Activity of the enzymes involved in NO signalling in endothelial senescent cells

Starzenie się komórek to proces nieodwracalny. Charakteryzuje się trwałym zatrzymaniem cyklu komórkowego, uszkodzeniem makromolekuł (tłuszczy, białek, DNA), osłabioną apoptozą, zmienionym metabolizmem i morfologią komórek, utratą potencjału proliferacyjnego (PP) z jednoczesnym utrzymaniem aktywności metabolicznej. Postęp technologiczny i społeczny, który następuje w ostatnich latach powoduje coraz dłuższe życie ludzi. Przyczynia się to do większego prawdopodobieństwa występowania i rozwoju chorób związanych ze starzeniem.Podczas wykonywania niniejszej pracy skupiono się na poznaniu sygnalizacji komórkowej w śródbłonkowych komórkach senescentnych. Przeprowadzono oznaczanie ilości białek biorących udział w procesach redoksowych. Dodatkowo komórki traktowano ekstraktem zanieczyszczeń powietrza SRM1648a w celu poznania różnic w odpowiedzi komórek na stresory środowiskowe. Wybrane białka, biorące udział w sygnalizacji komórkowej, oznaczano metodą Western Blot z użyciem odpowiednich przeciwciał. Do badanych białek należały: dysmutaza ponadtlenkowa 1, oksydaza ksantynowa, śródbłonkowa i indukowana syntaza tlenku azotu, tioredoksyna 1, dehydrogenaza alkoholowa 5/reduktaza S-nitrozoglutationu, oksydaza NADPH 2 i 4, cząsteczka adhezyjna komórek naczyniowych 1.Przygotowano komórki senescentne używając procedury przedwczesnego starzenia się indukowanym stresem SIPS, narażając komórki na działanie subcytotoksycznego stężenia wody utlenionej. Z przygotowanych próbek uzyskano lizaty komórkowe oraz oznaczono ilość białka w otrzymanych lizatach metodą Bradforda. Białkiem referencyjnym w używanych oznaczeniach była β-aktyna.Uzyskane wyniki świadczą o zaburzeniu sygnalizacji redoksowej w komórkach starzejących się. W takich komórkach zanotowano mniejszą ilość białek antyoksydacyjnych tioredoksyny 1 i dysmutazy ponadtlenkowej, a zwiększoną ilość białek produkujących wolne rodniki (oksydazy NADPH 4). Dodatek ekstraktu zanieczyszczeń powietrza dodatkowo potęguje zachodzące zmiany. Zastanawiające są natomiast wyniki uzyskane dla śródbłonkowej syntazy tlenku azotu. W komórkach senescentnych zaobserwowano jej zwiększoną ilość, co się sprzeczne z dotychczasowymi przesłankami literaturowymi i wymaga dalszego badania. Nie uzyskano zadowalających wyników dla pozostałych oznaczanych białek. Dalsze badania, polegające na ocenie nie tylko ilości, ale również aktywności badanych białek są konieczne w celu lepszego poznania sygnalizacji komórkowej w śródbłonkowych komórkach senescentnych.

Cellular aging is an irreversible process. It is characterized by permanent cell cycle arrest, macromolecules damage (lipids, proteins, DNA), decreased susceptibility to apoptosis, changes in metabolism and morphology, and loss of proliferative potential while maintaining cells’ metabolic activity. In recent years, technological and social progress is causing people to live longer. It contributes to a higher possibility of occurring and developing age-related diseases.The focus of this work was on understanding cell signaling in endothelial senescent cells. The amount of proteins involved in redox processes was determined. Additionally, the cells were treated with the air pollutant extract SRM1648a to understand the differences in cell response to environmental stressors. Selected proteins involved in cell signaling were determined by the Western Blot method using appropriate antibodies. The following proteins were studied: superoxide dismutase 1, xanthine oxidase, endothelial and inducible nitric oxide synthase, thioredoxin 1, alcohol dehydrogenase 5/S-nitrosoglutathione reductase, NADPH oxidase 2 and 4, vascular cell adhesion molecule 1.Senescent cells were prepared using the stress-induced premature senescence SIPS procedure, exposing the cells to subcytotoxic hydrogen peroxide concentrations. From the prepared samples, cell lysates were obtained, and the total amount of protein in the obtained lysates was determined by the Bradford method. β-actin was used as the reference protein.The obtained results indicate a disbalance of redox signaling in senescent cells. In such cells, a lower amount of antioxidant proteins thioredoxin 1 and superoxide dismutase was noted, and an increased amount of proteins produced free radicals (NADPH oxidase 4). The addition of air pollutant extract further amplifies the observed changes. However, the results obtained for endothelial nitric oxide synthase are puzzling. An increased amount of this protein was observed in senescent cells, which is inconsistent with the existing literature data and requires further study. Satisfactory results were not obtained for the other studied proteins. Further studies to assess not only the amount but also the activity of the proteins studied are necessary to better understand cell signaling in senescent endothelial cells.