Structural studies of prokaryotic glycoside hydrolase from GH30 and GH35 family

Lizosomalne choroby spichrzeniowe, spowodowane są defektem enzymów lizosomalnych, np. kwaśnej β glukocerebrozydazy (GH30) w chorobie Gauchera oraz β-galaktozydazy (GH35) w GM1-gangliozydozie.Jednym ze sposobów leczenia tych chorób jest terapia farmakologicznymi chaperonami (PCT). Nowe związki będące kandydatami do PCT muszą być testowane w laboratoriach. Najlepiej badać je z wykorzystaniem enzymów ludzkich, jednak ich produkcja jest zwykle kosztowna i skomplikowana.Celem pracy była optymalizacja warunków ekspresji, oczyszczania i krystalizacji, a także poznanie funkcji fizjologicznej białek prokariotycznych, które w warunkach laboratoryjnych mogą zastąpić białka ludzkie, tj: białka GH30 z Bacteroides fragilis (Bf) oraz białka GH35 z Caulobacter crescentus (Cc).Opracowane zostały warunki ekspresji, oczyszczania i krystalizacji białka Bf. Otrzymano nową formę krystaliczną Bf (I222), zawierającą trzy łańcuchy białkowe w jednostce asymetrycznej. Wyznaczone struktury wskazują na znaczne podobieństwo Bf do ludzkiej β glukocerebrozydazy, nie wykazuje ono jednak aktywności enzymatycznej względem typowych substratów. Podjęte próby optymalizacji ekspresji oraz oczyszczania wykazały, że nie możliwa jest produkcja białka Cc w bakteriach E.coli, co dyskwalifikuje je jako laboratoryjny model ludzkiego enzymu.

Lysosomal storage diseases are caused by a defect of the lysosomal enzymes. e.g β-glucocerebrosidase (GH30) in Gaucher disease and β-galactosidase (GH35) in GM1-gangliosidosis. The pharmacological chaperone therapy (PCT) can be used in the treatment of such diseases. New compounds that are candidates for the PCT need to be tested in laboratories. The tests should be performed with the use of human enzymes, however, their production is usually expensive and complicated.The aim of this study was to optimize conditions of the expression, purification and crystallization conditions and searching for the biological function of GH30 protein from Bacteroides fragilis (Bf) and GH35 protein from Caulobacter crescentus (Cc). These proteins in laboratory could replace human enzymes. Expression, purification and crystallization conditions of Bf protein have been optimized. A new crystalline form of Bf (I222), containing three protein chains in the asymmetric unit, has been obtained. The determined structure confirmed that Bf protein has significant similarity to the human β-glucocerebrosidase but does not exhibit enzymatic activity for typical glucosidase substrates. Attempts to optimize expression and purification of Cc were unsuccessful and showed it is impossible to produce Cc protein in the E. coli, and such observation eliminates it as a laboratory model of the human enzyme.