Optymalizacja procesu różnicowania kardiomiocytów z kontrolnych i dystroficznych ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

master
dc.abstract.enDuchenne muscular dystrophy is an incurable X-linked disease, inherited recessively. It emerges as the result of a mutation in the DMD gene, which encodes dystrophin. This disorder is manifested by the progressive weakening of muscle tissue. The effects of a deficit of functional dystrophin in cardiomyocytes contribute to the development of cardiomyopathy, hence cardiovascular failure is the most common cause of death in DMD. Therefore, great emphasis is being put on the development and improvement of preclinical models to study disease development mechanisms and to test potential therapeutic substances. Commonly used models are cardiomyocytes differentiated from human pluripotent stem cells (hiPSC-CMs).This work focuses on the refinement and optimization of the differentiation process of hiPSC-CMs carrying a mutation in the DMD gene and their isogenic control line. Firstly, the used iPSCs lines were characterized. To transform them into cardiomyocytes, the GiWi protocol (based on small molecule inhibitors of the GSK3ß and Wnt pathway) and the PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit have been used. The hiPSC-CMs obtained by both methods have been characterized by analyzing specific cardiomyocyte markers at the mRNA and protein levels. Using fluorescence-activated flow cytometry, differentiation efficiency was determined by assessing the percentage of troponin T-expressing cells.The results have confirmed that the iPSCs lines were fully functional and expressed specific stem cell markers. In addition, the differentiation process based on the GiWi protocol has been successfully optimized, as the differentiation efficiency of hiPSC-CMs has been improved. When comparing the two techniques, no significant differences in the differentiation efficiency were found, but a higher level of expression of the TNNT2, MYL7, and SERCA2 genes has been demonstrated in dystrophic hiPSC-CMs obtained using a commercial kit. Nevertheless, the results are insufficient to unanimously indicate that the use of the PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit is a better strategy in the process of iPSCs differentiation into cardiomyocytes.pl
dc.abstract.plDystrofia mięśniowa Duchenne’a to nieuleczalna choroba sprzężona z chromosomem X, dziedziczona w sposób recesywny. Powstaje w wyniku mutacji w genie DMD kodującym dystrofinę i objawia się postępującym osłabieniem tkanki mięśniowej. Skutki braku funkcjonalnej dystrofiny w kardiomiocytach przyczyniają się do rozwoju kardiomiopatii, w konsekwencji czego, najczęstszą przyczyną zgonów u osób cierpiących na DMD jest niewydolność sercowo-naczyniowa. W związku z tym ogromny nacisk kładzie się na rozwój i ulepszenie modeli przedklinicznych służących badaniu mechanizmów rozwoju kardiomiopatii oraz testowaniu potencjalnych substancji leczniczych. Powszechnie wykorzystywanym do tego modelem są kardiomiocyty różnicowane z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC-CMs).W niniejszej pracy skupiono się na udoskonaleniu i optymalizacji procesu różnicowania hiPSC-CMs niosących mutację w genie DMD oraz ich izogenicznej linii kontrolnej. Dokonano charakterystyki wykorzystywanych linii iPSCs, a w celu otrzymania z nich kardiomiocytów, przeprowadzano różnicowania wg tzw. protokołu GiWi, bazującego na drobnocząsteczkowych inhibitorach szlaku Wnt i GSK3ß oraz wykorzystując zestaw komercyjny – PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit. hiPSC-CMs otrzymane obiema metodami scharakteryzowano analizując markery specyficzne dla kardiomiocytów na poziomie mRNA i białek. Stosując cytometrię przepływową określano procent komórek wykazujących ekspresję troponiny T, a tym samym wydajność różnicowań. Uzyskane