidazo[1,2-a]pirazyno-8-aminę 2.221 jako brązowe ciało stałe (0.756 g, 58%). MS: 245.0 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.04 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 7.70 - 7.65 (m, 3H), 7.50 - 7.40 (m, 3H), 7.23 (s, 2H). f. Zgodnie z procedurą N otrzymano 5-(4,4,5,5-tetrametylo-1,3,2-dioksaborolan-2-ylo)-1H-indazol 2.223 jako białe ciało stałe. MS: 245.1 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.15 (s, 1H), 8.20 – 8.09 (m, 2H), 7.95 (d, J = 6.2 Hz, 1H), 7.61 (dd, J = 8.4, 1.1 Hz, 1H), 7.52 (dt, J = 8.4, 1.0 Hz, 1H), 1.31 (s, 12H). g. Zgodnie z procedurą OB uzyskano chlorowodorek 2.210 jako żółte ciało stałe (0.018 mg, 20%). MS: 327.1 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.35 - 8.6 (br s, 1H), 8.20 (s, 1H), 7.89 - 7.82 (m, 2H), 7.65 - 7.55 (m, 2H), 7.38 - 7.33 (m, 3H), 7.32 - 7.26 (m, 3H), 5.05 - 4.15 (br s, 2H). HRMS (M+1): obliczono dla C19H15N6: 327.1353, znaleziono: 327.1348. 5-(3-fluoro-1H-indazol-5-ylo)-6-fenyloimidazo[1,2-a]pirazyno-8-amina (2.211) a. Do r-ru 5-bromo-1H-indazolu (0.500 g, 2.54 mmol) w DMA (5 ml), w atm. gazu obojętnego, dodano SelectfIuor (1.8 g, 5.8 mmol). Mieszaninę ogrzewano w 70 °C przez 38 godz. Reakcję zakończono przez dodanie wody. Fazę wodną ekstrahowano EtOAc. Połączone fazy organiczne przemyto solanką i wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono metodą FCC. Uzyskano 5-bromo-3-fluoro-1H-indazol 3.35 jako białe ciało stałe (0.425 g, 79%)[171]. b. Zgodnie z procedurą N otrzymano 3-fluoro-5-(4,4,5,5-tetrametylo-1,3,2-dioksaborolan-2-ylo)-1H-indazol 3.35 jako białe ciało stałe (0.196 g, 80%). MS: 263.1 (M+1). c. Związek przygotowano jak 2.210. Uzyskano 2.211 jako białe ciało stałe (0.013 g, 12%). MS: 345.2 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.72 (s, 1H), 7.74 (s, 1H), 7.55 - 7.49 (m, 2H), 7.40 - 7.34 (m, 2H), 7.31 - 7.26 (m, 2H), 7.19 - 7.12 (m, 3H), 7.07 (s, 2H). 5-(3-chloro-1H-indazol-5-ylo)-6-fenyloimidazo[1,2-a]pirazyno-8-amina (2.212) a. Zgodnie z procedurą N otrzymano 3-chloro-5-(4,4,5,5-tetrametylo-1,3,2-dioksaborolan-2-ylo)-1H-indazol 3.36 jako białe ciało stałe (0.350 g, 97%). MS: 279.0 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.41 (s, 1H), 7.99 (d, J = 1.0 Hz, 1H), 7.70 (dd, J = 8.5, 1.0 Hz, 1H), 7.56 (dd, J = 8.5, 0.9 Hz, 1H), 1.32 (s, 12H). b. Związek przygotowano jak 2.210. Uzyskano 2.212 jako żółte ciało stałe (0.012 g, 9%). MS: .361.3 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.46 (s, 1H), 7.66 (d, J = 1.4 Hz, 1H), 7.62 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.51 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 7.41 (dd, J = 8.7, 1.6 Hz, 1H), 7.33 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 7.30 – 7.26 (m, 2H), 7.18 – 7.12 (m, 3H), 7.07 (s, 2H). 5-(1H-indol-5-ylo)-6-fenyloimidazo[1,2-a]pirazyno-8-amina (2.213) a. Do r-ru 2-amino-6-chloropirazyny (25.000 g, 192.98 mmol) w bezw. ACN (100 ml), w 0 °C, dodano porcjami NBS (103.037 g, 578.93 mmol). Reakcję doprowadzono do RT i mieszano przez 16 godz. Powstały osad odsączono i przemyto niewielką objętością zimnego ACN. Produkt oczyszczono przez krystalizację z ACN. Uzyskano 3,5-dibromo-6-chloropirazyno-2-aminę 2.224 jako jasnobrązowe ciało stałe (38.000 g, 69%). MS: 285.8 (M+1). b. Mieszaninę 2.224 (38.000 g, 132.25 mmol), 2-bromo-1,1-dimetoksyetanu (23.447 ml, 198.37 mmol) i r-ru (4:1) wody i dioksanu (315 ml) ogrzewano w 100 °C przez 28 godz. Wszystkie lotne substancje usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Następnie do pozostałości dodano DCM i r-r NaHCO3, i mieszano przez 15 min. Powstały osad odsączono, a przesącz ekstrahowano DCM. Połączone fazy organiczne przemyto solanką i wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono metodą FCC. Uzyskano 6,8-dibromo-5-chloroimidazo[1,2-a]pirazynę 2.226 jako żółte ciało stałe (18.500 g, 45%). MS: 311.8 (M+1). c. Ustawiono równolegle 6 reakcji, które połączono na etapie sączenia. Mieszaninę 2.226 (3.000 g, 9.64 mmol) i wodnego r-ru amoniaku (75 ml) ogrzewano w 100 °C przez 2 godz. Po ochłodzeniu do RT, osad odsączono, przemyto wodą oraz MeOH i wysuszono. Uzyskano 6-bromo-5-chloroimidazo[1,2-a]pirazyno-8-aminę 2.227 jako beżowe ciało stałe (13.400 g, 92%). MS: 248.9 (M+1). d. Zgodnie z procedurą OA otrzymano 2.221 jako żółte ciało stałe (0.803 g, 58%). MS: 245.1 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.04 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 7.70 - 7.65 (m, 3H), 7.50 - 7.40 (m, 3H), 7.23 (s, 2H). e. Zgodnie z procedurą OB uzyskano 2.213 jako białe ciało stałe (0.040 g, 38%). MS: 326.2 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.27 (s, 1H), 7.53 - 7.51 (m, 1H), 7.48 (d, J = 1. 1 Hz, 1H), 7.46 (dt, J = 8.3, 0.9 Hz, 1H), 7.39 (t, J = 2.8 Hz, 1H), 7.34 - 7.28 (m, 2H), 7.25 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 7.15 - 7.08 (m, 3H), 7.05 (dd, J = 8.3, 1.7 Hz, 1H), 6.95 (s, 2H), 6.44 - 6.39 (m, 1H). HRMS (M+1): obliczono dla C20H16N5: 326.1400, znaleziono: 326.1395. 5-(3-metylo-1H-indazol-5-ylo)-6-fenyloimidazo[1,2-a]pirazyno-8-amina (2.214) Związek uzyskano jak 2.213. Uzyskano 2.214 w postaci białego ciała stałego (0.030 g, 27%). MS: 341.3 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.79 (s, 1H), 7.82 - 7.72 (m, 1H), 7.52 - 7.46 (m, 2H), 7.33 - 7.28 (m, 3H), 7.24 (dd, J = 8.5, 1.6 Hz, 1H), 7.18 - 7.1 1 (m, 3H), 7.02 (s, 2H), 2.42 (s, 3H). HRMS (M+1): obliczono dla C20H17N6: 341.1509, znaleziono: 341.1504. 4-{8-amino-2,6-difenyloimidazo[1,2-a]pirazyn-5-ylo}-2-chlorofenol (2.229) a. Zgodnie z procedurą OB otrzymano 4-(6-amino-3-fenylopirazyn-2-ylo)-2-chlorofenol 3.37 jako jasnożółte ciało stałe (1.290 g, 74%). Zastosowanie procedury OA doprowadziło do produktu 3.37 z wydajnością 40%. MS: 298.2 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.35 (s, 1H), 7.89 (s, 1H), 7.33 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 7.30 – 7.20 (m, 5H), 6.98 (dd, J = 8.4, 2.2 Hz, 1H), 6.79 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.59 (s, 2H). b. Do r-ru 3.37 (0.408 g, 1.37 mmol) w THF (10 ml), w 0 °C, dodano porcjami NBS (0.251 g, 1.37 mmol). Reakcję prowadzono w 0 °C przez 2 godz. Wszystkie lotne substancje usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszczono w wodzie i EtOAc. Fazę wodną oddzielono i ekstrahowano EtOAc. Połączone fazy organiczne przemyto solanką i wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono metodą FCC. Uzyskano 4-(6-amino-5-bromo-3-fenylopirazyn-2-ylo)-2-chlorofenol 2.234 jako brązowe ciało stałe (0.205 g, 44%). MS: 377.8 (M+1). ). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 10.43 (s, 1H), 7.36 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 7.31 – 7.24 (m, 5H), 6.99 (dd, J = 8.4, 2.2 Hz, 1H), 6.87 (s, 2H), 6.81 (d, J = 8.4 Hz, 1H). c. Mieszaninę 2.234 (0.100 g, 0.61 mmol), 2-bromoacetofenonu (0.219 g, 1.1 mmol) i ACN (4 ml) ogrzewano w 125 °C przez 72 godz. Po ochłodzeniu mieszaninę rozcieńczono EtOAc i sonikowano w RT przez 1 godz. Osad odsączono, przemyto heksanem i wysuszono. Uzyskano 4-{8-bromo-2,6-difenyloimidazo[1,2-a]pirazyn-5-ylo}-2-chlorofenol 3.38 jako brązowe ciało stałe (0.112 g, 38%). MS: 476.2 (M+1). d. Mieszaninę 3.38 (0.112 g, 0.23 mmol), ACN (2 ml) i wodnego r-ru amoniaku (12 ml) ogrzewano w 110 °C przez 2 tygodnie. Wszystkie lotne substancje usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszczono w wodzie i EtOAc. Fazę wodną oddzielono i ekstrahowano EtOAc. Połączone fazy organiczne przemyto solanką i wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono metodą FCC i RP-HPLC. Uzyskano mrówczan 2.229 jako białe ciało stałe (0.012 g, 11%). MS: 413.6 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.62 (s, 1H), 8.48 (s, 1H), 8.04 – 7.97 (m, 2H), 7.85 (s, 1H), 7.44 – 7.37 (m, 2H), 7.35 – 7.29 (m, 4H), 7.27 – 7.12 (m, 4H), 7.04 (d, J = 8.2 Hz, 3H). 4-[8-amino-5-(3-chloro-4-hydroksyfenylo)-6-fenyloimidazo[1,2-a]pirazyn-2-ylo]benzonitryl (2.230) Związek otrzymano jak 2.229. Uzyskano mrówczan 2.230 jako żółte ciało stałe (0.005 g, 23%). MS: 438.0 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.25 – 8.21 (m, 2H), 8.10 (s, 1H), 7.88 – 7.84 (m, 2H), 7.33 – 7.29 (m, 4H), 7.26 – 7.18 (m, 3H), 7.17 – 7.11 (m, 3H), 7.04 (d, J = 8.4 Hz, 1H). 4-[8-amino-2-(3-nitrofenylo)-6-fenyloimidazo[1,2-a]pirazyn-5-ylo]-2-chlorofenol (2.231) Związek otrzymano jak 2.229. Uzyskano chlorowodorek 2.231 jako żółte ciało stałe (0.007 g, 11%). MS: 458.6 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.68 (s, 1H), 8.93 (t, J = 2.0 Hz, 1H), 8.55 – 8.48 (m, 1H), 8.34 (s, 1H), 8.19 (dd, J = 8.3, 2.3 Hz, 1H), 7.72 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.39 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 7.37 – 7.27 (m, 5H), 7.20 (dd, J = 8.3, 2.1 Hz, 1H), 7.05 (d, J = 8.4 Hz, 1H). 3-[8-amino-5-(3-chloro-4-hydroksyfenylo)-6-fenyloimidazo[1,2-a]pirazyn-2-ylo]benzonitryl (2.232) Związek otrzymano jak 2.229. Uzyskano chlorowodorek 2.232 w postaci żółtego ciała stałego (0.008 g, 5%). MS: 438.7 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.92 (s, 1H), 8.51 (t, J = 1.7 Hz, 1H), 8.38 (dt, J = 7.9, 1.5 Hz, 1H), 8.12 (s, 1H), 7.75 (dt, J = 7.7, 1.4 Hz, 1H), 7.62 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.37 – 7.28 (m, 3H), 7.27 – 7.13 (m, 4H), 7.11 (s, 2H), 7.03 (d, J = 8.3 Hz, 1H). 6-(3-fluorofenylo)-5-fenyloimidazo[1,2-a]pirazyno-8-amina (2.236) Związek otrzymano jak 2.210. Uzyskano 2.236 w postaci białego ciała stałego (0.040 g, 53%). MS: 305.2 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.53 (d, J = 1.1 Hz, 1H), 7.48 – 7.43 (m, 3H), 7.41 – 7.36 (m, 2H), 7.32 – 7.30 (m, 1H), 7.23 – 7.16 (m, 1H), 7.13 (s, 2H), 7.09 – 7.04 (m, 2H), 7.04 – 6.97 (m, 1H). HRMS (M+1): obliczono dla C18H14FN4: 305.1197, znaleziono: 305.1193. 4-[8-amino-6-(3-fluorofenylo)imidazo[1,2-a]pirazyn-5-ylo]fenol (2.237) Związek otrzymano jak 2.210. Uzyskano 2.237 jako białe ciało stałe (0.037 g, 47%). MS: 321.1 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.79 (s, 1H), 7.51 (d, J = 1.1 Hz, 1H), 7.33 (d, J = 1.1 Hz, 1H), 7.26 – 7.14 (m, 3H), 7.12 – 6.96 (m, 5H), 6.86 – 6.79 (m, 2H). HRMS (M+1): obliczono dla C18H14FN4O: 321.1146, znaleziono: 321.1142. 6-(3-fluorofenylo)-5-(pirydyn-4-ylo)imidazo[1,2-a]pirazyno-8-amina (2.238) Związek otrzymano jak 2.210. Uzyskano mrówczan 2.238 jako jasnożółte ciało stałe (0.039 g, 45%). MS: 306.2 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.67 – 8.60 (m, 2H), 8.46 (s, 1H), 7.56 (d, J = 1.1 Hz, 1H), 7.49 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 7.45 – 7.38 (m, 2H), 7.35 – 7.17 (m, 3H), 7.15 – 6.97 (m, 3H). HRMS (M+1): obliczono dla C17H13FN5: 306.1150, znaleziono: 306.1145. 4-[8-amino-6-(3-fluorofenylo)imidazo[1,2-a]pirazyn-5-ylo]-2-chlorofenol (2.239) Związek otrzymano jak 2.229, w etapie (c) stosując 50% wodny r-r chloroacetaldehydu i ogrzewając mieszaninę w reaktorze mikrofalowym, w 110 °C przez 1 godz. Uzyskano chlorowodorek 2.239 jako białe ciało stałe (0.030 g, 18%). MS: 355.5 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.79 (s, 1H), 8.75 (br s, 2H), 7.86 (d, J = 1.3 Hz, 1H), 7.66 (d, J = 1.3 Hz, 1H), 7.44 - 7.34 (m, 1H), 7.41 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 7.24 - 7.1 1 (m, 4H), 7.05 (d, J = 8.4 Hz, 1H). 6-(3-fluorofenylo)-5-[2-metylo-6-(trifluorometylo)pirydyn-4-ylo]imidazo[1,2-a]pirazyno-8-amina (2.240) a. Do mieszaniny dimeru (1,5-cyklooktadien)(metoksy)irydu(I) (0,031 g, 0,05 mmol), 4,4'-di-tert-butylo-2,2'-bipirydyny (0,025 g, 0,09 mmol) i B2(pin)2 (3,073 g, 12,10 mmol), w atm. gazu obojętnego, dodano heksan (22 ml). Mieszaninę ogrzewano w 50 °C przez 10 min, do zmiany koloru na ciemnoczerwoną. Następnie dodano 2-trifluorometylo-6-metylopirydynę (2,47 ml, 18,62 mmol) i kontynuowano reakcję w 50 °C przez 6 godz. Wszystkie lotne substancje usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono metodą FCC. Otrzymano 2-metylo-4-(4,4,5,5-tetrametylo-1,3,2-dioksaborolan-2-ylo)-6-(trifluorometylo)pirydynę 3.39 w postaci białego ciała stałego (4.700 g, 88%)[51]. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 7.76 (s, 1H), 7.70 (s, 1H), 2.58 (s, 3H), 1.32 (s, 12H). b. Związek otrzymano jak 2.210. Uzyskano chlorowodorek 2.240 jako jasnożółte ciało stałe (4.115 g, 46%). MS: 388.1 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.13 (bs, 2H), 8.03 (d, J = 1.1 Hz, 1H), 7.97 (d, J = 1.4 Hz, 1H), 7.72 (s, 1H), 7.64 (s, 1H), 7.43 – 7.34 (m, 1H), 7.29 – 7.19 (m, 2H), 7.14 – 7.09 (m, 1H), 2.58 (s, 3H). 6-(3-fluorofenylo)-5-[2-metylo-6-(trifluorometylo)piperydyn-4-ylo]imidazo[1,2-a]pirazyno-8-amina (2.242) W aparacie Parra (4 bar) uwodorniono mieszaninę 2.240 (0.250 g, 0.59 mmol), PtO2 (0.350 g), stęż. kwasu solnego (0.049 ml) i AcOH (15 ml). Reakcję prowadzono przez 3 tygodnie. Wszystkie lotne substancje usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszczono w wodzie, zneutralizowano r-rem NaHCO3 i ekstrahowano DCM. Połączone fazy organiczne przemyto solanką i wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Surowy produkt rozpuszczono w DCM i przesączono przez żel krzemionkowy. Przesącz zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, a produkt oczyszczono metodą RP-HPLC. Uzyskano mrówczan 2.242 jako żółte ciało stałe (0.004 g, 2%). MS: 394.1 (M+1). 1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 7.94 (s, 1H), 7.65 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 7.47 – 7.37 (m, 1H), 7.19 – 7.08 (m, 3H), 5.54 (s, 2H), 3.28 – 3.12 (m, 2H), 2.79 – 2.65 (m, 1H), 1.96 – 1.77 (m, 4H), 1.18 (d, J = 6.2 Hz, 3H). 5-(2,6-dimetylopirydyn-4-ylo)-6-(3-fluorofenylo)imidazo[1,2-a]pirazyno-8-amina (2.241) a. Kwas boronowy przygotowano jak 3.39. Uzyskano kwas (2,6-dimetylopirydyn-4-ylo)boronowy 3.40 w postaci pomarańczowego oleju (0.643 g, 15%). MS: 151.7 (M+1). b. Związek otrzymano jak 2.240. Uzyskano chlorowodorek 2.241 jako jasnożółte ciało stałe (0.068 g, 35%). MS: 334.2 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.35 (s, 2H), 7.92 - 7.80 (m, 2H), 7.65 (s, 2H), 7.40 - 7.30 (m, 1H), 7.29 - 7.1 7 (m, 2H), 7.08 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 2.66 (s, 6H). 6-(3-fluorofenylo)-5-{pirazolo[1,5-a]pirymidyn-6-ylo}imidazo[1,2-a]pirazyno-8-amina (2.243) Związek otrzymano jak 2.210. Uzyskano chlorowodorek 2.243 jako jasnożółte ciało stałe (0.004 g, 6%). MS: 346.0 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.35 (dd, J = 2.1 , 1.0 Hz, 1H), 8.45 (d, J= 2.1 Hz, 1H), 8.31 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.76 (s, 1H), 7.37 - 7.24 (m, 2H), 7.21 - 7.08 (m, 2H), 6.80 (dd, J = 2.4, 0.9 Hz, 1H). 