Identyfikacja kluczowych etapów pobierania lipopleksów opartych na pochodnych poliizoprenoidów przez komórki eukariotyczne

master
dc.abstract.enIn the era of rapid development of molecular biology and medicine, high hopes are associated with the use of gene therapy and DNA vaccines in the treatment and prevention of various diseases. Importantly, therapeutic approaches should not only be effective, but also safe. Therefore, the safety of using viral vectors as methods of introducing nucleic acids into cells is questioned. A safer alternative may be cationic lipids. However they are not as efficient in in vivo conditions.Lipofection process involves many stages. Each of them can be limiting and depends on the composition of the lipofection mixture, cell type and external conditions. There is a number of ways to study mechanisms of lipoplex association and internalization. Growing knowledge in this area helps to improve compositions of lipofecting reagents. The aim of this study was to identify crucial cellular uptake stages and barriers of polyprenyl-based lipoplexes internalization in eukaryotic cells. Mixture of cationic polyisoprenoid derivatives with different chain lengths - 6, 7, 8 isoprene residues (PTAI mix 7) and DOPE (1,2-dioleyl-sn-glycero-3-phosphatidyl ethanolamine) were used in experiments. Two types of fluorescent DNA dyes (stable and unstable at low pH values) were utilized in order to track the kinetics of association and internalization by flow cytometry in 4 cell lines differing in lipofection susceptibility. Experiments were performed in serum and serum free conditions.Based on the obtained results, it can be concluded that association and internalization of lipoplexes based on PTAI mix 7 and DOPE occurs very quickly, also in cell lines with low susceptibility to lipofection. However, addition of serum causes delay and reduction of these processes. In addition, for the AT 2 cell line it can be concluded that problem of not obtaining good lipofection efficiency may involve blocked dissociation of DNA from lipids or expression itself, rather than cellular uptake. Another interesting observation is that association of lipoplexes with cell membrane of XC cells is lower than that of MatLyLu, yet the XC line shows very good transfection efficiency compared to low susceptibility of MatLyLu. No correlation between serum presence and association and internalization efficiency was observed for XC and MatLyLu cells. In conclusion, lipoplexes association and uptake are highly dependent on the type of cells. Obtained results help to understand how serum and cell type affect the efficiency of lipofection process and can result in the improvement of lipofection reagents formulations and use.pl
dc.abstract.plW erze szybkiego rozwoju biologii molekularnej i medycyny duże nadzieje wiąże się z wykorzystaniem terapii genowych i szczepionek DNA do leczenia i zapobiegania różnym chorobom. Aby było to możliwe, podejścia terapeutyczne muszą być nie tylko skuteczne, ale i bezpieczne. Dlatego poddaje się pod dyskusję bezpieczeństwo wykorzystywania wektorów wirusowych jako metod wprowadzania kwasów nukleinowych do komórek. Bezpieczniejszą alternatywą mogą być lipidy kationowe, które jednak nie są tak wydajne w warunkach in vivo.Proces lipofekcji jest złożony z wielu etapów, w którym każdy może okazać się limitujący, a jego wydajność zależy od składu mieszaniny lipofekcyjnej, typu komórek i warunków zewnętrznych. Istnieje szereg sposobów na badanie mechanizmów asocjacji i internalizacji, których poznanie pomaga w ulepszeniu formuł odczynników lipofekcyjnych.W pracy wykonano doświadczenia mające na celu identyfikacje kluczowych etapów i barier wnikania do komórek lipopleksów opartych na lipidach kationowych -jodkach tritrimetylopoliprenyloamoniowych. W badaniach stosowano mieszaninę kationowych pochodnych poliizoprenoidów o różnej długości łańcucha - 6, 7, 8 reszt izoprenowych (PTAI mix 7) oraz lipid pomocniczy DOPE (1,2-dioleilo-sn-glicero-3-fosfatydyloetanoloamina). Użyto DNA znakowanego 2 rodzajami znacznika fluorescencyjnego (stabilnym i niestabilnym w niskich wartościach pH), aby móc śledzić kinetykę asocjacji i internalizacji lipopleksów za pomocą cytometrii przepływowej w 4 liniach komórkowych różniących się podatnością na lipofekcję. Badania wykonywano w warunkach surowiczych i bezsurowiczych.Na podstawie otrzymanych wyników można stwierdzić, że asocjacja i internalizacja lipopleksów opartych na PTAI mix 7 + DOPE następuje bardzo szybko, również