Deriving a 3D model to test innovative anti-PD-L1 immunotherapies

master
dc.abstract.enCancer as a leading cause of death worldwide is a potential target for developing new treatment possibilities. Due to that, immunotherapy as a treatment whose basics are activation or suppressing the immune system which can cause the ability to challenge a specific disease is a promising way of treating cancer. Moreover, the discovery of immune checkpoint therapy, especially therapy targeted based on inhibition of binding PD-1/PD-L1 proteins, leads to drug development such as monoclonal antibodies or small-molecule inhibitors. The direction of the discovery influenced the implementation of a model for drug testing. However, the observed limitation of 2D cell culture models lead to the development of 3D cell culture models which could be a bridge between 2D cell culture and in vivo testing. It could replace and reduce the number of used animals in in vivo studies regarding 3R’s principle. The aim of the research was to derive a 3D research model for testing innovative anti-PD-L1 immunotherapies. Human colorectal cancer cell line, RKO characterized by a high expression of PD-L1 were chosen for the research model, with additional clones 9 and 34, which additionally also showed high expression The aim of the research was to derive a 3D research model for testing innovative anti-PD-L1 immunotherapies. Human colorectal cancer cell line, RKO characterized with high expression of a PD-L1 were chosen for the research model with additional clones 9 and 34, which additionally also showed high expression of CD28 protein (necessary for T cell activation). Then a basic approach was to establish the type of technic for a 3D cell culture. For that purpose during the research, various 3D cell culture technics were tested to select the most appropriate one. It included cell culture using low attachment plates, cell culture with the addition of collagen and, cell culture in/on hydrogels (Matrigel®, LifeGel®). After analysis of the properties and behaviours of the used materials and by microscopic observation of the 3D structure's growth and culture in these conditions, it was decided to develop a 3D model with the usage of LifeGel hydrogel as a basement. In further steps, aspects of optimal seeding cell density, hydrogel preparation prior to experiments or additional reagents for cell culture, were determined. Finally, optimal conditions for in vitro drug testing were prepared and by using CellTiter-Blue® Cell Viability Assay, the IC50 value was estimated for anticancer drugs (doxorubicin, oxaliplatin, paclitaxel) making it possible to compare values from the 2D and 3D cell model. The possibility of staining cells on a hydrogel was also demonstrated in order to assess the influence of the drugs used on the viability of individuals. An additional aspect of the research, to prepare for further optimization of the anti-PD-L1 drug testing model was to investigate the behavior of donor immune cells (peripheral blood mononuclear cells, PBMCs) in the presence of 3D tumour cell structures by co-culture. As a final result, a 3D cell model for drug testing was obtained with a comparison of anti-cancer drug's effectiveness in 2D and 3D models. Furthermore, flow cytometry analysis confirmed that cells from 3D cell culture can be appropriately used for further analysis by hydrogel digestion due to the confirmed no effect on the present PD-L1 protein. An interesting result of the research is a photograph from a confocal microscope with the arrangement of PBMCs on the 3D cancer cell structure. During the course of the research, difficulties were encountered, such as the long duration of the research. In addition, the results from confocal microscopy show that the obtained 3D structures do not fully resemble spherical structures, but have more umbrella-like shapes. This may result from inaccurate penetration of dyes into the structure. Therefore, further research and optimization of the model are required to implement it for testing potential anti-PD-L1 drugs.pl