5-(1,3-benzotiazol-6-ylo)-6-(3-fluorofenylo)imidazo[1,2-a]pirazyno-8-amina (2.244) Związek otrzymano jak 2.210. Uzyskano chlorowodorek 2.244 jako białe ciało stałe (0.007 g, 11%). MS: 362.5 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.52 (s, 1H), 8.30 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 8.18 (d, J = 8.4 Hz, 1H),7.88 (d, J = 1.4 Hz, 1H), 7.67 (d, J = 1.3 Hz, 1H), 7.56 (dd, J = 8.4, 1.7 Hz, 1H), 7.37 - 7.27 (m, 1H), 7.23 (dt, J = 9.8, 2.1 Hz, 1H), 7.19 - 7.09 (m, 2H). HRMS (M+1): obliczono dla C19H13FN5S: 362.0870, znaleziono: 362.0865. 5-(1,3-benzotiazol-5-ylo)-6-(3-fluorofenylo)imidazo[1,2-a]pirazyno-8-amina (2.245) Związek otrzymano jak 2.210. Uzyskano chlorowodorek 2.245 jako białe ciało stałe (0.007 g, 9%). MS: 362.0 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.46 (s, 1H), 8.26 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.12 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 7.53 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 7.51 (dd, J = 8.3, 1.7 Hz, 1H), 7.38 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 7.20 - 7.10 (m, 4H), 7.08 - 7.03 (m, 1H), 7.02 - 6.94 (m, 1H). 6-(3-fluorofenylo)-5-(7-metylo-1H-indazol-5-ylo)imidazo[1,2-a]pirazyno-8-amina (2.246) Związek otrzymano jak 2.210, w etapie (g) stosując procedurę OC. Uzyskano 2.246 jako białe ciało stałe (0.005 g, 5%). MS: 359.1 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.34 (s, 1H), 8.06 (d, J = 1.4 Hz, 1H), 7.57 (s, 1H), 7.49 (d, J = 1.2 Hz, 1H),7.26 (d, J = 1.3 Hz, 1H), 7.19 - 7.10 (m, 3H), 7.09 - 7.03 (m, 3H), 7.00 - 6.92 (m, 1H), 2.53 (s, 3H). HRMS (M+1): obliczono dla C20H16FN6: 359.1415, znaleziono: 359.1410. 6-(3-fluorofenylo)-5-(8-fluorochinolin-6-ylo)imidazo[1,2-a]pirazyno-8-amina (2.247) Związek otrzymano jak 2.210, w etapie (g) stosując procedurę OC. Uzyskano chlorowodorek 2.247 jako żółte ciało stałe (0.070 g, 46%). MS: 374.2 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.18 (s, 2H), 9.04 (dd, J = 4.2, 1.6 Hz, 1H), 8.49 - 8.42 (m, 1H), 8.03 - 7.95 (m, 1H), 7.92 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 7.86 (d, J = 1.4 Hz, 1H), 7.75 - 7.62 (m, 2H), 7.37 - 7.21 (m, 2H), 7.21 - 7.05 (m, 2H). 6-(4-fluorofenylo)-5-(4-metylochinolin-6-ylo)imidazo[1,2-a]pirazyno-8-amina (2.248) Związek otrzymano jak 2.210, w etapie (g) stosując procedurę OC. Uzyskano chlorowodorek 2.248 jako żółte ciało stałe (0.090 g, 46%). MS: 370.2 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.05 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 8.43 (s, 1H), 8.24 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.95 - 7.71 (m, 4H), 7.42 (dd, J = 8.5, 5.4 Hz, 2H), 7.14 (t, J = 8.7 Hz, 2H), 2.73 (s, 3H). 6-(4-fluorofenylo)-5-(4-metylochinazolin-6-ylo)imidazo[1,2-a]pirazyno-8-amina (2.249) Związek otrzymano jak 2.210, w etapie (g) stosując procedurę OC. Uzyskano 2.249 jako białe ciało stałe (0.100 g, 26%). MS: 371.1 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.15 (s, 1H), 8.42 (s, 1H), 7.97 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.84 (dd, J = 8.7, 1.8 Hz, 1H), 7.60 (d, J = 1.1 Hz, 1H), 7.55 (d, J = 1.1 Hz, 1H), 7.36 – 7.28 (m, 2H), 7.22 (s, 2H), 7.04 – 6.97 (m, 2H), 2.82 (s, 3H). HRMS (M+1): obliczono dla C21H16FN6: 371.1415, znaleziono: 371.141. 6-(4-fluorofenylo)-5-{2-metyloimidazo[1,2-a]pirydyn-6-ylo}imidazo[1,2-a]pirazyno-8-amina (2.250) Związek otrzymano jak 2.210, w etapie (g) stosując procedurę OC. Uzyskano chlorowodorek 2.250 jako białe ciało stałe (0.033 g, 22%). MS: 359.2 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.06 (s, H), 8.95 (s, 1H), 8.17 (s, 1H), 7.98 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 7.95 (s, 1H), 7.93 (d, J = 1.3 Hz, 1H), 7.76 (dd, J = 9.3, 1.6 Hz, 1H), 7.49 - 7.42 ( , 2H), 7.22 - 7.15 (m, 2H), 2.52 (d, J = 1.0 Hz, 3H). 6-(4-fluorofenylo)-5-{6-metylo-1H-pirolo[2,3-b]pirydyn-4-ylo}imidazo[1,2-a]pirazyno-8-amina (2.251) Związek otrzymano jak 2.210, w etapie (g) stosując procedurę OC. Uzyskano chlorowodorek 2.251 jako żółte ciało stałe (0.010 g, 8%). MS: 359.1 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.88 (s, 1H), 9.01 (s, 1H), 7.85 (s, 1H), 7.49 (d, J = 1.4 Hz, 1H), 7.44 – 7.33 (m, 3H), 7.16 – 7.08 (m, 2H), 7.06 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 6.19 (dd, J = 3.3, 1.8 Hz, 1H), 2.53 (s, 3H). HRMS (M+1): obliczono dla C20H16FN6: 359.1415, znaleziono: 359.141. 4-(2,6-dimetylopirydyn-4-ylo)-3-(3-fluorofenylo)pirolo[1,2-a]pirazyno-1-amina (2.260) a. Zgodnie z procedurą I otrzymano 3-fluoro-N-metoksy-N-metylobenzamid 2.252 jako żółty olej (9.028 g, 69%). MS: 184.1 (M+1). 1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 7.50 – 7.45 (m, 1H), 7.42 – 7.35 (m, 2H), 7.19 – 7.13 (m, 1H), 3.56 (s, 3H), 3.36 (s, 3H). b. Do 2 M r-ru LDA w THF/heksanie (13.10 ml, 26.20 mmol), w atm. gazu obojętnego dodano bezw. THF (25 ml). Następnie r-r schłodzono do -30 °C i wkroplono r-r 2,4,6-kolidyny (2.646 g, 21.84 mmol) w bezw. THF (20 ml). Pomarańczowy r-r mieszano w przedziale temp. -30 °C do -10 °C przez 1 godz. Następnie r-r schłodzono do -50 °C i wkroplono r-r 2.252 (4.000 g, 21.84 mmol) w bezw. THF (10 ml). Reakcję doprowadzono do RT i mieszano przez 16 godz. Do mieszaniny dodano wody i ekstrahowano EtOAc. Połączone fazy organiczne przemyto solanką i wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono metodą FCC. Uzyskano 2-(2,6-dimetylopirydyn-4-ylo)-1-(3-fluorofenylo)etan-1-on 2.254 jako żółte ciało stałe (4.240 g, 80%). MS: 244.3 (M+1). 1H NMR (300 MHz, Chloroform-d) δ 7.80 – 7.73 (m, 1H), 7.71 – 7.61 (m, 1H), 7.51 – 7.42 (m, 1H), 7.33 – 7.27 (m, 1H), 6.86 (s, 2H), 4.17 (s, 2H), 2.50 (s, 6H). c. Do r-ru 2.254 (4.200 g, 17.26 mmol) w THF (25 ml) i DMF (3 ml), w -10 °C, wkroplono r-r NBS (4.200 g, 17.78 mmol) w THF (35 ml) i DMF (3 ml). Reakcję prowadzono w 0 °C przez 4 godz. Do mieszaniny dodano r-r NaHCO3 i ekstrahowano Et2O. Połączone fazy organiczne przemyto r-rem NaHCO3 oraz solanką i wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono metodą FCC. Uzyskano 2-bromo-2-(2,6-dimetylopirydyn-4-ylo)-1-(3-fluorofenylo)etan-1-on 2.255 jako żółte ciało stałe (1.643 g, 30%). MS: 322.0 (M+1). d. Do schłodzonego w łaźni lodowej r-ru pirolo-1H-karboksylanu metylu (1.001 g, 8.00 mmol) w DMF (10 ml), dodano NaH (0.320 g, 8.00 mmol) i mieszano przez 30 min. Następnie dodano r-r 2.255 (1.289 g, 4.00 mmol) w DMF (5 ml). Reakcję doprowadzono do RT i mieszano przez 3 godz. Reakcję zakończono przez wylanie na lód. Fazę wodną ekstrahowano EtOAc. Połączone fazy organiczne przemyto solanką i wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono metodą FCC. Uzyskano 1-[1-(2,6-dimetylopirydyn-4-ylo)-2-(3-fluorofenylo)-2-oksoetylo]-1H-pirolo-2-karboksylan metylu 2.257 jako żółte ciało stałe (0.260 g, 18%). MS: 367.1 (M+1). e. Mieszaninę 2.257 (0.250 g, 0.68 mmol) i NH4Cl (4.208 g, 54.59 mmol) w AcOH (8 ml) ogrzewano w 120 °C przez 16 godz. Wszystkie lotne substancje usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszczono w wodzie i DCM i zobojętniono stałym K2CO3. Fazę wodną oddzielono i ekstrahowano DCM. Połączone fazy organiczne przemyto solanką i wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono metodą FCC. Uzyskano 4-(2,6-dimetylopirydyn-4-ylo)-3-(3-fluorofenylo)-1H,2H-pirolo[1,2-a]pirazyn-1-on 2.258 jako żółte ciało stałe (0.139 g, 61%). MS: 334.4 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.02 (s, 1H), 7.33 – 7.27 (m, 1H), 7.20 – 7.11 (m, 2H), 7.09 – 7.01 (m, 4H), 6.90 – 6.86 (m, 1H), 6.57 – 6.53 (m, 1H), 2.36 (s, 6H). f. Mieszaninę 2.258 (0.120 g, 0.33 mmol) i POCl3 (1.62 ml, 17.36 mmol) ogrzewano w 80 °C przez 4 godz. Reakcję zakończono przez wylanie na lód. Mieszaninę zobojętniono stałym NaHCO3 i ekstrahowano EtOAc. Połączone fazy organiczne przemyto solanką i wysuszono nad bezw. Na2SO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono metodą FCC. Uzyskano 4-[1-chloro-3-(3-fluorofenylo)pirolo[1,2-a]pirazyn-4-ylo]-2,6-dimetylopirydynę 2.259 jako białe ciało stałe (0.093 g, 85%). MS: 352.3 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.35 – 7.33 (m, 1H), 7.33 – 7.26 (m, 1H), 7.20 (s, 2H), 7.17 – 7.07 (m, 4H), 7.03 – 6.99 (m, 1H), 2.43 (s, 6H). g. Mieszaninę 2.259 (0.070 g, 0.20 mmol), ACN (1.5 ml), dioksanu (1.5 ml) i wodnego r-ru amoniaku ( 7 ml) ogrzewano w 110 °C przez 64 godz. Powstały osad odsączono, przemyto wodą i wysuszono. Produkt przekształcono w sól HCl. Uzyskano dichlorowodorek 2.260 jako żółte ciało stałe (0.043 g, 53%). MS: 333.1 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.38 (br s, 1H), 9.81 (br s, 1H), 8.71 (br s, 1H), 7.87 – 7.81 (m, 1H), 7.61 (s, 2H), 7.47 (s, 1H), 7.45 – 7.38 (m, 1H), 7.36 – 7.25 (m, 2H), 7.17 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 6.96 – 6.91 (m, 1H), 2.63 (s, 6H). kwas 8-amino-6-(4-fluorofenylo)-5-(4-metylochinolin-6-ylo)imidazo[1,2-a]pirazyno-2-karboksylowy (2.269) a. Zgodnie z procedurą OA otrzymano 6-chloro-5-(4-fluorofenylo)pirazyno-2-aminę 2.262 jako jasnożółte ciało stałe (18.2 g, 85%). MS: 224.0 (M+1). b. Do r-ru 2.262 (15.0 g, 64.2 mmol) w ACN (100 ml), w 0 °C, dodano w trzech porcjach NBS (12.6 g, 70.6 mmol). Reakcję doprowadzono do RT i ogrzewano w 70 °C przez 1 godz. Po ochłodzeniu powstały osad odsączono i wysuszono. Uzyskano 3-bromo-6-chloro-5-(4-fluorofenylo)pirazyno-2-aminę 2.265 jako jasnożółte ciało stałe (12.6 g, 65%). MS: 303.7 (M+1). c. Mieszaninę 2.265 (10.0 g, 33.1 mmol), bromopirogronianu etylu (19.3 g, 99.2 mmol) i DME (130 ml), mieszano w RT przez 1 godz. oraz w 85 °C przez 16 godz. Następnie dodano r-r NaHCO3 i ekstrahowano DCM. Połączone fazy organiczne przemyto solanką i wysuszono nad bezw. MgSO4. Środek suszący odsączono, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono metodą FCC. Otrzymano 8-bromo-5-chloro-6-(4-fluorofenylo)imidazo[1,2-a]pirazyno-2-karboksylan etylu 2.263 w postaci białego ciała stałego (4.5 g, 31%). MS: 400.1 (M+1). d. Mieszaninę 2.263 (11.0 g, 31.1 mmol) i 0.5 M r-ru amoniaku w dioksanie (140 ml) ogrzewano w 110 °C przez 20 godz. Wszystkie lotne substancje usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono metodą FCC. Uzyskano 8-amino-5-chloro-6-(4-fluorofenylo)imidazo[1,2-a]pirazyno-2-karboksylan etylu 2.266 jako białe ciało stałe (10.5 g, 100%). MS: 335.2 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.48 (s, 1H), 7.77 - 7.70 (m, 2H), 7.60 (s, 2H), 7.35 - 7.28 (m, 2H), 4.36 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 1.34 (t, J = 7.1 Hz, 3H). e. Zgodnie z procedurą OD otrzymano 8-amino-6-(4-fluorofenylo)-5-(4-metylochinolin-6-ylo)imidazo[1,2-a]pirazyno-2-karboksylan etylu 2.268 jako białe ciało stałe (0.306 g, 34%). MS: 442.4 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.04 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 8.39 (s, 1H), 8.24 - 8.20 (m, 1H), 7.96 - 7.90 (m, 2H), 7.74 (d, J = 4.7 Hz, 1H), 7.39 - 7.32 (m, 2H), 7.09 - 7.01 (m, 2H), 4.29 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 2.71 (s, 3H), 1.26 (t, J = 7.1 Hz, 3H). f. Do r-ru 2.268 (0.240 g, 0.54 mmol) w EtOH (5 ml) dodano r-r LiOH (0.034 g, 0.82 mmol) w wodzie (2 ml). Mieszaninę ogrzewano w 90 °C przez 2 godz. Wszystkie lotne substancje usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, a produkt przekształcono w sól HCl. Uzyskano surowy chlorowodorek 2.269 jako żółte ciało stałe (0.230 g). MS: 414.2 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.12 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 8.49 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 8.30 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 8.02 - 7.92 (m, 2H), 7.85 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 7.45 - 7.35 (m, 2H), 7.1 1 (dd, J = 10.0, 7.8 Hz, 2H), 2.78 (s, 3H). 8-amino-6-(4-fluorofenylo)-5-(4-metylochinolin-6-ylo)imidazo[1,2-a]pirazyno-2-karboksyamid (2.270) a. Mieszaninę 2.266 (2.400 g, 6.33 mmol) i 7 M r-ru amoniaku w MeOH (120 ml), ogrzewano w 95 °C przez 18 godz. Mieszaninę schłodzono w łaźni lodowej, a osad odsączono, przemyto Et2O i wysuszono. Uzyskano 8-amino-5-chloro-6-(4-fluorofenylo)imidazo[1,2-a]pirazyno-2-karboksyamid 3.41 jako beżowe ciało stałe (1.700 g, 88%). MS: 305.9 (M+1). b. Zgodnie z procedurą OD otrzymano chlorowodorek 2.270 jako żółte ciało stałe (0.012 g, 15%). MS: 413.3 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.08 (d, J = 5.1 Hz, 1H), 8.47 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 8.26 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.00 (s, 1H), 7.91 (dd, J = 8.8, 1.8 Hz, 1H), 7.81 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.57 (d, J = 13.2 Hz, 2H), 7.43 - 7.35 (m, 2H), 7.14 - 7.04 (m, 2H), 2.76 (s, 3H). 8-amino-6-(4-fluorofenylo)-N-metylo-5-(4-metylochinolin-6-ylo)imidazo[1,2-a]pirazyno-2-karboksyamid (2.271) Związek przygotowano jak 2.270, w etapie (a) stosując 33% r-r MeNH2 w EtOH. Uzyskano chlorowodorek 2.271 jako żółte ciało stałe (0.003 g, 66%). MS: 427.3 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.06 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 8.44 (s, 1H), 8.23 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 8.18 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.90 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.77 (s, 1H), 7.42 - 7.34 (m, 2H), 7.08 (t, J = 8.7 Hz, 2H), 2.78 (d, J = 4.7 Hz, 3H), 2.74 (s, 3H). 8-amino-6-(4-fluorofenylo)-N-metylo-5-(4-metylochinolin-6-ylo)imidazo[1,2-a]pirazyno-2-karboksyamid (2.272) Do r-ru 2.268 (0.030 g, 0.07 mmol) i 2 M r-ru Me2NH (0.04 ml, 0.08 mmol) w bezw. THF (2 ml), w atm. gazu obojętnego, wkroplono 2 M r-r AlMe3 w toluenie (0.04 ml, 0.08 mmol). Mieszaninę ogrzewano w reaktorze mikrofalowym, w 130 °C, przez 8 min. Reakcję zakończono przez dodanie wody. Mieszaninę przesączono przez celit, a przesącz zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono metodą FCC i przekształcono w sól HCl. Uzyskano chlorowodorek 2.272 jako żółte ciało stałe (0.005 g, 12%). MS: 441.3 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.07 (d, J = 5.1 Hz, 1H), 8.45 (s, 1H), 8.23 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.90 (dd, J = 8.7, 1.8 Hz, 1H), 7.82 (s, 1H), 7.78 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 7.42 - 7.35 (m, 2H), 7.09 (t, J = 8.9 Hz, 2H), 3.38 (s, 3H), 2.98 (s, 3H), 2.74 (s, 3H). 