w liniach o niskiej podatności na lipofekcję. Natomiast dodatek surowicy powoduje opóźnienie i osłabienie tych procesów. Dodatkowo dla linii AT 2 można stwierdzić, że problem z uzyskaniem dobrej wydajności lipofekcji może dotyczyć etapów oddysocjowania DNA od lipidów lub samej ekspresji, a nie pobierania lipopleksów. Ciekawym spostrzeżeniem jest również to, że asocjacja z błoną komórkową linii XC jest niższa niż z błoną komórkową MatLyLu, a mimo to linia XC wykazuje bardzo dobrą wydajność transfekcji w porównaniu z niepodatną na ten proces linią MatLyLu. Nie zaobserwowano korelacji w przypadku wpływu surowicy na wydajność asocjacji i internalizacji dla komórek XC i MatLyLu. Podsumowując – asocjacja i internalizacja ściśle zależą od typu linii komórkowej. Przeprowadzone doświadczenia pomagają zrozumieć jak surowica i typ komórek wpływają na wydajność procesu lipofekcji, co może przełożyć się na udoskonalenie projektowania lipofektantów i procedur ich wykorzystania.pl
dc.affiliationWydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologiipl
dc.areaobszar nauk przyrodniczychpl
dc.contributor.advisorRak, Monikapl
dc.contributor.authorSzaro, Karolinapl
dc.contributor.departmentbycodeUJK/WBBBpl
dc.contributor.reviewerRak, Monikapl
dc.contributor.reviewerWiśniewska-Becker, Anna - 132653 pl
dc.date.accessioned2020-07-28T00:39:04Z
dc.date.available2020-07-28T00:39:04Z
dc.date.submitted2019-06-24pl
dc.fieldofstudybiotechnologia molekularnapl
dc.identifier.apddiploma-133420-192960pl
dc.identifier.projectAPD / Opl
dc.identifier.urihttps://ruj.uj.edu.pl/xmlui/handle/item/235730
dc.languagepolpl
dc.subject.enlipoplexes, cationic polyisoprenoid derivatives, lipofection, gene therapy, DNA vaccines, endocytosis, lipoplexes internalizationpl
dc.subject.pllipopleksy, kationowe pochodne poliprenowe, lipofekcja, terapia genowa, szczepionki DNA, endocytoza, internalizacja lipopleksówpl
dc.titleIdentyfikacja kluczowych etapów pobierania lipopleksów opartych na pochodnych poliizoprenoidów przez komórki eukariotycznepl
dc.title.alternativeIdentification of crucial cellular uptake stages of polyprenyl-based lipoplexes in eukaryotic cellspl
dc.typemasterpl
dspace.entity.typePublication
dc.abstract.enpl
In the era of rapid development of molecular biology and medicine, high hopes are associated with the use of gene therapy and DNA vaccines in the treatment and prevention of various diseases. Importantly, therapeutic approaches should not only be effective, but also safe. Therefore, the safety of using viral vectors as methods of introducing nucleic acids into cells is questioned. A safer alternative may be cationic lipids. However they are not as efficient in in vivo conditions.Lipofection process involves many stages. Each of them can be limiting and depends on the composition of the lipofection mixture, cell type and external conditions. There is a number of ways to study mechanisms of lipoplex association and internalization. Growing knowledge in this area helps to improve compositions of lipofecting reagents. The aim of this study was to identify crucial cellular uptake stages and barriers of polyprenyl-based lipoplexes internalization in eukaryotic cells. Mixture of cationic polyisoprenoid derivatives with different chain lengths - 6, 7, 8 isoprene residues (PTAI mix 7) and DOPE (1,2-dioleyl-sn-glycero-3-phosphatidyl ethanolamine) were used in experiments. Two types of fluorescent DNA dyes (stable and unstable at low pH values) were utilized in order to track the kinetics of association and internalization by flow cytometry in 4 cell lines differing in lipofection susceptibility. Experiments were performed in serum and serum free conditions.Based on the obtained results, it can be concluded that association and internalization of lipoplexes based on PTAI mix 7 and DOPE occurs very quickly, also in cell lines with low susceptibility to lipofection. However, addition of serum causes delay and reduction of these processes. In addition, for the AT 2 cell line it can be concluded that problem of not obtaining good lipofection efficiency may involve blocked dissociation of DNA from lipids or expression itself, rather than cellular uptake. Another interesting observation is that association of lipoplexes with cell membrane of XC cells is lower than that of MatLyLu, yet the XC line shows very good transfection efficiency compared to low susceptibility of MatLyLu. No correlation between serum presence and association and internalization efficiency was observed for XC and MatLyLu cells. In conclusion, lipoplexes association and uptake are highly dependent on the type of cells. Obtained results help to understand how serum and cell type affect the efficiency of lipofection process and can result in the improvement of lipofection reagents formulations and use.