dc.abstract.plChoroby nowotworowe, stanowiące główną przyczynę zgonów na świecie są potencjalnym celem rozwoju nowych możliwości leczenia. W związku z tym immunoterapia jako leczenie, którego podstawą jest aktywacja lub tłumienie układu odpornościowego, co może spowodować zdolność do przeciwstawienia się konkretnej chorobie, jest obiecującym sposobem leczenia nowotworów. Odkrycie terapii immunologicznych punktów kontrolnych, zwłaszcza terapii ukierunkowanej na hamowanie wiązania białek PD-1/PD-L1, doprowadziło do opracowania leków, takich jak przeciwciała monoklonalne czy inhibitory małocząsteczkowe. Taki oto kierunek odkrycia wpłynął na wdrożenie wielu modeli do testowania wskazanych leków. Jednak obserwowane ograniczenia modeli hodowli komórek 2D prowadzą do opracowania modeli hodowli komórek 3D, które mogą być pomostem między hodowlą komórek 2D a testowaniem leków in vivo. Może to również w przyszłości zastąpić i zmniejszyć liczbę zwierząt wykorzystywanych w badaniach in vivo. Celem badań było opracowanie modelu badawczego 3D do testowania innowacyjnych immunoterapii anty-PD-L1. Do modelu badawczego wybrano ludzką linię komórkową raka jelita grubego, RKO charakteryzującą się wysoką ekspresją białka PD-L1 oraz dodatkowe klony 9 i 34, które wykazują dodatkowo również wysoką ekspresję białka TCR-aktywatora (niezbędnego do aktywacji limfocytów T). Podstawowym podejściem było również ustalenie rodzaju techniki dla hodowli komórek 3D. W tym celu podczas badań przetestowano różne techniki hodowli komórek 3D, aby wybrać najbardziej odpowiednią. Przeprowadzono hodowlę komórkową na płytkach o niskim przyleganiu, hodowlę komórkową z dodatkiem kolagenu oraz hodowlę komórkową z wykorzystaniem hydrożeli (Matrigel®, LifeGel®). Po analizie właściwości użytych materiałów oraz obserwacji mikroskopowej wzrostu i hodowli struktur 3D w danych warunkach, zdecydowano się na opracowanie modelu 3D z wykorzystaniem hydrożelu LifeGel®, jako podłoża. W dalszych etapach określono optymalną gęstość wysiewu komórek, przygotowania hydrożelu i zastosowania dodatkowych odczynników. Ostatecznie przygotowano optymalne warunki do testowania leków a za pomocą testu CellTiter-Blue® Cell Viability Assay oszacowano wartość IC50 dla leków przeciwnowotworowych (doksorubicyna, oksaliplatyna, paklitaksel), umożliwiając porównanie wartości z modelu komórkowego 2D i 3D. Przedstawiono również możliwość barwienia komórek na hydrożelu. Dodatkowym aspektem badań, przygotowującym do dalszej optymalizacji modelu testowania leków anty-PD-L1, było zbadanie zachowania komórek odpornościowych dawcy (jednojądrzastych komórek krwi obwodowej, PBMC) w obecności trójwymiarowych struktur komórek nowotworowych, poprzez ko- kulturę. W efekcie końcowym uzyskano model komórki 3D do testowania leków z porównaniem skuteczności leków przeciwnowotworowych w modelach 2D i 3D. Ponadto analiza cytometrii przepływowej potwierdziła, że komórki z hodowli komórkowej 3D mogą być odpowiednio użyte do dalszej analizy po trawieniu hydrożelu, ze względu na potwierdzony brak wpływu odczynnika na obecne białko PD-L1. Ciekawym wynikiem badań jest zdjęcie z mikroskopu konfokalnego z rozmieszczeniem PBMC na strukturze 3D komórek nowotworowych. W trakcie badań napotkano trudności, m.in. długi czas trwania badań i kultury komórkowych w warunkach 3D. Ponadto, wyniki mikroskopii konfokalnej pokazują, że otrzymane struktury 3D nie przypominają w pełni struktur sferycznych, mają bardziej parasolowaty kształt. Prawdopodobnie może to wynikać m.in. z niedokładnego wnikania barwników w strukturę. W związku z tym, konieczne są dalsze badania i optymalizacja modelu w celu wdrożenia go do testowania potencjalnych leków anty-PD-L1.pl
dc.affiliationWydział Chemiipl
dc.areaobszar nauk ścisłychpl
dc.contributor.advisorSkalniak, Łukaszpl
dc.contributor.authorGurgul, Iwonapl
dc.contributor.departmentbycodeUJK/WC3pl
dc.contributor.reviewerSkalniak, Łukaszpl
dc.contributor.reviewerSzczubiałka, Krzysztof - 132218 pl
dc.date.accessioned2022-10-10T21:36:45Z
dc.date.available2022-10-10T21:36:45Z
dc.date.submitted2022-10-07pl
dc.fieldofstudychemia medycznapl
dc.identifier.apddiploma-156220-252842pl
dc.identifier.urihttps://ruj.uj.edu.pl/xmlui/handle/item/301262
dc.languageengpl
dc.subject.en2D cell culture; 3D cell culture; in vitro drug testing; immune checkpoint inhibitors; PD-1/PD-L1pl
dc.subject.plKultura komórkowa 2D; Kultura komórkowa 3D; testowanie leków in vitro; inhibitory immunologicznych punktów kontrolnych; PD-1/PD-L1pl
dc.titleDeriving a 3D model to test innovative anti-PD-L1 immunotherapiespl
dc.title.alternativeWyprowadzanie modelu 3D na potrzebę testowania innowacyjnych immunoterapii anty-PD-L1pl
dc.typemasterpl
dspace.entity.typePublication
dc.abstract.enpl
