Dopamine DRD2 receptor long isoform production in cell-free expression system

Receptor dopaminowy DRD2 należy do grupy receptorów błonowych GPCR (ang. G Protein-Coupled Receptor) sprzeżonych z heterotrimerycznymi białkami G. Są one odpowiedzialne za sygnalizację komórkową w centralnym układzie nerwowym.W niniejszej pracy przygotowano konstrukt genetyczny z sekwencją kodującą receptor dopaminowy DRD2 sprzężony z białkiem MBP (ang. Maltose Binding Protein). Białko MBP ma potencjalnie zwiększyć rozpuszczalność receptora oraz ułatwić jego proces fałdowania do prawidłowej, natywnej konformacji przestrzennej. Syntezę białka prowadzono z zastosowaniem bezkomórkowego systemu ekspresji opartym na bakteryjnym ekstrakcie z E. coli. Ekspresję prowadzono w środowisku hydrofobowym w obecności detergentu Brij 35 i chemibursztynianu cholesterolu. W kolejnym etapie receptor oczyszczano za pomocą chromatografii metalopowinowactwa.

Dopamine DRD2 receptor belongs to the class of membrane receptors coupled with heterotrimeric G proteins. These receptors are responsible for cell signaling in the central nervous system. In this bachelor thesis genetic construct consisting of nucleotide sequence of dopamine DRD2 receptor coupled with maltose binding protein MBP was prepared. The MBP should improve the solubility of the receptor and moreover help to adopt its proper, native conformation.Protein synthesis was performed in cell-free expression system using bacterial extract from E. coli. The expression was carried out in a hydrophobic environment in presence of Brij 35 detergent and cholesteryl hemisurccinate. In the next step the receptor was purified by affinity chromatography.