Attempts to increase the accumulation of selected secondary metabolites in Centella asiatica (L.) Urban in vitro cultures.

Celem niniejszej pracy była próba zwiększenia akumulacji kwasów fenolowych, flawonoidów i azjatykozydu w wytrząsanych kulturach pędowych Centella asiatica (L.) Urban., poprzez zastosowanie elicytorów (jasmonianu metylu i etefonu) oraz prekursora (L-fenyloalaniny). Wytrząsana hodowla pędowa prowadzona była w kolbach stożkowych, przez dwa tygodnie na pożywce Murashige’a i Skoog z dodatkiem regulatorów wzrostu: BAP-1mg/l, NAA-0,5mg/l oraz GA3-0,25mg/l. Następnie dodano świeżą pożywkę i po siedmiu dniach hodowlę podzielono na 8 grup. Do każdej z grup dodawano różne kombinacje następujących związków: L-fenyloalaniny (2,4g/l), jasmonianu metylu (50µM) oraz etefonu (50µM). Biomasę z wytrząsanych kultur pędowych zebrano po 2 i po 6 dniu od momentu tej modyfikacji. Uzyskany surowiec roślinny został zważony i wysuszony. Wykonano ilościową i jakościową analizę HPLC kwasów fenolowych i flawonoidów w metanolowych wyciągach, przed i po hydrolizie kwaśnej. Przeprowadzono również analizę ilościową LC/MS azjatykozydu. Stwierdzono obecność 9 kwasów fenolowych, w tym 3 pochodnych kwasu benzoesowego, 3 pochodnych kwasu cynamonowego, 3 depsydów; wykazano także obecność kwasu cynamonowego i azjatykozydu oraz 5 flawonoidów, w tym 3 aglikonów i 2 glikozydów. W wyciągach po hydrolizie dodatkowo występowały kolejne 2 pochodne kwasu benzoesowego, 2 pochodne kwasu cynamonowego oraz luteolina. Zastosowanie prekursora i/lub elicytorów wpływa bardzo korzystnie na akumulację metabolitów wtórnych w kulturach in vitro. Maksymalna zawartość wolnych kwasów fenolowych, flawonoidów i azjatykozydu zwiększyła się odpowiednio 3,2, 1,8, i 3,5-krotnie w porównaniu z hodowlą kontrolną. Kultury pędowe Centella asiatica mogą stanowić potencjalne, biotechnologiczne źródło tych związków, alternatywne w stosunku do roślin gruntowych.

The aim of this study was to increase the accumulation of phenolic acids, flavonoids and asiaticoside in agitated shoot cultures of Centella asiatica (L.) Urban, through the use of the elicitors (methyl jasmonate and ethephon) and the precursor (L-phenylalanine). The agitated shoot culture was maintained in conical flasks for two weeks in the standard Murashige and Skoog medium supplemented with growth regulators: BAP-1mg/l, NAA-0,5mg/l and GA3-0,25mg/l. Then new portions of the medium were added and after seven days cultures were divided into eight groups. Each group was supplemented with various combinations of the following compounds: L-phenylalanine (2,4g/l), methyl jasmonate (50µM) and ethephon (50µM). The biomass was collected from the agitated cultures after two and six day from the moment of this modification. The resulting plant material was weighed and dried. The qualitative and the quantitative HPLC analysis of phenolic acids and flavonoids in methanol extracts was conducted before and after acid hydrolysis. The LC/MS quantitative analysis of asiaticoside was also done. The presence of nine phenolic acids (including three benzoic acid derivatives, three cinnamic acid derivatives, three depsides), cinnamic acid, asiaticoside and five flavonoids (including three aglycones and two glycosides) has been demonstrated. In addition, extracts after hydrolysis contained further two benzoic acid derivatives, two cinnamic acid derivatives and luteolin. The use of the precursor and/or elicitors has a very positive influence on the accumulation of secondary metabolites in in vitro cultures. The maximum content of free phenolic acids, flavonoids and asiaticoside increased 3,2, 1,8, and 3,5-fold (respectively) compared to the control culture. The agitated shoot cultures of Centella asiatica could be a potential biotechnological source of these compounds, alternative to the ground plants.