8-amino-N-tert-butylo-6-(4-fluorofenylo)-5-(4-metylochinolin-6-ylo)imidazo[1,2-a]pirazyno-2-karboksyamid (2.273) Zgodnie z procedurą I otrzymano chlorowodorek 2.273 jako żółte ciało stałe (0.019 g, 28%). MS: 469.3 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.13 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 8.49 (s, 1H), 8.32 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.95 (dd, J = 8.8, 1.8 Hz, 1H), 7.91 - 7.82 (m, 2H), 7.48 (s, 1H), 7.43 - 7.36 (m, 2H), 7.10 (t, J = 8.9 Hz, 2H), 2.79 (s, 3H), 1.39 (s, 9H). 8-amino-6-(4-fluorofenylo)-N-metylo-5-(4-metylochinolin-6-ylo)-N-(propan-2-ylo)imidazo[1,2-a]pirazyno-2-karboksyamid (2.274) Zgodnie z procedurą I otrzymano chlorowodorek 2.274 jako żółte ciało stałe (0.018 g, 13%). MS: 469.0 (M+1). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 9.15 (d, J =5.3 Hz, 1H), 8.94 (s, 1H), 8.55 (s, 1H), 8.38 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 8.01 - 7.87 (m, 3H), 7.48 - 7.38 (m, 2H), 7.21 - 7.08 (m, 2H), 4.78 - 4.63 (m, 1H), 3.09 (s, 3H), 2.81 (s, 3H), 1.22 - 1.06 (m, 6H). 8-amino-6-(4-fluorofenylo)-N-(2-metoksyetylo)-N-metylo-5-(4-metylochinolin-6-ylo)imidazo[1,2-a]pirazyno-2-karboksyamid (2.276) Zgodnie z procedurą I otrzymano chlorowodorek 2.276 jako żółte ciało stałe (0.018 g, 13%). MS: 485.0 (M+1). 1H NMR (300 MHz, D2O) δ 8.90 (d, J = 5.7 Hz, 1H), 8.43 (s, 1H), 8.15 (dd, J = 8.8, 1.7 Hz, 1H), 8.02 - 7.82 (m, 3H), 7.37 - 7.26 (m, 2H), 7.02 - 6.90 (m, 2H), 3.94 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 3.67 (s, 2H), 3.59 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 3.32 - 3.22 (m, 3H), 3.10 - 2.98 (m, 3H), 2.78 (s, 3H). 6-(4-fluorofenylo)-2-[4-(2-metoksyetylo)piperazyno-1-karbonylo]-5-(4-metylochinolin-6-ylo)imidazo[1,2-a]pirazyno-8-amina (2.275) Zgodnie z procedurą I otrzymano chlorowodorek 2.275 jako żółte ciało stałe (0.024 g, 9%). MS: 540.0 (M+1). 1H NMR (400 MHz, D2O) δ 11.27 (s, 1H), 9.14 (d, J = 5.3 Hz, 1H), 8.52 (s, 2H), 8.37 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.03 - 7.83 (m, 3H), 7.40 (dd, J = 8.7, 5.5 Hz, 2H), 7.10 (t, J = 8.9 Hz, 2H), 5.43 (s, 1H), 4.59 - 4.49 (m, 1H), 3.82 - 3.71 (m, 2H), 3.61 - 3.52 (m, 2H), 3.41 - 3.27 (m, 5H), 3.26 - 3.03 (m, 4H), 2.80 (s, 3H). HRMS (M+1): obliczono dla C30H31FN7O2: 540.2518, znaleziono: 540.2515. 4 LITERATURA [1] B. Allard, M. S. Longhi, S. C. Robson, J. Stagg, Immunological Reviews 2017, 276, 121–144. [2] D. Allard, P. Chrobak, B. Allard, N. Messaoudi, J. Stagg, Immunology Letters 2019, 205, 31–39. [3] D. Allard, M. Turcotte, J. Stagg, Immunology & Cell Biology 2017, 95, 333–339. [4] Z. Gao, K. Dong, H. Zhang, BioMed Research International 2014, Article ID e460654. [5] H. Sung, J. Ferlay, R. L. Siegel, M. Laversanne, I. Soerjomataram, A. Jemal, F. Bray, CA: A Cancer Journal for Clinicians 2018, 68, 394–424. [6] G. L. Beatty, W. L. Gladney, Clin Cancer Res 2015, 21, 687–692. [7] S. Szala, Postepy Hig Med Dosw (Online) 2009, 63, 598–612. [8] G. T. Motz, G. Coukos, Nat Rev Immunol 2011, 11, 702–711. [9] A. Facciabene, G. T. Motz, G. Coukos, Cancer Res 2012, 72, 2162–2171. [10] S. L. Topalian, C. G. Drake, D. M. Pardoll, Cancer Cell 2015, 27, 450–461. [11] P. Sharma, S. Hu-Lieskovan, J. A. Wargo, A. Ribas, Cell 2017, 168, 707–723. [12] R. W. Jenkins, D. A. Barbie, K. T. Flaherty, British Journal of Cancer 2018, 118, 9–16. [13] J.-R. Hu, R. Florido, E. J. Lipson, J. Naidoo, R. Ardehali, C. G. Tocchetti, A. R. Lyon, R. F. Padera, D. B. Johnson, J. Moslehi, Cardiovasc Res 2019, 115, 854–868. [14] M. Ovacik, K. Lin, Clin Transl Sci 2018, 11, 540–552. [15] Y. Han, L. Zhu, W. Wu, H. Zhang, W. Hu, L. Dai, Y. Yang, in Regulation of Cancer Immune Checkpoints: Molecular and Cellular Mechanisms and Therapy (Ed.: J. Xu), Springer, Singapore, 2020, 547–618. [16] J. Li, J. Van Valkenburgh, X. Hong, P. S. Conti, X. Zhang, K. Chen, Theranostics 2019, 9, 7849–7871. [17] A. N. Drury, A. Szent-Györgyi, J Physiol 1929, 68, 213–237. [18] B. B. Fredholm, A. P. IJzerman, K. A. Jacobson, K. N. Klotz, J. Linden, Pharmacol Rev 2001, 53, 527–552. [19] B. B. Fredholm, G. Arslan, L. Halldner, B. Kull, G. Schulte, W. Wasserman, Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 2000, 362, 364–374. [20] B. Allard, P. A. Beavis, P. K. Darcy, J. Stagg, Current Opinion in Pharmacology 2016, 29, 7–16. [21] G. Kroemer, L. Galluzzi, O. Kepp, L. Zitvogel, Annu Rev Immunol 2013, 31, 51–72. [22] A. Young, D. Mittal, J. Stagg, M. J. Smyth, Cancer Discov 2014, 4, 879–888. [23] L. Antonioli, M. Fornai, C. Pellegrini, V. D’Antongiovanni, R. Turiello, S. Morello, G. Haskó, C. Blandizzi, in Tumor Microenvironment: Signaling Pathways – Part B (Ed.: A. Birbrair), Springer International Publishing, Cham, 2021, 145–167. [24] R. D. Leone, L. A. Emens, J Immunother Cancer 2018, 6, 57. [25] J. Bastid, A. Cottalorda-Regairaz, G. Alberici, N. Bonnefoy, J.-F. Eliaou, A. Bensussan, Oncogene 2013, 32, 1743–1751. [26] J. D. Powderly, P. L. de Souza, R. Gutierrez, L. Horvath, L. Seitz, D. Ashok, A. Park, M. J. Walters, J. J. Karakunnel, W. Berry, A. Rieger, A. Garofalo, D. W. Lai, A. Chaudhry, JCO 2019, 37, 2604–2604. [27] A. Chiappori, C. C. Williams, B. C. Creelan, T. Tanvetyanon, J. E. Gray, E. B. Haura, R. Thapa, D.-T. Chen, A. A. Beg, T. A. Boyle, J. Bendiske, E. Morris, A. Tao, F. K. Hurtado, L. Manenti, J. Castro, S. J. Antonia, JCO 2018, 36, 9089–9089. [28] L. Fong, A. Hotson, J. D. Powderly, M. Sznol, R. S. Heist, T. K. Choueiri, S. George, B. G. M. Hughes, M. D. Hellmann, D. R. Shepard, B. I. Rini, S. Kummar, A. M. Weise, M. J. Riese, B. Markman, L. A. Emens, D. Mahadevan, J. J. Luke, G. Laport, J. D. Brody, L. Hernandez-Aya, P. Bonomi, J. W. Goldman, L. Berim, D. J. Renouf, R. A. Goodwin, B. Munneke, P. Y. Ho, J. Hsieh, I. McCaffery, L. Kwei, S. B. Willingham, R. A. Miller, Cancer Discov 2020, 10, 40–53. [29] A. Pinna, CNS Drugs 2014, 28, 455–474. [30] L. C. Harshman, M. Chu, S. George, B. G. M. Hughes, B. C. Carthon, L. Fong, J. R. Merchan, L. Kwei, A. N. Hotson, M. Mobasher, R. A. Miller, JCO 2020, 38, 129–129. [31] J. Bendell, T. Bauer, M. Patel, G. Falchook, J. Karlix, E. Lim, G. Mugundu, P. Mitchell, G. Pouliot, G. Moorthy, B. Linghu, L. McGrath, B. Harrop, W. Shao, C. Drake, K. F. Sachsenmeier, M. Merchant, Cancer Res 2019, 79 (Suplement), CT026. [32] D. Preti, P. G. Baraldi, A. R. Moorman, P. A. Borea, K. Varani, Medicinal Research Reviews 2015, 35, 790–848. [33] C. M. Reyes, M. C. Cornelis, Nutrients 2018, 10, 1772. [34] A. Ohta, E. Gorelik, S. J. Prasad, F. Ronchese, D. Lukashev, M. K. K. Wong, X. Huang, S. Caldwell, K. Liu, P. Smith, J.-F. Chen, E. K. Jackson, S. Apasov, S. Abrams, M. Sitkovsky, PNAS 2006, 103, 13132–13137. [35] K. A. Jacobson, Z.-G. Gao, P. Matricon, M. T. Eddy, J. Carlsson, British Journal of Pharmacology 2020, 1-16. [36] H. Kase, S. Aoyama, M. Ichimura, K. Ikeda, A. Ishii, T. Kanda, K. Koga, N. Koike, M. Kurokawa, Y. Kuwana, A. Mori, J. Nakamura, H. Nonaka, M. Ochi, M. Saki, J. Shimada, T. Shindou, S. Shiozaki, F. Suzuki, M. Takeda, K. Yanagawa, P. J. Richardson, P. Jenner, P. Bedard, E. Borrelli, R. A. Hauser, T. N. Chase, Neurology 2003, 61, S97-100. [37] F. Azam, I. Rajab, A. Alruiad, Die Pharmazie 2009, 64, 771–95. [38] J.