dc.abstract.plpl
W erze szybkiego rozwoju biologii molekularnej i medycyny duże nadzieje wiąże się z wykorzystaniem terapii genowych i szczepionek DNA do leczenia i zapobiegania różnym chorobom. Aby było to możliwe, podejścia terapeutyczne muszą być nie tylko skuteczne, ale i bezpieczne. Dlatego poddaje się pod dyskusję bezpieczeństwo wykorzystywania wektorów wirusowych jako metod wprowadzania kwasów nukleinowych do komórek. Bezpieczniejszą alternatywą mogą być lipidy kationowe, które jednak nie są tak wydajne w warunkach in vivo.Proces lipofekcji jest złożony z wielu etapów, w którym każdy może okazać się limitujący, a jego wydajność zależy od składu mieszaniny lipofekcyjnej, typu komórek i warunków zewnętrznych. Istnieje szereg sposobów na badanie mechanizmów asocjacji i internalizacji, których poznanie pomaga w ulepszeniu formuł odczynników lipofekcyjnych.W pracy wykonano doświadczenia mające na celu identyfikacje kluczowych etapów i barier wnikania do komórek lipopleksów opartych na lipidach kationowych -jodkach tritrimetylopoliprenyloamoniowych. W badaniach stosowano mieszaninę kationowych pochodnych poliizoprenoidów o różnej długości łańcucha - 6, 7, 8 reszt izoprenowych (PTAI mix 7) oraz lipid pomocniczy DOPE (1,2-dioleilo-sn-glicero-3-fosfatydyloetanoloamina). Użyto DNA znakowanego 2 rodzajami znacznika fluorescencyjnego (stabilnym i niestabilnym w niskich wartościach pH), aby móc śledzić kinetykę asocjacji i internalizacji lipopleksów za pomocą cytometrii przepływowej w 4 liniach komórkowych różniących się podatnością na lipofekcję. Badania wykonywano w warunkach surowiczych i bezsurowiczych.Na podstawie otrzymanych wyników można stwierdzić, że asocjacja i internalizacja lipopleksów opartych na PTAI mix 7 + DOPE następuje bardzo szybko, również w liniach o niskiej podatności na lipofekcję. Natomiast dodatek surowicy powoduje opóźnienie i osłabienie tych procesów. Dodatkowo dla linii AT 2 można stwierdzić, że problem z uzyskaniem dobrej wydajności lipofekcji może dotyczyć etapów oddysocjowania DNA od lipidów lub samej ekspresji, a nie pobierania lipopleksów. Ciekawym spostrzeżeniem jest również to, że asocjacja z błoną komórkową linii XC jest niższa niż z błoną komórkową MatLyLu, a mimo to linia XC wykazuje bardzo dobrą wydajność transfekcji w porównaniu z niepodatną na ten proces linią MatLyLu. Nie zaobserwowano korelacji w przypadku wpływu surowicy na wydajność asocjacji i internalizacji dla komórek XC i MatLyLu. Podsumowując – asocjacja i internalizacja ściśle zależą od typu linii komórkowej. Przeprowadzone doświadczenia pomagają zrozumieć jak surowica i typ komórek wpływają na wydajność procesu lipofekcji, co może przełożyć się na udoskonalenie projektowania lipofektantów i procedur ich wykorzystania.
dc.affiliationpl
Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii
dc.areapl
obszar nauk przyrodniczych
dc.contributor.advisorpl
Rak, Monika
dc.contributor.authorpl
Szaro, Karolina
dc.contributor.departmentbycodepl
UJK/WBBB
dc.contributor.reviewerpl
Rak, Monika
dc.contributor.reviewerpl
Wiśniewska-Becker, Anna - 132653
dc.date.accessioned
2020-07-28T00:39:04Z
dc.date.available
2020-07-28T00:39:04Z
dc.date.submittedpl
2019-06-24
dc.fieldofstudypl
biotechnologia molekularna
dc.identifier.apdpl
diploma-133420-192960
dc.identifier.projectpl
APD / O
dc.identifier.uri
https://ruj.uj.edu.pl/xmlui/handle/item/235730
dc.languagepl
pol
dc.subject.enpl
lipoplexes, cationic polyisoprenoid derivatives, lipofection, gene therapy, DNA vaccines, endocytosis, lipoplexes internalization
dc.subject.plpl
lipopleksy, kationowe pochodne poliprenowe, lipofekcja, terapia genowa, szczepionki DNA, endocytoza, internalizacja lipopleksów
dc.titlepl
Identyfikacja kluczowych etapów pobierania lipopleksów opartych na pochodnych poliizoprenoidów przez komórki eukariotyczne
dc.title.alternativepl
Identification of crucial cellular uptake stages of polyprenyl-based lipoplexes in eukaryotic cells
dc.typepl
master
dspace.entity.type
Publication
Affiliations

* The migration of download and view statistics prior to the date of April 8, 2024 is in progress.

Views
10
Views per month
Views per city
Saint Gabriel
4
Wroclaw
2
Dublin
1
Shanghai
1

No access

No Thumbnail Available