Cancer as a leading cause of death worldwide is a potential target for developing new treatment possibilities. Due to that, immunotherapy as a treatment whose basics are activation or suppressing the immune system which can cause the ability to challenge a specific disease is a promising way of treating cancer. Moreover, the discovery of immune checkpoint therapy, especially therapy targeted based on inhibition of binding PD-1/PD-L1 proteins, leads to drug development such as monoclonal antibodies or small-molecule inhibitors. The direction of the discovery influenced the implementation of a model for drug testing. However, the observed limitation of 2D cell culture models lead to the development of 3D cell culture models which could be a bridge between 2D cell culture and in vivo testing. It could replace and reduce the number of used animals in in vivo studies regarding 3R’s principle. The aim of the research was to derive a 3D research model for testing innovative anti-PD-L1 immunotherapies. Human colorectal cancer cell line, RKO characterized by a high expression of PD-L1 were chosen for the research model, with additional clones 9 and 34, which additionally also showed high expression The aim of the research was to derive a 3D research model for testing innovative anti-PD-L1 immunotherapies. Human colorectal cancer cell line, RKO characterized with high expression of a PD-L1 were chosen for the research model with additional clones 9 and 34, which additionally also showed high expression of CD28 protein (necessary for T cell activation). Then a basic approach was to establish the type of technic for a 3D cell culture. For that purpose during the research, various 3D cell culture technics were tested to select the most appropriate one. It included cell culture using low attachment plates, cell culture with the addition of collagen and, cell culture in/on hydrogels (Matrigel®, LifeGel®). After analysis of the properties and behaviours of the used materials and by microscopic observation of the 3D structure's growth and culture in these conditions, it was decided to develop a 3D model with the usage of LifeGel hydrogel as a basement. In further steps, aspects of optimal seeding cell density, hydrogel preparation prior to experiments or additional reagents for cell culture, were determined. Finally, optimal conditions for in vitro drug testing were prepared and by using CellTiter-Blue® Cell Viability Assay, the IC50 value was estimated for anticancer drugs (doxorubicin, oxaliplatin, paclitaxel) making it possible to compare values from the 2D and 3D cell model. The possibility of staining cells on a hydrogel was also demonstrated in order to assess the influence of the drugs used on the viability of individuals. An additional aspect of the research, to prepare for further optimization of the anti-PD-L1 drug testing model was to investigate the behavior of donor immune cells (peripheral blood mononuclear cells, PBMCs) in the presence of 3D tumour cell structures by co-culture. As a final result, a 3D cell model for drug testing was obtained with a comparison of anti-cancer drug's effectiveness in 2D and 3D models. Furthermore, flow cytometry analysis confirmed that cells from 3D cell culture can be appropriately used for further analysis by hydrogel digestion due to the confirmed no effect on the present PD-L1 protein. An interesting result of the research is a photograph from a confocal microscope with the arrangement of PBMCs on the 3D cancer cell structure. During the course of the research, difficulties were encountered, such as the long duration of the research. In addition, the results from confocal microscopy show that the obtained 3D structures do not fully resemble spherical structures, but have more umbrella-like shapes. This may result from inaccurate penetration of dyes into the structure. Therefore, further research and optimization of the model are required to implement it for testing potential anti-PD-L1 drugs.
dc.abstract.plpl