-F. Chen, R. A. Cunha, Purinergic Signal 2020, 16, 167–174. [39] J. Hockemeyer, J. C. Burbiel, C. E. Müller, J. Org. Chem. 2004, 69, 3308–3318. [40] Y. Nonaka, J. Shimada, H. Nonaka, N. Koike, N. Aoki, H. Kobayashi, H. Kase, K. Yamaguchi, F. Suzuki, J Med Chem 1993, 36, 3731–3733. [41] M. Załuski, J. Schabikowski, P. Jaśko, A. Bryła, A. Olejarz-Maciej, M. Kaleta, M. Głuch-Lutwin, A. Brockmann, S. Hinz, M. Zygmunt, K. Kuder, G. Latacz, C. Vielmuth, C. E. Müller, K. Kieć-Kononowicz, Bioorganic Chemistry 2020, 101, 104033. [42] S. Rivara, G. Piersanti, F. Bartoccini, G. Diamantini, D. Pala, T. Riccioni, M. A. Stasi, W. Cabri, F. Borsini, M. Mor, G. Tarzia, P. Minetti, J Med Chem 2013, 56, 1247–1261. [43] A. Drabczyńska, C. E. Müller, B. Schumacher, S. Hinz, J. Karolak-Wojciechowska, B. Michalak, E. Pękala, K. Kieć-Kononowicz, Bioorganic & Medicinal Chemistry 2004, 12, 4895–4908. [44] J. Zhang, W. Yan, W. Duan, K. Wüthrich, J. Cheng, Pharmaceuticals 2020, 13, 237. [45] E. Houthuys, P. Basilico, M. Brouwer, T. Deregnaucourt, M. Detheux, G. Driessens, B. Gomes, X. Leroy, J. Marchante, R. Marillier, J. Swiercz, S. Crosignani, Cancer Res 2019, 79, 3261–3261. [46] M. Williams, J. Francis, G. Ghai, A. Braunwalder, S. Psychoyos, G. A. Stone, W. D. Cash, J Pharmacol Exp Ther 1987, 241, 415–420. [47] K. O. Gelotte, D. N. Mason, H. Meckler, W.-C. Shieh, C. M. Starkey, Journal of Heterocyclic Chemistry 1990, 27, 1549–1552. [48] Comprehensive Organic Name Reactions and Reagents, American Cancer Society, 2010, 2092–2096. [49] S. M. Poucher, J. R. Keddie, P. Singh, S. M. Stoggall, P. W. Caulkett, G. Jones, M. G. Coll, Br J Pharmacol 1995, 115, 1096–1102. [50] V.-P. Jaakola, M. T. Griffith, M. A. Hanson, V. Cherezov, E. Y. T. Chien, J. R. Lane, A. P. Ijzerman, R. C. Stevens, Science 2008, 322, 1211–1217. [51] M. Congreve, S. P. Andrews, A. S. Doré, K. Hollenstein, E. Hurrell, C. J. Langmead, J. S. Mason, I. W. Ng, B. Tehan, A. Zhukov, M. Weir, F. H. Marshall, J. Med. Chem. 2012, 55, 1898–1903. [52] S. J. Jeon, S. Y. Rhee, J. H. Ryu, J. H. Cheong, K. Kwon, S.-I. Yang, S. H. Park, J. Lee, H. Y. Kim, S.-H. Han, K. H. Ko, C. Y. Shin, Neurochem Res 2011, 36, 2259. [53] F. da Rocha Lapa, A. P. L. de Oliveira, B. G. Accetturi, I. de Oliveira Martins, H. V. Domingos, D. de Almeida Cabrini, W. T. de Lima, A. R. S. Santos, Purinergic Signalling 2013, 9, 325–336. [54] J. R. Keddie, S. M. Poucher, G. R. Shaw, R. Brooks, M. G. Collis, Eur J Pharmacol 1996, 301, 107–113. [55] M. Jörg, M. Agostino, E. Yuriev, F. S. Mak, N. D. Miller, J. M. White, P. J. Scammells, B. Capuano, Struct Chem 2013, 24, 1241–1251. [56] P. W. R. Caulkett, G. Jones, M. G. Collis, S. M. Poucher, Azole Derivatives., 1991, EP0459702A1. [57] P. G. Baraldi, S. Manfredini, D. Simoni, L. Zappaterra, C. Zocchi, S. Dionisotti, E. Ongini, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 1994, 4, 2539–2544. [58] E. Kiselgof, D. B. Tulshian, L. Arik, H. Zhang, A. Fawzi, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2005, 15, 2119–2122. [59] D. Mittal, A. Young, K. Stannard, M. Yong, M. W. L. Teng, B. Allard, J. Stagg, M. J. Smyth, Cancer Res 2014, 74, 3652–3658. [60] B. B. Fredholm, K. Lindström, S. Dionisotti, E. Ongini, J Neurochem 1998, 70, 1210–1216. [61] P. G. Baraldi, B. Cacciari, G. Spalluto, M. J. Pineda de las Infantas y Villatoro, C. Zocchi, S. Dionisotti, E. Ongini, J. Med. Chem. 1996, 39, 1164–1171. [62] P. G. Baraldi, M. A. Tabrizi, R. Romagnoli, H. El-Kashef, D. Preti, A. Bovero, F. Fruttarolo, M. Gordaliza, P. A. Borea, Current Organic Chemistry 2006, 10, 259–275. [63] P. G. Baraldi, G. Saponaro, R. Romagnoli, M. Aghazadeh Tabrizi, S. Baraldi, A. R. Moorman, S. Cosconati, S. Di Maro, L. Marinelli, S. Gessi, S. Merighi, K. Varani, P. A. Borea, D. Preti, J. Med. Chem. 2012, 55, 5380–5390. [64] A. Churov, G. Zhulai, Human Immunology 2021, 82, 270–278. [65] B. R. Neustadt, J. Hao, N. Lindo, W. J. Greenlee, A. W. Stamford, D. Tulshian, E. Ongini, J. Hunter, A. Monopoli, R. Bertorelli, C. Foster, L. Arik, J. Lachowicz, K. Ng, K.-I. Feng, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2007, 17, 1376–1380. [66] S. Morita, K. Kitano, J. Matsubara, T. Ohtani, Y. Kawano, K. Otsubo, M. Uchida, Tetrahedron 1998, 54, 4811–4818. [67] S. Crosignani, B. Gomes, E. Houthuys, 2-Oxo-Thiazole Derivatives as A2a Inhibitors and Compounds for Use in the Treatment of Cancers, 2018, WO2018178338A1. [68] L. Buisseret, S. Rottey, J. de Bono, M. Mossakowski, B. Delafontaine, T. Manickavasagar, N. Kotecki, C. Martinoli, M. Schneider, O. D. Henau, P. Chevron, J. Lager, J.-P. Machiels, Cancer Res 2020, 80, CT152–CT152. [69] S. Crosignani, P. Dickinson, M. De Matas, E. J. K. H. Houthuys, R. G. Marillier, C. Martinoli, O. De Henau, G. Driessens, Thiocarbamate Derivatives as A2a Inhibitors, Pharmaceutical Composition Thereof and Combinations with Anticancer Agents, 2020, WO2020053263A1. [70] C. O. Okafor, J. Org. Chem. 1973, 38, 4383–4386. [71] R. Frank, M. Schutkowski, Chem. Commun. 1996, 2509–2510. [72] R. J. Gillespie, J. Lerpiniere, S. Gaur, S. J. Bamford, G. C. Stratton, S. Leonardi, S. M. Weiss, Triazolo[4,5-d] Pyrimidine Derivatives And Their Use as Purinergic Receptor Antagonists, 2002, WO02055083A1. [73] F. Yu, C. Zhu, Q. Xie, Y. Wang, J. Med. Chem. 2020, 63, 12196–12212. [74] S. Gessi, S. Merighi, V. Sacchetto, C. Simioni, P. A. Borea, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes 2011, 1808, 1400–1412. [75] P. Rucktooa, R. K. Y. Cheng, E. Segala, T. Geng, J. C. Errey, G. A. Brown, R. M. Cooke, F. H. Marshall, A. S. Doré, Scientific Reports 2018, 8, 41. [76] A. S. Kalgutkar, D. Dalvie, Annu Rev Pharmacol Toxicol 2015, 55, 35–54. [77] L. A. Peterson, Chem. Res. Toxicol. 2013, 26, 6–25. [78] R. J. Gillespie, S. J. Bamford, R. Botting, M. Comer, S. Denny, S. Gaur, M. Griffin, A. M. Jordan, A. R. Knight, J. Lerpiniere, S. Leonardi, S. Lightowler, S. McAteer, A. Merrett, A. Misra, A. Padfield, M. Reece, M. Saadi, D. L. Selwood, G. C. Stratton, D. Surry, R. Todd, X. Tong, V. Ruston, R. Upton, S. M. Weiss, J. Med. Chem. 2009, 52, 33–47. [79] Y. F. Shealy, J. D. Clayton, C. A. O’Dell, J. A. Montgomery, J. Org. Chem. 1962, 27, 4518–4523. [80] S. Bamford, R. Gillespie, R. Todd, Triazolo [4, 5-D] Pyramidine Derivatives and Their Use as Purine Receptor Antagonists, 2009, WO2009156737A1. [81] K. By, W. Jones, B. Wolfe, Processes for Making Triazolo[4,5d] Pyramidine Derivatives and Intermediates Thereof, 2018, WO2018183965A1. [82] K. By, W. Jones, B. Wolfe, Processes for Making Triazolo [4,5d] Pyramidine Derivatives and Intermediates Thereof, 2020, WO2020068583A1. [83] A. Flohr, J.-L. Moreau, S. Poli, C. Riemer, L. Steward, 4-Hydroxy-4-Methyl-Piperidine-1-Carboxylic Acid (4-Methoxy-7-Morpholin-4-Yl-Benzothiazol-2-Yl)-Amide, 2005, US20050261289A1. [84] P. A. Beavis, N. Milenkovski, M. A. Henderson, L. B. John, B. Allard, S. Loi, M. H. Kershaw, J. Stagg, P. K. Darcy, Cancer Immunol Res 2015, 3, 506–517. [85] P. Spurr, Cyclization Process for Substituted Benzothiazole Derivatives, 2004, US2004138465A1. [86] A. Hugershoff, Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft 1903, 36, 3121–3134. [87] J. A. C. Gomez, J. C. C.