Isolation of two different subpopulations of extracellular vesicles derived from endothelial cells with different biological properties

Bibliogr. s. 95-112

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) to heterogeniczne pęcherzyki błonowe o wielkości 30-5000 nm, które transportują białka, niekodujące RNA (miRNA), lipidy i metabolity. Główne populacje obejmują egzosomy, ektosomy i ciała apoptotyczne. Moja rozprawa doktorska koncentruje się na aspektach teoretycznych oraz doświadczalnych charakterystyki właściwości fizycznych, molekularnych i biologicznych dwóch subpopulacji EV: egzosomów i ektosomów. Celem pracy doktorskiej było porównanie rozkładu wielkości EV uzyskanych w różnych warunkach wirowania różnicowego, w tym ultrawirowania z wynikami opracowanymi na podstawie modelu teoretycznego. W oparciu o te wyniki wybrano najbardziej odpowiednie parametry do izolacji EV (dla ektosomów 18.000xg i 150.000xg dla egzosomów) i zbadano właściwości molekularne i biologiczne izolowanych EV. Badania biologiczne zostały przeprowadzone na dwóch unieśmiertelnionych liniach komórek śródbłonka (TIME i HUVEC) w modelu cukrzycy in vitro (25mM D-glukozy) oraz w warunkach prawidłowych (5mM D-glukozy). Jako kontrolę osmomolarną zastosowano 5mM L-glukozę, której komórki nie metabolizują. Do charakterystyki właściwości fizycznych posłużono się metodami fizycznymi: transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM), dostrajana konduktometria pulsowa (TRPS) oraz mikroskopia konfokalna i fluorescencyjna. Metodami molekularnymi były ilościowa reakcja łańcuchowej polimerazy (qPCR) i metoda Western blot, do metod biologicznych zaliczały się test krzepnięcia i cytometria przepływowa. Uzyskane wyniki wskazują na to, że EV izolowane opracowaną w pracy doktorskiej metodą wirowania różnicowego z komórek śródbłonka wykazują różne właściwości biologiczne (fibrynolityczne), co sugeruje ich potencjalną rolę w powikłaniach cukrzycowych, tj. retinopatii. Właściwości te mają związek ze ścieżką sygnalizacyjną Wnt w komórkach, przez co udowodniłam że EV odgrywają ważną rolę w procesach komunikacji międzykomórkowej.

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous 30-5000 nm membrane vesicles that transport proteins, non-coding RNAs (miRNAs), lipids and metabolites. Major populations include exosomes, ectosomes and apoptotic bodies. My doctoral dissertation focuses on theoretical and experimental aspects of the physical, molecular and biological characteristics of two EV subpopulations: exosomes and ectosomes. The aim of my PhD dissertation was to compare the distribution of EVs obtained under different conditions of differential centrifugation, including ultracentrifugation, with the results developed on the basis of a theoretical model. Based on these results, the most appropriate parameters for EV isolation (for ectosomes 18.000xg and 150.000xg for exosomes) were selected and molecular and biological properties of isolated EVs were examined. Biological studies were performed on two immortalized endothelial cell lines (TIME and HUVEC) in a model of diabetes in vitro (25mM D-glucose) and normal conditions (5mM D-glucose). As osmomolar control, not metabolized by cells L-glucose in concentration of 5mM was used. The following physical methods were used to characterize the physical properties: Transmission Electron Microscopy (TEM), Tuneable Resistive Pulse Sensing (TRPS) as well as confocal and fluorescence microscopy. Molecular methods included quantitative polymerase chain reaction (qPCR) and the western blot method, biological methods included coagulation test and flow cytometry. The obtained results indicate that EVs isolated by differential centrifugation from endothelial cells exhibit varied biological (fibrinolytic) properties, suggesting their potential role in diabetic complications, i.e. retinopathies. It is likely that such properties are related with the Wnt signaling pathway and play an important role in biological processes and cell-to-cell communication.