Preparation of molecular tools to study the role of heme oxygenase 1 in cardiac progenitor cells differentiated from human induced pluripotent stem cells

Badania nad sercowymi komórkami progenitorowymi otrzymanymi z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych stają się ważnym kierunkiem rozwoju medycyny regeneracyjnej. Ich głównego zastosowania doszukuje się w terapiach chorób układu sercowo-naczyniowego, takich jak choroba niedokrwienna serca, w tym zawał mięśnia serca. Aktualna skuteczność takich sposobów leczenia nie jest wysoka z uwagi na m.in stosunkowo niską przeżywalność komórek w warunkach niedotlenienia czy ograniczone zdolności proliferacyjne. Poszukuje się więc metod usprawniających i poprawiających wydajność aplikacji sercowych komórek progenitorowych w zaburzeniach kardiologicznych. Obecne doniesienia wskazują na istotną rolę enzymu oksygenazy hemowej 1 w układzie sercowo-naczyniowym, ponieważ produkty jej aktywności wykazują aktywność cytoprotekcyjną, przeciwzapalną i pro-angiogenną.W tej pracy skupiono się na przygotowaniu konstruktu kontrolnego dla regulowanej niedotlenieniem nadekspresji HO-1. W pierwszej kolejności potwierdzono, że wybrana sekwencja sgRNA jest aktywna w ludzkich indukowanych komórkach macierzystych, a następnie, za pomocą reakcji Overlap Extension PCR, przygotowano konstrukt zawierający lewe oraz prawe ramię homologiczne do locus AAVS1 na chromosomie 19, a także sekwencje HRE, minimalny promotor CMV oraz sygnał poliadenylacji. Otrzymane elementy posłużą do dalszej pracy badawczej nad układami regulowanej nadekspresji i wyciszania oksygenazy hemowej 1 w sercowych komórkach progenitorowych.

Research on cardiac progenitor cells derived from human induced pluripotent stem cells is becoming an important direction in the development of regenerative medicine. Their main application is sought in therapies for cardiovascular diseases such as ischemic heart disease, including myocardial infarction. The current effectiveness of such treatments is not high due to, among other things, relatively low cell survival under hypoxia or limited proliferative capacity. Thus, methods are being sought to streamline and improve the efficiency of cardiac progenitor cell application in cardiac disorders. Current reports indicate an important role for the enzyme heme oxygenase 1 in the cardiovascular system, as the products of its activity exhibit cytoprotective, anti-inflammatory and pro-angiogenic activities.The main emphasis of this work was placed on preparation of a control construct for hypoxia-regulated HO-1 overexpression. First confirmation that the selected sgRNA sequence is active in human induced stem cells allowed the preparation of a construct containing the left and right arms homologous to the AAVS1 locus on chromosome 19, as well as HRE sequences, a minimal CMV promoter and a polyadenylation signal, using an overlap extension PCR reaction. The obtained elements will be used for further research work on the systems of regulated overexpression and silencing of heme oxygenase 1 in cardiac progenitor cells.