-P. Laria, 4 - Aminopyrimidine Derivatives and Their as as Adenosine A2a Receptor Antagonists, 2012, WO2011121418A9. [88] M. I. C. Crespo, Q. M. Prat, S. G. Roig, J. C. C. P. Laria, D. H. Slee, 2, 6 Bisheteroaryl-4-Aminopyrimidines as Adenosine Receptor Antagonists, 2005, WO2005058883A1. [89] S. Bilic, J. A. C. Gomez, J. S. Cameron, J. C. C.-P. Laria, D. R. H. Jr, 1-(4-Amino-5-Bromo-6-(1H-pyrazol-1-yl)pyrimidin-2-yl)-1H-pyrazol-4-ol and Use Thereof in the Treatment of Cancer, 2018, WO2018146612A1. [90] M. S. Congreve, S. P. Andrews, J. S. Mason, C. M. Richardson, G. A. Brown, 1,2,4-Triazine-4-Amine Derivatives, 2011, WO2011095625A1. [91] M. M. Littleson, A. D. Campbell, A. Clarke, M. Dow, G. Ensor, M. C. Evans, A. Herring, B. A. Jackson, L. V. Jackson, S. Karlsson, D. J. Klauber, D. H. Legg, K. W. Leslie, Š. Moravčík, C. D. Parsons, T. O. Ronson, R. E. Meadows, Org. Process Res. Dev. 2019, 23, 1407–1419. [92] J. J. Douglas, B. W. V. Adams, H. Benson, K. Broberg, P. M. Gillespie, O. Hoult, A. K. Ibraheem, S. Janbon, G. Janin, C. D. Parsons, R. C. Sigerson, D. J. Klauber, Org. Process Res. Dev. 2019, 23, 62–68. [93] J. Takagi, K. Sato, J. F. Hartwig, T. Ishiyama, N. Miyaura, Tetrahedron Letters 2002, 43, 5649–5651. [94] J. Beatty, L. Debien, J. Jeffrey, M. R. Leleti, D. Mandal, D. Miles, J. Powers, B. Rosen, R. Thomas-Tran, E. Sharif, Azolopyrimidine for the Treatment of Cancer-Related Disorders, 2018, WO2018136700A1. [95] B. Allard, D. Allard, L. Buisseret, J. Stagg, Nature Reviews Clinical Oncology 2020, 17, 611–629. [96] L. Seitz, L. Jin, M. Leleti, D. Ashok, J. Jeffrey, A. Rieger, R. G. Tiessen, G. Arold, J. B. L. Tan, J. P. Powers, M. J. Walters, J. Karakunnel, Invest New Drugs 2019, 37, 711–721. [97] E. U. Sharif, D. H. Miles, B. R. Rosen, J. L. Jeffrey, L. P. P. Debien, J. P. Powers, M. R. Leleti, Org. Process Res. Dev. 2020, 24, 1254–1261. [98] F. Himo, T. Lovell, R. Hilgraf, V. V. Rostovtsev, L. Noodleman, K. B. Sharpless, V. V. Fokin, J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 210–216. [99] B. R. Rosen, E. Ul Sharif, D. H. Miles, N. S. Chan, M. R. Leleti, J. P. Powers, Tetrahedron Letters 2020, 61, 151855. [100] H. Zimmermann, M. Zebisch, N. Sträter, Purinergic Signalling 2012, 8, 437–502. [101] L. G. Viviani, E. Piccirillo, H. Ulrich, A. T. -do Amaral, J. Chem. Inf. Model. 2020, 60, 621–630. [102] H. P. Baer, G. I. Drummond, E. L. Duncan, Mol Pharmacol 1966, 2, 67–76. [103] R. M. Burger, J. M. Lowenstein, Journal of Biological Chemistry 1970, 245, 6274–6280. [104] J. L. Jeffrey, K. V. Lawson, J. P. Powers, J. Med. Chem. 2020, 63, 13444–13465. [105] S. Bhattarai, M. Freundlieb, J. Pippel, A. Meyer, A. Abdelrahman, A. Fiene, S.-Y. Lee, H. Zimmermann, G. G. Yegutkin, N. Sträter, A. El-Tayeb, C. E. Müller, J. Med. Chem. 2015, 58, 6248–6263. [106] S. Bhattarai, J. Pippel, A. Meyer, M. Freundlieb, C. Schmies, A. Abdelrahman, A. Fiene, S.-Y. Lee, H. Zimmermann, A. El‐Tayeb, G. G. Yegutkin, N. Sträter, C. E. Müller, Advanced Therapeutics 2019, 2, 1900075. [107] S. Bhattarai, J. Pippel, E. Scaletti, R. Idris, M. Freundlieb, G. Rolshoven, C. Renn, S.-Y. Lee, A. Abdelrahman, H. Zimmermann, A. El-Tayeb, C. E. Müller, N. Sträter, J. Med. Chem. 2020, 63, 2941–2957. [108] K. V. Lawson, J. Kalisiak, E. A. Lindsey, E. T. Newcomb, M. R. Leleti, L. Debien, B. R. Rosen, D. H. Miles, E. U. Sharif, J. L. Jeffrey, J. B. L. Tan, A. Chen, S. Zhao, G. Xu, L. Fu, L. Jin, T. W. Park, W. Berry, S. Moschütz, E. Scaletti, N. Sträter, N. P. Walker, S. W. Young, M. J. Walters, U. Schindler, J. P. Powers, J. Med. Chem. 2020, 63, 11448–11468. [109] E. U. Sharif, J. Kalisiak, K. V. Lawson, D. H. Miles, E. Newcomb, E. A. Lindsey, B. R. Rosen, L. P. P. Debien, A. Chen, X. Zhao, S. W. Young, N. P. Walker, N. Sträter, E. R. Scaletti, L. Jin, G. Xu, M. R. Leleti, J. P. Powers, J. Med. Chem. 2021, 64, 845–860. [110] X. Du, J. Moore, B. R. Blank, J. Eksterowicz, D. Sutimantanapi, N. Yuen, T. Metzger, B. Chan, T. Huang, X. Chen, Y. Chen, F. Duong, W. Kong, J. H. Chang, J. Sun, T. Zavorotinskaya, Q. Ye, M. R. Junttila, C. Ndubaku, L. S. Friedman, V. R. Fantin, D. Sun, J. Med. Chem. 2020, 63, 10433–10459. [111] S. Cacatian, D. a Claremon, L. Jia, A. Morales-Ramos, S. B. Singh, S. Venkatraman, Z. Xu, Y. Zheng, Purine Derivatives as Cd73 Inhibitors for the Treatment of Cancer, 2015, WO2015164573A1. [112] B. Wang, H. Yang, K. Bedke, P. Wehn, J. P. Rizzi, Cd73 Inhibitors and Uses Thereof, 2018, WO2018183635A1. [113] L. Chen, R. J. Billedeau, J. Li, T. F. STANTON, Ectonucleotidase Inhibitors and Methods of Use Thereof, 2020, WO2020257429A1. [114] L. P. P. Debien, J. C. Jaen, J. Kalisiak, K. V. Lawson, M. R. Leleti, E. A. Lindsey, D. H. Miles, E. Newcomb, J. P. Powers, B. R. Rosen, E. U. Sharif, Modulators of 5’-Nucleotidase, Ecto and the Use Thereof, 2017, US20170267710A1. [115] J. Fournier, X. Yan, A. T. Tran, R. L. Grange, S. D. Jacob, J. Kalisiak, K. V. Lawson, E. F. Connor, M. R. Leleti, J. P. Powers, Org. Process Res. Dev. 2021, 25, 157–162. [116] R. Jayarajan, G. Vasuki, Tetrahedron Letters 2012, 53, 3044–3048. [117] E. Braganhol, A. S. K. Tamajusuku, A. Bernardi, M. R. Wink, A. M. O. Battastini, Biochim Biophys Acta 2007, 1770, 1352–1359. [118] C. Naveenkumar, S. Asokkumar, S. Raghunandhakumar, S. Jagan, P. Anandakumar, T. A. Augustine, S. Kamaraj, T. Devaki, Fundamental & Clinical Pharmacology 2012, 26, 259–270. [119] R. Luo, J. Wang, L. Zhao, N. Lu, Q. You, Q. Guo, Z. Li, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2014, 24, 1334–1338. [120] M. W. Beukers, C. J. M. Kerkhof, M. A. van Rhee, U. Ardanuy, C. Gurgel, H. Widjaja, P. Nickel, A. P. IJzerman, W. Soudijn, Naunyn-Schmiedeberg’s Arch Pharmacol 1995, 351, 523–528. [121] J. Iqbal, A. Saeed, R. Raza, A. Matin, A. Hameed, N. Furtmann, J. Lecka, J. Sévigny, J. Bajorath, European Journal of Medicinal Chemistry 2013, 70, 685–691. [122] Y. Baqi, S.-Y. Lee, J. Iqbal, P. Ripphausen, A. Lehr, A. B. Scheiff, H. Zimmermann, J. Bajorath, C. E. Müller, J. Med. Chem. 2010, 53, 2076–2086. [123] P. Ripphausen, M. Freundlieb, A. Brunschweiger, H. Zimmermann, C. E. Müller, J. Bajorath, J. Med. Chem. 2012, 55, 6576–6581. [124] M. al-Rashida, G. Batool, A. Sattar, S. A. Ejaz, S. Khan, J. Lecka, J. Sévigny, A. Hameed, J. Iqbal, European Journal of Medicinal Chemistry 2016, 115, 484–494. [125] C. H. Lee, H. J. Lim, S. J. Park, Y. K. Min, Novel Pyrimidine Sulfonamide Derivatives, 2021, KR20210017856A1. [126] S. Lyu, Y. Zhao, X. Zeng, X. Chen, Q. Meng, Z. Ding, W. Zhao, Y. Qi, Y. Gao, J. Du, J. Chem. Inf. Model. 2021, 61, 1275–1286. [127] S. Mo, S. Wang, G. Zhou, Y. Yang, Y. Li, X. Chen, J. Shi, J. Nat. Prod. 2004, 67, 823–828. [128] M. Miliutina, J. Janke, S. Hassan, S. Zaib, J. Iqbal, J. Lecka, J. Sévigny, A. Villinger, A. Friedrich, S. Lochbrunner, P. Langer, Org. Biomol. Chem. 2018, 16, 717–732. [129] A. Ashraf, Z. Shafiq, M. S. Khan Jadoon, M. N. Tahir, J. Pelletier, J. Sevigny, M. Yaqub, J. Iqbal, ACS Med. Chem. Lett. 2020, 11, 2397–2405. [130] S. Hassan, S. A. Ejaz, A. Saeed, M. Shehzad, S. Ullah Khan, J. Lecka, J. Sévigny, G. Shabir, J. Iqbal, Bioorganic Chemistry 2018, 76, 237–248. [131] F. C. Patricia, F. Fabricio, M. das N. Gustavo, A. Saulo, F. K. Daniel, M. O. B. Ana, L. E.