wyniki potwierdziły, że linie iPSCs były w pełni funkcjonalne i wykazywały ekspresję markerów komórek macierzystych. Pomyślnie zoptymalizowano proces różnicowania wg protokołu GiWi zwiększając wydajność różnicowania hiPSC- CMs. Porównując obie techniki nie stwierdzono znaczących różnic w wydajności różnicowania, wykazano jednak wyższy poziom ekspresji genów TNNT2, MYL7 oraz SERCA2 w dystroficznych hiPSC-CMs otrzymanych przy wykorzystaniu zestawu komercyjnego. Wyniki te są jednak niewystarczające, aby jednogłośnie wskazać, iż wykorzystanie PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit jest trafniejszą strategią podczas procesu różnicowania kardiomiocytów.pl
dc.affiliationWydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologiipl
dc.contributor.advisorŁoboda, Agnieszka - 130081 pl
dc.contributor.authorKłaptocz, Monikapl
dc.contributor.departmentbycodeUJK/WBBBpl
dc.contributor.reviewerŁoboda, Agnieszka - 130081 pl
dc.contributor.reviewerBobis-Wozowicz, Sylwiapl
dc.date.accessioned2022-06-10T21:32:39Z
dc.date.available2022-06-10T21:32:39Z
dc.date.submitted2022-06-10pl
dc.fieldofstudybiotechnologia molekularnapl
dc.identifier.apddiploma-158905-287057pl
dc.identifier.urihttps://ruj.uj.edu.pl/xmlui/handle/item/292969
dc.languagepolpl
dc.subject.encardiomyocytes, cardiomyopathy, Duchenne muscular dystrophy, induced pluripotent stem cells, iPSCs, iPSC-CMspl
dc.subject.pldystrofia mięśniowa Duchenne’a, indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste, iPSCs, iPSC-CMs, kardiomiocyty, kardiomiopatiapl
dc.titleOptymalizacja procesu różnicowania kardiomiocytów z kontrolnych i dystroficznych ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystychpl
dc.title.alternativeOptimization of the process of differentiation into cardiomyocytes from control and dystrophic human induced pluripotent stem cellspl
dc.typemasterpl
dspace.entity.typePublication
dc.abstract.enpl
Duchenne muscular dystrophy is an incurable X-linked disease, inherited recessively. It emerges as the result of a mutation in the DMD gene, which encodes dystrophin. This disorder is manifested by the progressive weakening of muscle tissue. The effects of a deficit of functional dystrophin in cardiomyocytes contribute to the development of cardiomyopathy, hence cardiovascular failure is the most common cause of death in DMD. Therefore, great emphasis is being put on the development and improvement of preclinical models to study disease development mechanisms and to test potential therapeutic substances. Commonly used models are cardiomyocytes differentiated from human pluripotent stem cells (hiPSC-CMs).This work focuses on the refinement and optimization of the differentiation process of hiPSC-CMs carrying a mutation in the DMD gene and their isogenic control line. Firstly, the used iPSCs lines were characterized. To transform them into cardiomyocytes, the GiWi protocol (based on small molecule inhibitors of the GSK3ß and Wnt pathway) and the PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit have been used. The hiPSC-CMs obtained by both methods have been characterized by analyzing specific cardiomyocyte markers at the mRNA and protein levels. Using fluorescence-activated flow cytometry, differentiation efficiency was determined by assessing the percentage of troponin T-expressing cells.The results have confirmed that the iPSCs lines were fully functional and expressed specific stem cell markers. In addition, the differentiation process based on the GiWi protocol has been successfully optimized, as the differentiation efficiency of hiPSC-CMs has been improved. When comparing the two techniques, no significant differences in the differentiation efficiency were found, but a higher level of expression of the TNNT2, MYL7, and SERCA2 genes has been demonstrated in dystrophic hiPSC-CMs obtained using a commercial kit. Nevertheless, the results are insufficient to unanimously indicate that the use of the PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit is a better strategy in the process of iPSCs differentiation into cardiomyocytes.
