Investigation of vaspin effect on progesterone secretion and proliferation of human placenta cells

Waspina (serpina A12) to białko należące do rodziny serpin (inhibitorów proteaz serynowych), którego wysoką ekspresję udokumentowano w otrzewnowej tkance tłuszczowej szczurzego modelu otyłości z cukrzycą typu II – w szczurach OLETF (Otsuka Long-Evans Tokushima fatty rats). Charakteryzuje się działaniem uwrażliwiającym na insulinę, przeciwmiażdżycowym oraz antyzapalnym. Waspina oddziałuje na komórki, łącząc się z błonowym receptorem GRP-78. Ekspresja waspiny opisana została w ludzkim łożysku, lecz dotychczas nie poznano jej roli w fizjologii tego narządu. Celem tego badania było określenie dawko- i czasozależnego wpływu waspiny na sekrecję progesteronu i proliferację komórek ludzkiego trofoblastu. Jako model badawczy wykorzystano hodowle komórkowe linii BeWo i JEG-3, które reprezentują odpowiednio cytotrofoblast kosmkowy zdolny do syncytializacji pod wpływem forskoliny oraz cytotrofoblast pozakosmkowy. Komórki BeWo i JEG-3 hodowano na płytkach 96-dołkowych w koncentracji 4000 komórek/dołek z dodatkiem waspiny w stężeniach 0,01; 0,1; 1; 10 oraz 100 ng/ml przez 24, 48 i 72 h. Poziom proliferacji w liniach JEG-3 i BeWo oznaczony został za pomocą testu AlamarBlue, a sekrecję progesteronu w linii BeWo zmierzono, wykonując test immunoenzymatyczny ELISA. Otrzymane wyniki poddano dwuczynnikowej analizie wariancji oraz testowi porównań wielokrotnych Dunnett’a. Analiza statystyczna wykazała, że waspina stymuluje proliferację komórek linii BeWo po 24 h w dawce 10 ng/ml oraz po 48 h w dawkach 0,01; 0,1 i 10 ng/ml. Istotny statystycznie wzrost proliferacji pod wpływem waspiny w linii JEG-3 zanotowano po 24 h w dawce 10 ng/ml. Waspina miała stymulujący wpływ na sekrecję progesteronu w linii BeWo w dawce 1 ng/ml po 72 h inkubacji. Udowodniono mitogenny efekt działania waspiny na komórkach ludzkiego trofoblastu. Waspina, pozytywnie regulując proliferację BeWo i JEG-3, może być nowym czynnikiem regulującym wzrost i rozwój ludzkiego łożyska. Wpływ waspiny na sekrecję progesteronu przez komórki BeWo nie jest tak jednoznaczny, lecz zdaje się, że waspina wzmaga steroidogenezę w komórkach trofoblastu, regulując funkcję endokrynną łożyska. Badania te wymagają poznania molekularnego mechanizmu działania waspiny w łożysku oraz potwierdzenia w bardziej skomplikowanych modelach badawczych.

Vaspin (serpin A12) is a protein that belongs to the serpin (serine protease inhibitor) family. It is highly expressed in the visceral adipose tissue of OLETF rats (Otsuka Long-Evans Tokushima fatty rats) - a rat model of obesity with type 2 diabetes. Vaspin is known by its insulin-sensitizing, anti-atherogenic, and anti-inflammatory effects. The action of vaspin is exerted by binding to the membrane receptor GRP-78. The expression of this protein has been described in the human placenta but its role in the physiology of the organ has not been known yet. The aim of this study was to determine the dose- and time-dependent effects of vaspin on progesterone secretion and proliferation in human trophoblastic cells. BeWo and JEG-3 cell lines were used as a trophoblast model. They represent the villous and an extravillous cytotrophoblast, respectively. BeWo cells are capable of fusing into syncytium after the treatment with forskolin and then represent syncytiotrophoblast. BeWo and JEG-3 cells were cultured on 96-well plates (4×103 cells per well) with increasing concentrations of vaspin (0.01; 0.1; 1; 10 and 100 ng/ml) for 24, 48 and 72 h. Cell proliferation of JEG-3 and BeWo was measured by the AlamarBlue test and the progesterone secretion by BeWo cells was detected using the Enzyme-linked Immunosorbent Assay. The statistical analysis was performed using the two-way analysis of variance and Dunnett’s test. It was demonstrated that vaspin in dose 10 ng/ml stimulated proliferation of BeWo cells after 24 h. After 48 h stimulation in doses 0.01; 0.1 and 10 ng/ml vaspin increased BeWo cells proliferation. A statistically significant increase in vaspin-induced proliferation of JEG-3 cells was detected after 24 h in cells treated with 10 ng/ml of vaspin. Vaspin had a stimulating effect on the progesterone secretion at dose 1 ng/ml after 72 h of incubation. The mitogenic effect of vaspin on human trophoblast cells was determined. Vaspin positively regulated the proliferation of BeWo and JEG-3 and may be a new factor that regulates the growth and development of human placenta. The influence of vaspin on the secretion of progesterone by BeWo cells is not unambiguous but it seems that vaspin enhanced steroidogenesis in trophoblast cells and thus regulated endocrine function of the placenta. These studies require knowledge of the molecular mechanism of vaspin action in the placenta and confirmation in more complex research models.