Choroby nowotworowe, stanowiące główną przyczynę zgonów na świecie są potencjalnym celem rozwoju nowych możliwości leczenia. W związku z tym immunoterapia jako leczenie, którego podstawą jest aktywacja lub tłumienie układu odpornościowego, co może spowodować zdolność do przeciwstawienia się konkretnej chorobie, jest obiecującym sposobem leczenia nowotworów. Odkrycie terapii immunologicznych punktów kontrolnych, zwłaszcza terapii ukierunkowanej na hamowanie wiązania białek PD-1/PD-L1, doprowadziło do opracowania leków, takich jak przeciwciała monoklonalne czy inhibitory małocząsteczkowe. Taki oto kierunek odkrycia wpłynął na wdrożenie wielu modeli do testowania wskazanych leków. Jednak obserwowane ograniczenia modeli hodowli komórek 2D prowadzą do opracowania modeli hodowli komórek 3D, które mogą być pomostem między hodowlą komórek 2D a testowaniem leków in vivo. Może to również w przyszłości zastąpić i zmniejszyć liczbę zwierząt wykorzystywanych w badaniach in vivo. Celem badań było opracowanie modelu badawczego 3D do testowania innowacyjnych immunoterapii anty-PD-L1. Do modelu badawczego wybrano ludzką linię komórkową raka jelita grubego, RKO charakteryzującą się wysoką ekspresją białka PD-L1 oraz dodatkowe klony 9 i 34, które wykazują dodatkowo również wysoką ekspresję białka TCR-aktywatora (niezbędnego do aktywacji limfocytów T). Podstawowym podejściem było również ustalenie rodzaju techniki dla hodowli komórek 3D. W tym celu podczas badań przetestowano różne techniki hodowli komórek 3D, aby wybrać najbardziej odpowiednią. Przeprowadzono hodowlę komórkową na płytkach o niskim przyleganiu, hodowlę komórkową z dodatkiem kolagenu oraz hodowlę komórkową z wykorzystaniem hydrożeli (Matrigel®, LifeGel®). Po analizie właściwości użytych materiałów oraz obserwacji mikroskopowej wzrostu i hodowli struktur 3D w danych warunkach, zdecydowano się na opracowanie modelu 3D z wykorzystaniem hydrożelu LifeGel®, jako podłoża. W dalszych etapach określono optymalną gęstość wysiewu komórek, przygotowania hydrożelu i zastosowania dodatkowych odczynników. Ostatecznie przygotowano optymalne warunki do testowania leków a za pomocą testu CellTiter-Blue® Cell Viability Assay oszacowano wartość IC50 dla leków przeciwnowotworowych (doksorubicyna, oksaliplatyna, paklitaksel), umożliwiając porównanie wartości z modelu komórkowego 2D i 3D. Przedstawiono również możliwość barwienia komórek na hydrożelu. Dodatkowym aspektem badań, przygotowującym do dalszej optymalizacji modelu testowania leków anty-PD-L1, było zbadanie zachowania komórek odpornościowych dawcy (jednojądrzastych komórek krwi obwodowej, PBMC) w obecności trójwymiarowych struktur komórek nowotworowych, poprzez ko- kulturę. W efekcie końcowym uzyskano model komórki 3D do testowania leków z porównaniem skuteczności leków przeciwnowotworowych w modelach 2D i 3D. Ponadto analiza cytometrii przepływowej potwierdziła, że komórki z hodowli komórkowej 3D mogą być odpowiednio użyte do dalszej analizy po trawieniu hydrożelu, ze względu na potwierdzony brak wpływu odczynnika na obecne białko PD-L1. Ciekawym wynikiem badań jest zdjęcie z mikroskopu konfokalnego z rozmieszczeniem PBMC na strukturze 3D komórek nowotworowych. W trakcie badań napotkano trudności, m.in. długi czas trwania badań i kultury komórkowych w warunkach 3D. Ponadto, wyniki mikroskopii konfokalnej pokazują, że otrzymane struktury 3D nie przypominają w pełni struktur sferycznych, mają bardziej parasolowaty kształt. Prawdopodobnie może to wynikać m.in. z niedokładnego wnikania barwników w strukturę. W związku z tym, konieczne są dalsze badania i optymalizacja modelu w celu wdrożenia go do testowania potencjalnych leków anty-PD-L1.
dc.affiliationpl
Wydział Chemii
dc.areapl
obszar nauk ścisłych
dc.contributor.advisorpl
Skalniak, Łukasz
dc.contributor.authorpl
Gurgul, Iwona
dc.contributor.departmentbycodepl
UJK/WC3
dc.contributor.reviewerpl
Skalniak, Łukasz
dc.contributor.reviewerpl
Szczubiałka, Krzysztof - 132218
dc.date.accessioned
2022-10-10T21:36:45Z
dc.date.available
2022-10-10T21:36:45Z
dc.date.submittedpl
2022-10-07
dc.fieldofstudypl
chemia medyczna
dc.identifier.apdpl
diploma-156220-252842
dc.identifier.uri
https://ruj.uj.edu.pl/xmlui/handle/item/301262
dc.languagepl
eng
dc.subject.enpl
2D cell culture; 3D cell culture; in vitro drug testing; immune checkpoint inhibitors; PD-1/PD-L1
dc.subject.plpl
Kultura komórkowa 2D; Kultura komórkowa 3D; testowanie leków in vitro; inhibitory immunologicznych punktów kontrolnych; PD-1/PD-L1
dc.titlepl
Deriving a 3D model to test innovative anti-PD-L1 immunotherapies
dc.title.alternativepl
Wyprowadzanie modelu 3D na potrzebę testowania innowacyjnych immunoterapii anty-PD-L1
dc.typepl
master
dspace.entity.type
Publication
Affiliations

* The migration of download and view statistics prior to the date of April 8, 2024 is in progress.

Views
7
Views per month
Views per city
Krakow
4

No access

No Thumbnail Available
Collections