Zastosowanie metody suchej kropli krwi (DBS) w analizie toksykologicznej

Toksykologia to nauka zajmująca się wieloma zagadnieniami, w tym i identyfikacją oraz oznaczaniem składników w określonym materiale biologicznym. Mogą nim być tak krew czy mocz, ale także tkanki, włosy, a nawet paznokcie, przy czym to krew jest najczęściej wykorzystywana do badań toksykologicznych na obecność leków psychotropowych. Dla poszczególnych rodzajów próbek materiału biologicznego stonowane są inne metody ich przygotowania. Jedną z alternatywnych metod przygotowywania próbek krwi do oznaczania leków psychotropowych jest metoda suchej kropli krwi (DBS). Zgodnie z nią mała objętość badanej próbki krwi nanoszona jest na specjalną kartę DBS, a następnie karta ta pozostawiana jest do wyschnięcie, by ostatecznie poddać ją ekstrakcji w celu wyodrębnienia badanych analitów. Oznaczanie leków psychotropowych we krwi, w tym benzodiazepin najczęściej znajduje zastosowanie w chemii sądowej. Celem przedmiotowej pracy było opracowanie metody przygotowania próbki krwi z wykorzystaniem techniki DBS do oznaczania alprazolamu i diazepamu, przy czym do badań wykorzystywano także krew wolną od oznaczanych analitów, jak i krew sekcyjną. W trakcie badań krew nanoszona była na specjalną kartę FTA DMPK C, a z której po wysuszeniu wycinano 3-mm dyski za pomocą specjalnego narzędzia - punchera. Ekstrakcję wspomaganą ultradźwiękami przeprowadzono przy użyciu mieszaniny metanol/acetonitryl (1:1, v/v), natomiast supernatant filtrowany był przy użyciu filtrów PTFE o średnicy porów równej 45 µm, po czym odparowany pod azotem w temperaturze 40℃. Przygotowane próbki analizowane były przy użyciu aparatury LC-MS, gdzie fazę ruchomą stanowił 0,1% kwas mrówkowy oraz acetonitryl. W ramach przeprowadzonych badań opracowana została procedura ilościowego oznaczenia diazepamu oraz alprazolamu przy użyciu metody DBS. W celu potwierdzenia jej poprawności oraz rzetelności przeprowadzono walidację, w ramach której określono takie parametry walidacyjne jak: zakres liniowości (R2 > 0.999 dla alprazolamu, R2 > 0.993 dla diazepamu w zakresie stężeń 4,3 — 38,3 ng/mL), granicę wykrywalności (LOD: 1,08 ng/mL dla alprazolamu, 0,61 ng/mL dla diazepamu), granicę oznaczalności (LOQ: 3,59 ng/mL dla alprazolamu, 2,03 ng/mL dla diazepamu), precyzję na trzech poziomach stężeń w ciągu jednego dnia (współczynnik zmienności CV%: 4.73 — 14.22% dla alprazolamu, 3.13 — 7.16% dla diazepamu) i pomiędzy dniami (współczynnik zmienności CV%: 5.04 — 17.37% dla alprazolamu, 3.58 — 19.99% dla diazepamu) oraz odzysk (90.63 — 108.5% dla alprazolamu, 94.89 — 103.44% dla diazepamu). Stężenie diazepamu we krwi sekcyjnej wyniosło 53,0 ng/mL (błąd względny wyniósł ±5.7%). Otrzymane wartości parametrów walidacyjnych są satysfakcjonujące dla tej metody, co umożliwia jej wykorzystanie do badań ilościowych na zawartość alprazolamu oraz diazepamu we krwi. Podkreślenia wymaga, iż wykorzystana do analizy ilościowej metoda sprzężona z chromatografią cieczową i spektrometrem mas wymaga niewielkich objętości próbek (mniej niż 50µL), a co istotne jest stosunkowo krótka i prosta oraz pozwala na jej wykorzystanie zarówno w chemii sądowej jak i szeroko rozumianej toksykologii.[1] Analytical toxicology Hans H.; Molecular, Clinical, and Environmental Toxicology Andreas Luch, 2010, Volume 2: Clinical Toxicology, 317–337;[2] Analysis of benzodiazepines and their metabolites using DBS cards and LC-MS/MS Heesang Lee, Yujin Park, Jiyeong Jo, Sangwhan In, Yonghoon Park, Eunmi Kim, Jaesung Pyo, Sanggil Choe, 2015;

Analytical toxicology deals with various problems like screening, confirmation, identification and quantification of foreign compounds in different biological matrices. These matrices are blood, urine, and tissues, or alternative matrices like hair or nails. Blood is the sample of choice for quantification analysis of xenobiotics because the analyte concentration in blood correlates best with its biological effects [1]. For the samples, various methods of preparation are used. One of them is the Dried Blood Spot (DBS) method which is a form of bio-sampling where small amounts of blood are blotted on the special cards, dried and then extraction takes place. Screening drugs like benzodiazepines in blood are often used in forensic chemistry [2]. For analysis, blood without subjected substances and the postmortem blood were used. Blood was spotted on the FTA DMPK C cards, then dried and 3-mm discs were punched. Extraction was carried out with a mixture of methanol/acetonitrile (1:1, v/v) and aided by ultra-sonification bath. After extraction, the supernatant was filtered through PTFE filter with pores size 0.45 µm and then solutions were evaporated under nitrogen in 40℃. The samples were analyzed using LC-MS, where the mobile phase was 0.1% formic acid and acetonitrile. The methodology for quantitive analysis of diazepam and alprazolam using the DBS method was carried out. To confirm the reliability of used DBS method the validation took place. Validation parameters are: linearity (R2 > 0.999 for alprazolam, R2 > 0.993 for diazepam in range of 4.3 — 38.3 ng/mL), limit of detection (LOD: 1.08 ng/mL for alprazolam, 0.61 ng/mL for diazepam), limit of quantification (LOQ: 3.59 ng/mL for alprazolam, 2.03 ng/mL for diazepam), precision for three levels of concentrations during one day (the coefficient of variation CV%: 4.73 — 14.22% for alprazolam, 3.13 — 7.16% for diazepam) and among days (the coefficient of variation CV%: 5.04 — 17.37% for alprazolam, 3.58 — 19.99% for diazepam) and recovery (90.63 — 108.5% for alprazolam, 94.89 — 103.44% for diazepam). Diazepam concentration in postmortem blood was 53.0 ng/mL (bias, relative error RE%: ±5.7%). Validation parameters for this method are satisfying. Used DBS method coupled with LC/MS for quantitative analysis of alprazolam and diazepam in blood needs small volumes of samples (less than 50µL), is short, and simple, so may be perfectly used in forensic chemistry and toxicology.[1] Analytical toxicology Hans H.; Molecular, Clinical, and Environmental Toxicology Andreas Luch, 2010, Volume 2: Clinical Toxicology, 317–337;[2] Analysis of benzodiazepines and their metabolites using DBS cards and LC-MS/MS Heesang Lee, Yujin Park, Jiyeong Jo, Sangwhan In, Yonghoon Park, Eunmi Kim, Jaesung Pyo, Sanggil Choe, 2015;