Analysis of saponin fraction from Lysimachia clethroides

This study is a continuation of research conducted on different species of genus Lysimachia at the Department of Pharmacognosy, Faculty of Pharmacy, Jagiellonian University and deals with a species Lysimachia clethroides Duby (gooseneck loosestrife). This plant species has previously been examined phytochemically, but the structures of saponins are still not known. In 1972, Kitagawa et al examined the sapogenols (aglycones) of saponins from the roots of L.clethroides after acid hydrolysis. Therefore, the purpose of this study was to isolate saponins from saponin fractions from the underground parts of gooseneck loosestrife and elucidate their structures by spectroscopic methods, such as NMR and MS. Furthermore, based on the literature data, an attempt was made to confirm or deny the presence of aglycones previously isolated by Kitagawa et al. The material consisted of fractions obtained after separation by column chromatography (CC) of the methanolic extract from Lysimachia clethroides roots. Isolation of saponins from each fraction was carried out using various combinations of three methods: elution with n-butanol, column chromatography (CC) and preparative thin layer chromatography (PTLC). As a result, six pure triterpene saponins Lclet-1 to Lclet-6 were obtained.Preliminary analysis of saponin structures was made by measurement of melting point temperatures and qualitative analysis of sugar chain components following acid hydrolysis on a TLC plate. Moreover saponin Lclet-4 isolated in quantities sufficient to carry out spectral analysis (103 mg) was subjected to more detailed. The results of FAB MS analysis and 1H and 13C NMR revealed that the sugar chain of saponin is branched and consists of four monosaccharides. The presence of arabinose, rhamnose and two molecules of glucose was confirmed. The aglycone has the structure of β-amyrine, glycosylated by one sugar chain at C-3, the epoxy bridge in position 13,28, and 7 methyl substituents. One of the aglycone carbons have also substituted with a hydroxyl group. These results therefore confirm that the isolated saponin Lclet-4 might be a protoprimulagenin A, the aglycone isolated previously by Kitagawa et al., however full structure elucidation requires further studies by 2D NMR.

Niniejsza praca stanowi kontynuację badań prowadzonych na gatunkach rodzaju Lysimachia w Katedrze i Zakładzie Farmakognozji Wydziału Farmacji CMUJ. W pracy zajęto się gatunkiem Lysimachia clethroides Duby (tojeść orszelinowa). Roślina ta została wcześniej częściowo przebadana pod względem fitochemicznym, jednak struktura saponozydów do tej pory nie jest znana. W roku 1972 Kitagawa i wsp. dokonali analizy sapogenoli (aglikonów) po hydrolizie kwaśnej saponozydów z korzeni L. clethroides. Dlatego celem badawczym pracy była izolacja saponozydów z frakcji saponinowej korzenia tojeści orszelinowej oraz analiza struktury wyizolowanych związków metodami spektroskopowymi NMR i MS. Ponadto opierając się na danych literaturowych podjęto próbę potwierdzenia lub zaprzeczenia obecności wcześniej wyizolowanych przez Kitagawę i wsp. aglikonów. Materiał do badań stanowiły frakcje otrzymane po rozdziale metodą chromatografii kolumnowej (CC) wyciągu metanolowego z korzeni Lysimachia clethroides. Izolację saponozydów z poszczególnych frakcji przeprowadzono wykorzystując różne kombinacje trzech metod: elucji n-butanolem, chromatografii kolumnowej (CC) oraz preparatywnej chromatografii cienkowarstwowej (PTLC). W efekcie otrzymano sześć czystych saponozydów triterpenowych oznaczonych symbolami od Lclet-1 do Lclet-6 według malejącej polarności.Wstępna analiza struktury saponozydów polegała na pomiarze temperatur topnienia oraz analizie części cukrowej po hydrolizie gazowym chlorowodorem na płytce chromatograficznej. Do dalszych badań wykorzystano saponozyd Lclet-4 wyizolowany w ilości wystarczającej na przeprowadzenie analiz spektralnych (103 mg). Wyniki analiz FAB MS oraz 1H i 13C NMR pozwoliły stwierdzić, że łańcuch cukrowy saponozydu składa się z czterech jednostek monosacharydów i ma charakter rozgałęziony. Potwierdzono obecność arabinozy, ramnozy oraz dwóch cząsteczek glukozy. Aglikon posiada strukturę β-amyryny glikozylowanej jednym łańcuchem cukrowym w pozycji C-3, mostek epoksydowy w pozycji 13,28 oraz siedem wolnych grup metylowych. Jeden z węgli aglikonu posiada także podstawioną grupę hydroksylową. Wyniki te mogą więc potwierdzać, że wyizolowany saponozyd Lclet-4 jest pochodną protoprymulageniny A, czyli aglikonu wyizolowanego uprzednio przez Kitagawę i wsp., jednak wymaga to dalszych analiz spektralnych (widma 2D).