dc.abstract.plpl
Dystrofia mięśniowa Duchenne’a to nieuleczalna choroba sprzężona z chromosomem X, dziedziczona w sposób recesywny. Powstaje w wyniku mutacji w genie DMD kodującym dystrofinę i objawia się postępującym osłabieniem tkanki mięśniowej. Skutki braku funkcjonalnej dystrofiny w kardiomiocytach przyczyniają się do rozwoju kardiomiopatii, w konsekwencji czego, najczęstszą przyczyną zgonów u osób cierpiących na DMD jest niewydolność sercowo-naczyniowa. W związku z tym ogromny nacisk kładzie się na rozwój i ulepszenie modeli przedklinicznych służących badaniu mechanizmów rozwoju kardiomiopatii oraz testowaniu potencjalnych substancji leczniczych. Powszechnie wykorzystywanym do tego modelem są kardiomiocyty różnicowane z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC-CMs).W niniejszej pracy skupiono się na udoskonaleniu i optymalizacji procesu różnicowania hiPSC-CMs niosących mutację w genie DMD oraz ich izogenicznej linii kontrolnej. Dokonano charakterystyki wykorzystywanych linii iPSCs, a w celu otrzymania z nich kardiomiocytów, przeprowadzano różnicowania wg tzw. protokołu GiWi, bazującego na drobnocząsteczkowych inhibitorach szlaku Wnt i GSK3ß oraz wykorzystując zestaw komercyjny – PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit. hiPSC-CMs otrzymane obiema metodami scharakteryzowano analizując markery specyficzne dla kardiomiocytów na poziomie mRNA i białek. Stosując cytometrię przepływową określano procent komórek wykazujących ekspresję troponiny T, a tym samym wydajność różnicowań. Uzyskane wyniki potwierdziły, że linie iPSCs były w pełni funkcjonalne i wykazywały ekspresję markerów komórek macierzystych. Pomyślnie zoptymalizowano proces różnicowania wg protokołu GiWi zwiększając wydajność różnicowania hiPSC- CMs. Porównując obie techniki nie stwierdzono znaczących różnic w wydajności różnicowania, wykazano jednak wyższy poziom ekspresji genów TNNT2, MYL7 oraz SERCA2 w dystroficznych hiPSC-CMs otrzymanych przy wykorzystaniu zestawu komercyjnego. Wyniki te są jednak niewystarczające, aby jednogłośnie wskazać, iż wykorzystanie PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit jest trafniejszą strategią podczas procesu różnicowania kardiomiocytów.
dc.affiliationpl
Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii
dc.contributor.advisorpl
Łoboda, Agnieszka - 130081
dc.contributor.authorpl
Kłaptocz, Monika
dc.contributor.departmentbycodepl
UJK/WBBB
dc.contributor.reviewerpl
Łoboda, Agnieszka - 130081
dc.contributor.reviewerpl
Bobis-Wozowicz, Sylwia
dc.date.accessioned
2022-06-10T21:32:39Z
dc.date.available
2022-06-10T21:32:39Z
dc.date.submittedpl
2022-06-10
dc.fieldofstudypl
biotechnologia molekularna
dc.identifier.apdpl
diploma-158905-287057
dc.identifier.uri
https://ruj.uj.edu.pl/xmlui/handle/item/292969
dc.languagepl
pol
dc.subject.enpl
cardiomyocytes, cardiomyopathy, Duchenne muscular dystrophy, induced pluripotent stem cells, iPSCs, iPSC-CMs
dc.subject.plpl
dystrofia mięśniowa Duchenne’a, indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste, iPSCs, iPSC-CMs, kardiomiocyty, kardiomiopatia
dc.titlepl
Optymalizacja procesu różnicowania kardiomiocytów z kontrolnych i dystroficznych ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych
dc.title.alternativepl
Optimization of the process of differentiation into cardiomyocytes from control and dystrophic human induced pluripotent stem cells
dc.typepl
master
dspace.entity.type
Publication
Affiliations

* The migration of download and view statistics prior to the date of April 8, 2024 is in progress.

Views
1
Views per month
Views per city
Warsaw
1

No access

No Thumbnail Available
Collections