The use of recombinant proteins in anticancer-drugs screening.

Kontrola białek w komórkach organizmów eukariotycznych odbywa się głównie poprzez szlak ubikwityna-proteasom. Uszkodzone i zbędne białka są naznaczane poprzez przyłączenie cząsteczek ubikwityny, a następnie rozpoznawane i degradowane przez proteasom. Enzymy, które katalizują cięcie wiązań pomiędzy ubikwityną a białkowym substratem określane są enzymami deubikwitynującymi (DUB). Nadekspresja białek z rodziny DUB została zaobserwowana w licznych typach komórek nowotworowych. Zwiększona aktywność tych enzymów jest przyczyną zalegania w komórce nieprawidłowych białek przeznaczonych do zniszczenia. Z tego powodu poszukuje się cząsteczek zdolnych do hamowania aktywności enzymów deubiwkitynujących w celu opracowania skutecznej terapii antynowotworowej. Niniejsza praca dotyczy izolacji i oczyszczenia enzymu odpowiedzialnego za naznaczanie i inicjowanie degradacji białek – ubikwityny oraz poszukiwania i badania aktywności związków inhibitujących proces deubikwitynacji. Przeprowadzono ekspresję rekombinowanej ubikwityny w szczepie Escherichia coli, wyizolowano uzyskane białko z komórek bakteryjnych, a następnie oczyszczono stosując chromatografię metalopowinowactwa i sączenie molekularne. Zbadano cztery związki będące potencjalnymi inhibitorami enzymu USP2, wykonując pomiary kinetyczne reakcji enzymatycznej w obecności tych związków. W tym celu wykorzystano jedną z metod high-throughput screening – Ub-AMC hydrolysis assay, stosując w kontroli pozytywnej otrzymanego mutanta ubikwityny. Zidentyfikowano związek będący potencjalnym ligandem białka USP2.

The equilibrium of proteins concentration in eukaryotic cells is mainly established by the ubiquitination proteasome pathway. Damaged or redundant proteins are labeled by attaching ubiquitin molecule and then recognized and degraded via the protesome. Ezymes that catalyze the breaking bond between ubiquitin and protein substrate are called deubiquitinating enzymes (DUBs). Overexpression of these proteins has been observed in various types of tumor cells. The higher activity of DUBs is a reason of accumulation of incorrect proteins in cell. Therefore, it is needed to identify compounds which are able to inhibit deubiquitinating enzymes in order to invent the effective anticancer therapy. This BSc Thesis concerns the isolation and purification of ubiquitin and the examination of activity of deubiquitinating enzymes potential inhibitors. Recombinant ubiquitin was expressed in Escherichia coli strain, isolated from bacterial cells and purified through immobilized metal ion affinity chromatography and gel – filtration chromatography. Kinetic measurements of enzymatic reaction in presence of four potential USP2 inhibitors were conducted. For this purpose, one of high-throughput screening methods – Ub-AMC hydrolysis assay was performed with just-purified recombinant ubiquitin used as positive control. One of testing compounds was identified as potential USP2 ligand.