-L. Vera, Current Medicinal Chemistry 2015, 22, 1776–1792. [132] J. L. Adams, K. J. Duffy, T. L. Graybill, M. L. Moore, C. E. Neipp, J. M. Ralph, M. D. Squire, 5-Sulfamoyl-2-Hydroxybenzamide Derivatives, 2017, WO2017153952A1. [133] R. D. Dally, P. M. C. Garcia, L. J. I. Heinz, J. M. Howell, F. G. Njoroge, Y. Wang, G. Zhao, Cd73 Inhibitors, 2019, WO2019168744A1. [134] S. M. Garcia-Cerrada, Y. Lu, D. M. Remick, Crystalline Forms of a Cd73 Inhibitor, 2021, WO2021041319A1. [135] L. Delhaye, A. Merschaert, P. Delbeke, W. Briône, Org. Process Res. Dev. 2007, 11, 689–692. [136] W.-M. Cheng, R. Shang, B. Zhao, W.-L. Xing, Y. Fu, Org. Lett. 2017, 19, 4291–4294. [137] J. W. Beatty, E. A. Lindsey, R. Thomas-Tran, L. Debien, D. Mandal, J. L. Jeffrey, A. T. Tran, J. Fournier, S. D. Jacob, X. Yan, S. L. Drew, E. Ginn, A. Chen, A. T. Pham, S. Zhao, L. Jin, S. W. Young, N. P. Walker, M. R. Leleti, S. Moschütz, N. Sträter, J. P. Powers, K. V. Lawson, J. Med. Chem. 2020, 63, 3935–3955. [138] J. Beatty, L. P. P. Debien, S. L. Drew, J. Fournier, R. L. Grange, S. D. Jacob, J. L. Jeffrey, K. V. Lawson, M. R. Leleti, E. A. Lindsey, D. Mandal, J. P. Powers, A. T. Tran, R. Thomas-Tran, X. Yan, Cd73 Inhibitors, 2020, WO2020046813A1. [139] J. L. Adams, L. E. Ator, K. J. Duffy, T. L. Graybill, T. J. Kiesow, Y. Lian, M. L. Moore, J. M. Ralph, L. H. Ridgers, Benzothiadiazine Compounds, 2017. [140] M. J. Miller, M. Ghosh, P. R. Guzzo, P. F. Vogt, J. Hu, G. F. Filzen, A. G. Geyer, Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, American Cancer Society, 2005. [141] K. J. Duffy, C. A. Parrish, L. E. Ator, S. Baskaran, M. G. Darcy, J. A. Oplinger, J. M. Ralph, L. H. Ridgers, X. Tian, C. Zhang, Chemical Compounds, 2019, WO2019053617A1. [142] J. Mallinson, I. Collins, Future Medicinal Chemistry 2012, 4, 1409–1438. [143] B. E. Crack, C. E. Pollard, M. W. Beukers, S. M. Roberts, S. F. Hunt, A. H. Ingall, K. C. McKechnie, A. P. IJzerman, P. Leff, Br J Pharmacol 1995, 114, 475–481. [144] L. Schäkel, C. C. Schmies, R. M. Idris, X. Luo, S.-Y. Lee, V. Lopez, S. Mirza, T. H. Vu, J. Pelletier, J. Sévigny, V. Namasivayam, C. E. Müller, Front. Pharmacol. 2020, 11, 1294. [145] J. Lecka, I. Gillerman, M. Fausther, M. Salem, M. N. Munkonda, J.-P. Brosseau, C. Cadot, M. Martín-Satué, P. d’Orléans-Juste, É. Rousseau, D. Poirier, B. Künzli, B. Fischer, J. Sévigny, British Journal of Pharmacology 2013, 169, 179–196. [146] Kanwal, K. Mohammed Khan, U. Salar, S. Afzal, A. Wadood, M. Taha, S. Perveen, H. Khan, J. Lecka, J. Sévigny, J. Iqbal, Bioorganic Chemistry 2019, 82, 253–266. [147] Y. Wang, C. Wang, Y. Zhu, Y. Zhang, B. Chen, Y. Wu, J. Yao, Z. Miao, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2021, 34, 127758. [148] S.-Y. Lee, A. Fiene, W. Li, T. Hanck, K. A. Brylev, V. E. Fedorov, J. Lecka, A. Haider, H.-J. Pietzsch, H. Zimmermann, J. Sévigny, U. Kortz, H. Stephan, C. E. Müller, Biochemical Pharmacology 2015, 93, 171–181. [149] M. J. Wall, G. Wigmore, J. Lopatář, B. G. Frenguelli, N. Dale, Neuropharmacology 2008, 55, 1251–1258. [150] L. Degennaro, M. Zenzola, A. Laurino, M. M. Cavalluzzi, C. Franchini, S. Habtemariam, R. Matucci, R. Luisi, G. Lentini, Chem Heterocycl Comp 2017, 53, 329–334. [151] D.-W. Kim, Y. K. Ko, S. H. Kim, Synthesis 1992, 1992, 1203–1204. [152] K. Sato, H. Takahagi, T. Yoshikawa, S. Morimoto, T. Takai, K. Hidaka, M. Kamaura, O. Kubo, R. Adachi, T. Ishii, T. Maki, T. Mochida, S. Takekawa, M. Nakakariya, N. Amano, T. Kitazaki, J. Med. Chem. 2015, 58, 3892–3909. [153] D. K. H. Ho, L. Chan, A. Hooper, P. E. Brennan, Tetrahedron Letters 2011, 52, 820–823. [154] D. Kanamori, A. Furukawa, T. Okamura, H. Yamamoto, N. Ueyama, Org. Biomol. Chem. 2005, 3, 1453–1459. [155] Y. Zafrani, D. Yeffet, G. Sod-Moriah, A. Berliner, D. Amir, D. Marciano, E. Gershonov, S. Saphier, J. Med. Chem. 2017, 60, 797–804. [156] J. Su, Q. Chen, L. Lu, Y. Ma, G. H. L. Auyoung, R. Hua, Tetrahedron 2018, 74, 303–307. [157] T. Ryckmans, M. P. Edwards, V. A. Horne, A. M. Correia, D. R. Owen, L. R. Thompson, I. Tran, M. F. Tutt, T. Young, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2009, 19, 4406–4409. [158] A. L. Hopkins, G. M. Keserü, P. D. Leeson, D. C. Rees, C. H. Reynolds, Nat Rev Drug Discov 2014, 13, 105–121. [159] S. M. H. Vendeville, S. J. Last, S. D. Demin, S. C. Grosse, G. Y. P. Haché, L. Hu, S. M. A. Pieters, G. Rombouts, K. Vandyck, W. G. Verschueren, P. J.-M. B. Raboisson, Cyclized Sulfamoylarylamide Derivatives and the Use Thereof as Medicaments for the Treatment of Hepatitis b, 2017, WO2017001655A1. [160] M. Grillo, A.-R. Li, J. Liu, J. C. Medina, Y. Su, Y. Wang, J. Jona, A. Allgeier, J. Milne, J. Murry, J. F. Payack, T. Storz, Phenyl Acetic Acid Derivatives as Inflammation Modulators, 2009, WO2009085177A1. [161] S. C. Schou, H. C. Hansen, T. M. Tagmose, H. C. M. Boonen, A. Worsaae, M. Drabowski, P. Wahl, P. O. G. Arkhammar, T. Bodvarsdottir, M.-H. Antoine, P. Lebrun, J. B. Hansen, Bioorganic & Medicinal Chemistry 2005, 13, 141–155. [162] J. Lloyd, H. J. Finlay, A. Kover, J. Johnson, Z. Pi, J. Jiang, J. Neels, C. Cavallaro, R. Wexler, M. L. Conder, H. Shi, D. Li, H. Sun, A. Chimalakonda, C. Huang, M. Salvati, P. Levesque, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2015, 25, 4983–4986. [163] C. A. G. Baker-Glenn, A. G. M. Barrett, A. A. Gray, P. A. Procopiou, M. Ruston, Tetrahedron Letters 2005, 46, 7427–7430. [164] J. G. Topliss, J. Med. Chem. 1972, 15, 1006–1011. [165] A. Jazayeri, S. P. Andrews, F. H. Marshall, Chem. Rev. 2017, 117, 21–37. [166] A. Bobowska, M. Galezowski, M. Nowak, C. Commandeur, J. Szeremeta-Spisak, M. Nowogrodzki, A. Obara, A. Dzielak, I. Lozinska, M. Dudek, A. Janiga, J. Reus, M. Wronowski, M. Zastawna, A. Radzimierski, M. Swirski, J. Zachmann, C.-H. Fabritius, R. Porter, J. Fogt, Adenosine A2a Receptor 5,6-Bicyclo-Imidazo[1,2-a]pyrazine Modulators, 2019, WO2019002606A1. [167] A. Bobowska, M. Galezowski, J. Szeremeta-Spisak, M. Nowogrodzki, A. Obara, I. Lozinska-Raj, M. Dudek, A. Janiga, J. Reus, M. Wronowski, M. Zastawna, C.-H. Fabritius, A. Rajda, R. A. Porter, P. Wyrebek, M. Swirski, L. Stasi, Modulators of the Adenosine A2a Receptor, 2020, WO2020128036A1. [168] M. A. H. Ismail, D. A. Abou El Ella, K. A. M. Abouzid, A. H. Mahmoud, Bioorganic & Medicinal Chemistry 2012, 20, 2455–2478. [169] H. Wagner, E. Langkopf, M. Eckhardt, R. Streicher, C. Schoelch, A. Schuler-Metz, A. Pautsch, Arylsulphonyglycine Derivatives as Suppressors of the Interaction of Glycogen Phosphorylase a with the Gl Subunit of Glycogen-Associated Protein Phosphatase 1 (Ppl) for the Treatment of Metabolic Disorders, Particulary Diabetes, 2008, WO2008113760A1. [170] E. L. Que, C. J. Chang, J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 15942–15943. [171] J. W. Clary, B. Singaram, Synthesis of Boronic Esters and Boronic Acids Using Grignard Reagents, 2013, WO2013016185A1.